Электрофизиологическая запись из Drosophila Trichoid Sensilla в ответ на одоранты низкой летучести

Drosophila ORN реагируют на огромное количество одорантов с широким диапазоном длин углеродных цепей и различными функциональными группами, включая сложные эфиры, спирты, кетоны, лактоны, альдегиды, терпены, органические кислоты, амины, соединения серы, гетероциклики и ароматические соединения ^{2 , 3} . Одоранты, различающиеся по своим физико-химическим свойствам, могут иметь заметно различную летучесть, определяемую давлением паров соединения. Примечательно, что биологически значимые одоранты для Drosophila melanogaster сильно отличаются от их летучести. Например, Ir92a ORN реагируют на аммиак ⁴ , который очень летучий, с давлением паров 6432 мм рт.ст. при 20 ° C. Напротив, OR67d ORN реагируют на мужской феромон, цис- ваккенилацетат ( c VA) ^{5 , 6} , давление паров которого составляет 43 мм рт. Ст. При 20 ° C.

Ove_content "> Изучение обонятельной реакции на одоранты с низкой летучестью особенно бросает вызов обычным способам доставки запаха, при которых одоранты доставляются через воздушный поток носителя на относительно большом расстоянии ( то есть в несколько сантиметров). Таким образом, сообщаемые обонятельные реакции К данному одоранту с низкой летучестью может сильно варьироваться в зависимости от конструкции системы доставки запаха. Например, сообщаемая реакция OR OR OR с высокой дозой c VA варьируется от ~ 40 ⁷ -> 200 пиков / с ⁶ Более того, неэффективная доставка c VA с обычными методами доставки, вероятно, связана с ложноотрицательными результатами, что приводит к интерпретации того, что c VA сам по себе недостаточно для активации OR OR ^{8 8.} Эта интерпретация была позже опробована другим исследованием, используя Близкий метод доставки запаха ^9. ПоэтомуЧтобы разработать надежную систему доставки запаха для эффективного представления одорантов низкой волатильности.

Недавно мы идентифицировали несколько длинноцепочечных кутикулярных жирных кислот в качестве лигандов для ORN OR47b. Они размещены в типе 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Среди оловян с длинноцепочечными жирными кислотами мы обнаружили, что пальмитолеиновая кислота функционирует как афродизиакский феромон, который способствует ухаживанию мужчин, активируя OR OR 1b ¹ . Однако в другом исследовании, использующем традиционный способ доставки запаха, было показано, что метилмаурат вызывает реакции ORN ORsb, в то время как пальмитолеиновая кислота не вызывала реакции при представлении с того же расстояния ¹⁰ . По сравнению с c VA жирные кислоты с длинной цепью еще менее летучие, при давлении паров менее 0,001 мм рт.ст. при 25 ° C ¹¹ . По своей природе низкая летучесть одинарных жирных кислот с длинной цепью, что препятствует эффективному представлению антенны черезОбычные системы доставки запаха, вероятно, учитывали ложноотрицательные результаты ¹⁰ . Эта несогласованность подчеркивает неадекватность традиционных систем доставки запаха при представлении одорантов с низкой летучестью. Ранее было показано, что эффективная подача кутикулярных запахов мух требует непосредственной близости между источником запаха и целевой тканью ⁶ . Таким образом, чтобы полностью охарактеризовать влияние биологически активных феромонов, одновременно имитируя расстояние, с которым они, вероятно, встречаются плодными мухами в природе ^{12 , 13} , мы согласились с тем, что минимальная дистанция должна быть в приоритетном порядке нашей процедурой.

Наш метод обладает дополнительными преимуществами, включая совместимость со стандартными электрофизиологическими установками и методами. Предварительно существующие установки буровых установок требуют минимальной модификации для соответствия этому протоколу, и большинство шагов SSR требуют лишь незначительных корректировок. ЭтаДелает нашу технику доступной для исследователей, имеющих опыт работы в ССР. Кроме того, наша методика позволяет представить низкоотражающие одоранты с острым началом и смещением, коррелируя доставку стимула с нейронным ответом. Наконец, аппаратная компоновка облегчает быстрый обмен между картриджами одорантов, ускоряет сбор данных в желаемом диапазоне дозировок.

Мы начнем с рассмотрения подготовки эталонных и регистрирующих электродов, раствора для взрослых Hemolymph-Like (AHL), картриджей для доставки одорантов и соответствующего ольфактометра. Затем мы обсудим приготовление растворов одорантов пальмитолеиновой кислоты с последующим приготовлением мухи для записи. Мы переходим к рассмотрению критериев выбора трихоидного сенсилума для записи и более тщательного изучения положения патрона одоранта перед представлением репрезентативных данных, полученных с использованием этого метода. Наконец, мы заключаем, исследуя полезные применения этого методаUe, некоторые возникающие проблемы и их решения.

1. Подготовка аппаратного обеспечения для записи at4

1. Используйте инструмент для снятия пипетки, чтобы подготовить электроды с капиллярами из алюмосиликатного стекла (OD 1,0 мм, ID 0,64 мм). Немного закруглите наконечник контрольного электрода с помощью пары тонких пинцетов, чтобы облегчить вставку в клипеус мухи ( то есть закругленную пластину на передней части головки мухи, выше ротовой части).
   ПРИМЕЧАНИЕ. В этом исследовании использовались 7-дневные мужчины WT (Берлин). Используйте солевой раствор AHL ¹⁴ в качестве электролита для обоих электродов.
2. Подготовить 1 л АГЛ путем смешивания 900 мл дистиллированной воды с 6,312 г NaCl, 0,373 г KCl, 0,377 г NaHCO ₃ , 0,1120 г NaH ₂ PO ₄ , 1,892 г трегалозы ּ 2 H ₂ O, 3,423 г сахарозы, 1,192 г HEPES и 8,2 мл 1 М MgCl ₂ . Используя дистиллированную воду, доведите общий объем до 1 л. Доведите pH до 7,4, используя 1 н. NaOH, и стерилизуйте раствор с помощьюВакуумная система фильтрации. Для длительного хранения держите аликвоты AHL при температуре 4 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательные поставки пальмитолеиновой кислоты зависят от однородности между картриджами. Очень важно, чтобы каждый картридж собирался воспроизводимым образом.
3. Используя лезвие бритвы, удалите 0,9 см от кончика наконечника пипетки 200 мкл, чтобы создать первую секцию картриджа, размером 4,1 см; См. Размеры, указанные на рисунке 1A . Используйте еще 200 мкл наконечника пипетки и снимите 1,7 см и 1,5 см от наконечника и основания соответственно, чтобы создать вторую секцию картриджа, размером 1,8 см ( рисунок 1А ). Используйте линейку для обеспечения воспроизводимости.
4. Используйте «дырокол» для вырезания дисков из фильтровальной бумаги.
5. Используйте щипцы, чтобы поместить диск с фильтровальной бумагой на кончик второй секции картриджа. Визуально убедитесь, что в кончике картриджа имеется отверстие, через которое проходит воздух.
6. Прикрепите первую и вторую секции картриджа вместе, как показано на рисунке 1A . Поверните вторую секцию картриджа вниз, чтобы облегчить квадратное нацеливание на приготовление ( рис. 1B ).
7. Подключите картридж с трубкой для подачи запаха, которая установлена ​​на микроманипуляторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Эта конструкция позволяет поворачивать картридж наружу, чтобы облегчить обмен ( рисунок 1С ).
8. Установите постоянный увлажненный воздушный поток до 2 л / мин в одном массовом контроллере и поток одоранта до 500 мл / мин в другом контроллере массы.
9. Используя программное обеспечение (см. Таблицу материалов ), запрограммируйте процедуру администрирования затухания запаха на 500 мкс.

2. Приготовление растворов одорантов пальмитолеиновой кислоты для доставки

Примечание: Or47b ORNs реагировать как цис - и транс -palmitoleic кислоты. Поскольку пальмитолеиновая кислота неустойчива при RT, запасы хранятся при -20 ° C и используются в течение месяца после вскрытия. Этанол является растворителем, выбранным для пальмитолеиновой кислоты.

1. С помощью вихревой мешалки , чтобы тщательно перемешать 10 мкл цис- или транс- запасы пальмитолеиновая кислоты или разведений с 90 мкл 100% -ного этанола в течение десяти-кратных серийных разведений в 1,7 мл микропробирки. Подготовить свежие разведения пальмитолеиновой кислоты ежедневно до экспериментов и использовать в течение дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для одорантов, которые не растворяются в этаноле, стеклянный флакон рекомендуется для приготовления растворов для разведения запахов другими органическими растворителями.
2. Используя микропипетку P10, нанесите 5 мкл растворов цис- палмитолеиновой кислоты желаемых разведений на фильтровальную бумагу в каждом соответствующем картридже.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Наибольшая доза (10 ^-1 ) содержит 450 мкг соединения. Для получения транс - решений -palmitoleic кислоты, применяют 4,5 мкл вместо того, чтобы таким образом , чтобы самая высокая дозировка (10 ^-1) также содержит 450 мкг тОн сложный.
3. Чтобы полностью испарить растворитель, поместите палитры пальмитолеиновой кислоты в вакуумный эксикатор в течение 1 часа при RT и 7,59 мм рт.ст. давления.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Картриджи можно использовать до 4 часов при комнатной температуре.

3. Подготовка дрозофилы к готовому доступу к электрофизиологическим записям at4 Sensilla для in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ. Муфты WT (Берлин) выращивают в стандартной среде кукурузной муки при 25 ° C в 12:12 темно-темном цикле. После эклезии мухи разделяются сексом по группам из десяти человек, в результате чего их группируют до 7 дней. OR47b ORN у мужских и женских мух реагируют на пальмитолеиновую кислоту. Для простоты в настоящем исследовании исследуются только мужские мухи.

1. Соберите горшок для подготовки мух: на стеклянном слайде поместите покровное стекло (18 x 18 мм ² ) на небольшое количество моделирующей глины, образуя угол 3 ° со стеклянным слайдом. Поместите двустороннюю ленту на внутренний eDge покровного стекла и на области слайда сразу ниже. Заменяйте свежей лентой на каждый день записи ( рисунок 2A ).
2. Используйте аспиратор для мух ^15, чтобы собрать муху интереса к насосно-компрессорной трубе, а затем нанести кончик пипетки 200 мкл на конец трубки. Одновременно прокрутите трубку вперед, вдувая воздух в трубку, чтобы проталкивать муху до конца наконечника пипетки. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать чуть ниже тела мухи и длины двух головок над мухой.
3. Наденьте нижнюю часть наконечника пипетки с помощью моделирующей глины, подталкивая муху вверх, пока не откроются обе антенны и клипеус ( рисунок 2B ). Чтобы избежать убийства мухи, добавьте достаточно глины, чтобы разоблачить антенны и aristae, так как это предотвращает измельчение живота мухи. Кроме того, добавьте глину медленно и осторожно, чтобы предотвратить внезапное сужение. Подтвердите, что муха жива, проверяя антеннуИли хоботом.
4. Используйте щипцы для маневра наконечника пипеток, в котором находится муха. Расположите голову так, чтобы клипеус оказался справа от наблюдателя. Отрегулируйте приготовление по покровному слою с помощью тонких щипцов до тех пор, пока боковая сторона антенны не будет прикреплена к покрытой пленкой поверхности покровного стекла ( рисунок 2B ).
5. Поместите удерживающий стержень на ариста, чтобы зафиксировать антенну на двусторонней ленте, чтобы предотвратить движение ( рисунок 2B ).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Удерживающий стержень вытягивается из капилляра боросиликатного стекла с помощью съемника пипетки и удерживается на месте с помощью моделирующей глины ( рис. 2А ).
6. Поместите подготовительный этап на сцене буровой установки ( рис. 2C ). Используя микроскоп, убедитесь, что трихоиды видны вдоль дистально-бокового края третьего сегмента антенны.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В идеале, сенсилла должна быть четко прорисована на фоне, что упрощает их Идентификации и облегчает запись ( рисунок 3 ). В этом препарате большинство доступных трихоидных сенсилл относятся к типу at4.
7. Держите приготовку под постоянным увлажненным воздушным потоком (2 л / мин), подаваемым через отдельную воздухоподающую трубку на расстоянии примерно 2 см от пресета ( рис. 4 ), как описано ранее ^{2 , 15} .

4. Запись активности at4 Sensillum из ORN OR47b в at4 трихоидах в ответ на пальмитолеиновую кислоту

1. Вставьте контрольный электрод в клипеус ( рис. 3А ). Чтобы избежать повреждения ткани, убедитесь, что электрод вставлен чуть ниже поверхности, где он может соприкасаться с гемолимфой под кутикулой с быстрым и плавным движением.
2. Медленно опускайте регистрирующий электрод, пока он не входит в ту же плоскость зрения, что и целевая чувствительность (= "Xfig"> Рисунок 3B). Запись под объективом 50X.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Трудная трихоидальная кутикула требует вставки регистрирующего электрода в сенсиллярное основание, более широкая область которого обеспечивает большую цель, которая уменьшает вероятность отклонения электрода ( рис. 3В , вставка).
3. Перед применением стимуляторов запаха к сенсиллу соблюдайте следующие критерии отбора; Любой трихоид, не отвечающий этим стандартам, должен быть отвергнут, а вместо него выбран другой сенсилл.
   1. Наблюдайте высокое отношение сигнал / шум (см. Рисунок 3C для примера).
   2. Соблюдайте идентифицируемые пики от at4A и at4C нейронов ( рис. 3C ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Следует отметить, что амплитуда амплитуды at4B очень похожа на at4A ¹⁰ и не может быть легко идентифицирована без стимуляции запаха.
   3. Обратите внимание, что базальная скорость горения нейронов at4AОколо 20 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот критерий специфичен для at4A, потому что базовая скорость горения для нейрона выше, чем базазиновые ORN ² . Значительно более высокий базальный выстрел указывает на то, что нейроны могли быть повреждены во время введения электрода.
4. Подключите картридж к трубке для подачи одоранта. Начните с контроля растворителя, а затем с одорантами, от низкой до высокой концентрации. Используйте микроманипулятор для маневра картриджа в направлении подготовки, одновременно направляя картридж в головку подготовительной машины. Визуально убедитесь, что картридж направлен непосредственно на антенну ( рис. 4 ) на расстоянии нескольких миллиметров.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Цель состоит в том, чтобы сориентировать открытие картриджа непосредственно на антенне и расположить его в непосредственной близости от ткани-мишени.
5. Убедитесь, что патрон одоранта отделен от регистрирующего электрода справа на 1 - 2 мм и от предвзятостиP сдвиньте ниже примерно на 1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В описанной здесь установке картридж одоранта плотно прилегает к регистрирующему электроду, эталонному электроду и ползуну для подготовки к лету ( рис. 4 ).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Обратите внимание на расстояние между картриджем и электродами записи / задания. Рекомендуется расстояние около 4 мм. ¹ . Непреднамеренный контакт может прерывать сигнал и разрушать наконечник регистрирующего электрода, повреждая текущий нейрон и усложнять дальнейшие записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Учитывайте расстояние, разделяющее картридж и скользящее изображение. Прикосновение к покровному стеклу также может вытеснить регистрирующий электрод, чтобы нарушить запись.
6. Нажмите «Запись» в программе сбора данных, чтобы начать запись.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для каждой записи 10 секунд один импульс запаха на 500 мкс подается непосредственно на антенну, как описано в шаге 1.9.
7. После применения одоранта,Осторожно втяните картридж, прежде чем заменять его картриджем с наивысшей концентрацией. Продолжайте до тех пор, пока не будет получен весь диапазон доз.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется, чтобы с каждого муха регистрировался только один OR47b OR47, чтобы избежать возможных эффектов адаптации.
8. Тщательно промыть регистрирующий электрод дистиллированной водой после завершения записи в течение дня.
9. Проанализируйте и распечатайте данные с помощью коммерчески доступного автономного программного обеспечения для анализа.

Наша методика была успешно применена для определения относительной эффективности транс- ( рис. 5А ) и цис ( рис. 5В ) изомеров пальмитолеиновой кислоты. Наш представитель данные показывают , что транс - -palmitoleic кислота представляет собой более эффективный лиганд для Or47b ORNs по сравнению с цис - изоформы (рис 5C). Один нейрон регистрировался с каждой мухи, причем двенадцать мух регистрировались на одну дозу, в общей сложности 24 мухи. Коллективные данные были получены из трех независимых повторений экспериментов, в которых записано 8 мух. Таблицы ошибок представляют собой sem

Следует отметить, что расстояние между отверстием патрона запаха и головкой мухи существенно влияет на результат записи. Чтобы получить значительный ответ на pАлмитолеиновой кислоты в ORN OR OR, мы представили одорант с близкого расстояния, примерно на расстоянии 4 мм от антенны 1 ( рисунок 6A ). Когда пальмитолеиновую кислоту подают дальше от антенны (~ 11 мм), мы вряд ли наблюдаем какой-либо значительный отклик от тех же OR ORbb OR47b ( рис. 6B ). Эти результаты подчеркивают важность краткосрочного представления пальмитолеиновой кислоты ( рис. 6C- D ). Данные были собраны из параллельных экспериментов из 6 мужских мух (Берлин, 7-й старый). Был зарегистрирован одиночный OR47b OR47b / fly. Таблицы ошибок представляют собой sem

Рисунок 1: Настройка картриджа и Olfactometer. ( A ) Подготовка патронов запаха. Слева направо: стандартный 200 мклНаконечник пипетки, первую и вторую секции картриджей и завершенный картридж одоранта. ( B ) Картридж, подключенный к ольфактометру, показывающий угол наклона второй секции вниз. ( C ) Установка ольфактометра с изображением трубки для подачи запаха, установленной на микроманипулятор, с прикрепленным картриджем одоранта. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Подготовка дрозофилы . ( A ) Полная подготовка, показывающая относительные положения мухи, покровного стекла и удерживающего стержня. ( B ) Крупный план подготовки, показывающий позиционирование мухи, ее усиковую ориентацию и ее клипеус. Удерживающий стержень расположен над аристой,Закрепляя третий антенный сегмент на двухсторонней ленте. ( C ) Настройка буровых установок. Все основные компоненты аннотированы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Идентификация сензилла at4 для SSR. ( A ) 4X вид препарирования, показывающий ссылочный электрод, вставленный в клипеус, удерживающий стержень поверх аристы и регистрирующий электрод, расположенный вблизи третьего членика усика. ( B ) 50X вид электрода, установленный для вставки в трихоид at4. Вставка: иллюстрация положения записывающего электрода. ( C ) Типичные SSR-следы активности базового спайка, демонстрирующие хороший (верхний) или плохой (нижний) сигнал-к-шумЕ. Хорошее отношение сигнал / шум позволяет надежно идентифицировать шипы at4A и at4C. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Размещение картриджа. ( A ) Патрон одоранта нацелен прямо на голову мухи с расстояния нескольких мм. ( B ) Другой вид препарата и ольфактометра под другим углом. ( C ) Крупный план префикса и ольфактометра, показывающий положение патрона одоранта над пламенем для подготовки к лету. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Типичные трассы и дозировка Кривые Or47b ORNs в ответ на цис или транс - -palmitoleic кислота. ( AB ) SSR из ORN at4A, которые экспрессируют рецептор Or47b транс- ( A ) или цис- палмитолеиновой кислотой ( B ). Записи были выполнены с 7-дневными мужчинами WT Berlin. Под трассами пробы (n = 12) показаны соответствующие растровые пики (средние) и гистограмма времени пери-стимула (нижняя, с булавкой при 50 мс). Кривые (С) доза-ответ , сравнивающие шип ответов Or47b Orn в цис или транс - -palmitoleic кислоты. Среднее значение ± sem (* p <0,05; ** p <0,01, t- тест). Ctrl: отрицательный контроль без пальмитолеиновой кислоты. Нажмите здесьДля просмотра увеличенной версии этого рисунка.

Рисунок 6: Активация at4A пальмитолеиновой кислотой требует близкой стимуляции. ( AB ) SSR от ORN at4A у 7-летних диких типов берлинских самцов. Цис- кальцитолевая кислота была доставлена ​​в близком диапазоне (~ 4 мм) или дальше (~ 11 мм) (n = 6). ( C ) Сравнение соответствующих ответов спайка (биннал при 50 мс, сглаженные гистограммы времени перистимула). ( D ) Сравнение соответствующих средних пиковых ответов. Ответы at4A на пальмитолеиновую кислоту заметно снижаются по мере увеличения расстояния стимула. Перепечатано с разрешения на рисунке S4 в ссылке 1 . Нажмите здесь, чтобы посмотретьБолее крупная версия этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.