Method Article

Растворимость гидрофобные соединений в водном растворе, с использованием комбинаций самостоятельной сборки пептиды и аминокислоты

DOI:

10.3791/56158

⸱

September 20th, 2017

 ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, University Health Network, 2Department of Pediatrics, British Columbia Children's Hospital & University of British Columbia, 3Institute of Medical Science, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает клинически применимые средства растворения гидрофобные соединений в водной среде, с использованием комбинаций самостоятельной сборки решения пептиды и аминокислоты. Наш метод устраняет ограничение основных гидрофобные терапии, которой не хватает безопасных, эффективных средств методов растворимости и доставки в клинических условиях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самостоятельной сборки пептидов (ПСП), перспективных транспортных средств для доставки гидрофобные терапии для клинического применения; их свойства амфифильными позволяют им растворить гидрофобные соединений в водной среде человеческого тела. Однако, самостоятельной сборки пептид решения имеют плохой крови совместимости (например, низкой осмолярности), препятствуя их клинического применения посредством внутривенного администраций. Мы недавно разработали обобщенное платформу для доставки гидрофобный препарат, который сочетает в себе ПСП с решениями аминокислоты (SAP-AA) для повышения растворимости наркотиков и повышения осмолярности формулировки для достижения требований для клинического использования. Эта формулировка стратегия была тщательно протестирована в ходе трех структурно отличается гидрофобными соединений – РР2, rottlerin и куркумин – для того, чтобы продемонстрировать его универсальность. Кроме того мы изучили эффекты изменения компонентов рецептуры, анализируя 6 различных ПСП, 20 естественно существующих аминокислот при низких и высоких концентрациях и два разных совместно растворителей диметилсульфоксида (ДМСО) и этанола. Наша стратегия оказалась эффективной оптимизации компонентов для данного гидрофобный препарат и лечебные функции сформулированы ингибитора, РР2, было отмечено, в пробирке и в естественных условиях. Эта рукопись излагаются наши обобщенной формулировки метод, с помощью комбинации SAP-AA для гидрофобных соединений и анализа растворимости в качестве первого шага на пути к возможности использования этих формулировок в более функциональных исследований. Мы включить представителя растворимость результаты для разработки гидрофобные составные, куркумин и обсудить, как наша методология служит в качестве платформы для будущих биологических исследований и модели заболеванием.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПСП являются класс биоматериалов, которые были изучены широко, как 3D леса в регенеративной медицине1,2,3,4. Совсем недавно однако, они были вовлечены в качестве транспортных средств для доставки терапии из-за их уникальных биологических свойств5,6,,78. ПСП естественно собрать в стабильной наноструктур9, обеспечивая тем самым средства инкапсуляции наркотиков и защиты. ПСП являются амфифильными, состоящая из определенный шаблон повторяется гидрофильные и гидрофобные аминокислоты, вождение их самостоятельной сборки9,10 и позволяя им служить средством между гидрофобных и гидрофильных среды. Следовательно, для клинических доставки гидрофобные наркотиков –, которые имеют крайне низкий биодоступность и поглощения в организме из-за отсутствия растворимость в водной среде11,12 – ПСП являются многообещающими как доставки транспортное средство. Кроме того их последовательность шаблон также подразумевает, что ПСП можно рационально разработан и спроектирован для максимальной совместимости с любого данного препарата или соединения (т.е., на основе функциональных групп) и дальнейшего содействия растворимость.

ПСП применялись как эффективный препарат доставки в многих in vitro и in vivo параметры13,14,,1516. Они также показали большую безопасность и биосовместимостью. Однако из-за низкой осмолярности SAP-лекарственных препаратов, они не могут использоваться для внутривенных инъекций как клинические параметры13. Учитывая эту сдержанность, мы недавно разработали стратегию, которая сочетает в себе ПСП аминокислоты решения для снижения использования токсичных растворителей сотрудничества и повышение осмолярности формулировку и таким образом, клиническое значение. Мы решили использовать аминокислоты, как они являются строительными блоками ПСП, уже клинически принято, и в сочетании с ПСП, они увеличивают гидрофобный препарат растворимость в то время как сокращение объема SAP требуется17,18.

Мы изучили SAP-AA комбинации как обобщенная платформа для гидрофобный препарат растворимости и последующей доставки путем создания многоступенчатого отбора трубопровода и его применения к Src ингибитор, РР2, как модель гидрофобные соединение. В этом процессе мы исследовали эффект изменения компонентов рецептуры — в конечном итоге испытания 6 различных ПСП, все 20 аминокислот в 2 различных концентрациях (низкие и высокие; низкий на основе концентрации в существующих клинических приложений и высокая концентрации были 2 x, 3 x или 5 x клинических концентрации на основе максимальной растворимость каждого амино кислоты в воде) и 2 совместно Растворители разные – и выбранных комбинаций, которые солюбилизирован PP2 для дальнейшего анализа. Эта формулировка наркотиков оказалось эффективным как средство доставки наркотиков в культуре клеток, а также в естественных условиях модели с помощью администраций трахею и внутривенно. Кроме того, наша работа коснулся универсальность SAP-AA комбинаций в растворяющие несколько, структурно различные гидрофобные соединений в водной среде; в частности, препараты rottlerin и куркумин18. Эта рукопись излагается метод разработки SAP-AA и анализ куркумин растворимость в качестве примера основной шаг в нашем скрининг трубопровода. Этот протокол обеспечивает простой, воспроизводимые пути к экрану для оптимальных комбинаций SAP-AA, которые растворить любого заданного гидрофобные соединения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка аминокислоты решения

  1. подготовить и лейбл два 50 мл конические пробирок для каждой аминокислоты (один для обоих " низкой " и " высокой " концентрации).
  2. Подготовить большой настой 2 Л, содержащие очищенная вода (18,2 MΩ·cm при 25 ° C).
  3. Рассчитать сумму каждой аминокислоты (в граммах) для достижения желаемой концентрации и весят соответствующее количество аминокислот в их соответствующих 50 мл пробирок с помощью шпателя.
    Примечание: Для " высокой " концентрации двух отрицательно заряженные аминокислоты, вместо воды используется PBS. Мы не могли бы увеличить их концентрации из-за их низкой растворимостью в воде и с помощью PBS вместо воды помогает поддерживать низкий рН. Кроме того концентрация расчеты были получены с помощью окончательный объем 40 мл для решения каждой аминокислоты. Все концентрации аминокислот, изложены в таблице 3. Не забудьте промыть шпателем между аминокислоты, чтобы избежать загрязнения. Мы рекомендуем промыть водой, после чего вытирая с 70% этанол.
  4. Добавить 40 мл очищенной воды (или PBS) в каждую пробирку 50 мл с помощью Серологические Пипетки. Крышка трубки и вихревой или встряхнуть до растворения. Sonication ванна воды (комнатной температуры, 130 Вт, 40 кГц) может также использоваться для оказания помощи в процессе растворимость.
    Примечание: Следующие решения амино кислоты чувствительны к свету и должна быть покрыта алюминиевой фольгой: триптофан, фенилаланин и тирозина (которые состоят из ароматических кольцо подобных структур) и хвоща (реактивной - SH группе).

2. Подготовка решений SAP-АА

  1. подготовить 20 мл сцинтилляционные флаконы для самостоятельной сборки пептиды. Для самостоятельной сборки данного пептид, подготовить один флакон за подготовленные амино кислоты раствор (каждая комбинация будет производиться в отдельном флаконе).
  2. С помощью аналитического баланса высокой производительности (с читаемость вплоть до 0,1 мг или меньше), весят примерно 1 ± 0,2 мг пептида в нижней части каждого флакона. Крышка после взвешивания и запишите точный вес пептида на гл
  3. Пипетка соответствующий объем раствора аминокислоты (подготовлен в разделе 1) в каждый флакон, содержащий пептид, с тем чтобы достичь желаемой концентрации самостоятельной сборки пептида (0,1 мг/мл для длительного пептиды длиной 16 аминокислот, или 0,2 мг/мл для более короткие пептиды длиной 8 аминокислот).
  4. Sonicate для 10 минут в воду Ванна sonicator (130 Вт, 40 кГц) при комнатной температуре, обеспечение решения внутри флакона полностью погружен в водяной бане.

3. Подготовка наркотиков-ДМСО или растворы наркотиков-этанола фондовая

  1. жатки 1 мг препарата (в данном случае, куркумин с 100% ДМСО) и еще 1 мг с 100% этанола для создания двух акций решений.
    Примечание: Мы добавили 200 мкл ДМСО и 400 мкл этанола сделать ДМСО куркумин и этанол куркумин запасов, которые были 5 мг/мл и 2,5 мг/мл, соответственно, из-за различной растворимостью в каждом растворителя; Однако важно отметить, что концентрация запасов должны быть скорректированы в зависимости от гидрофобного препарата интерес. Такие факторы, как растворимость наркотиков и эффективная концентрация биологического важную роль в определении этого значения. Кроме того Имейте в виду, что запасы будут разбавлять 100 раз и 50-fold ДМСО и этанола формулировки, соответственно, в сочетании с решениями SAP-AA (см. раздел 4). Он может предпочитают готовить больший объем запасов в зависимости от количества составов требуется – в этом случае, будут использоваться более чем в 1 мг препарата. Запасы могут храниться при температуре-20 ° C; Оттепель на льду и вихревой перед использованием.
  2. Vortex флаконы для 15 s до полного растворения препарата.

4. Подготовка составов наркотиков

  1. подготовить четкие, 1,5 мл microcentrifuge трубы для каждой разработки. Будьте уверены, чтобы метки трубы с предполагаемой самостоятельной сборки, пептиды, аминокислоты (и концентрации) и совместного растворителя.
  2. Добавить 10 мкл препарата-ДМСО акций, или 20 мкл препарата-этанол акций соответствующие microcentrifuge трубы.
  3. Добавить 990 мкл кислоты решений SAP-AA на соответствующий помечены microcentrifuge пробирки, содержащие наркотиков-ДМСО фондовых и 980 мкл тем, содержащие запасов наркотиков-этанола. Это производит 1 мл препарата составов с 1% ДМСО или 2% этанола.
    Примечание: Конечная концентрация всех составов куркумин был 0.5 мг/мл по протоколу. Опять же, это будет меняться, когда начиная с различных фондовых концентрации или пользуясь других соединений, гидрофобностью (см. шаг 3.1)
  4. Vortex энергично для 30 s и позволяют составов на отдых в течение 30 мин

5. растворимость тестирование

  1. после периода отдыха, вихревой энергично еще раз для 30 s.
  2. Центрифуга для формулировки на 14,220 x g за 1 мин
  3. Анализировать в нижней части трубы microcentrifuge осадков (визуализация).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для гидрофобного препарата, куркумин, мы подготовили составов, с использованием всех 20, естественно существующих аминокислоты при низких концентрациях, в сочетании с только одним SAP, EAK16-II, как доказательство принципа. Мы также протестировали составов, используя ДМСО и этанола в качестве совместного растворителей. В общем это произвело 40 составов, куркумин, каждая из которых содержит различные компоненты. Важно отметить, что, в наших предыдущих исследований с использованием ингибито...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В разработке процедуры существуют различные важные шаги и вопросы для рассмотрения в устранении неполадок. Во-первых как мы работаем с различными компонентами и концентрации, несколько шагов вихря на протяжении протокола обеспечить все концентрации единообразных и правильно. Некоторые из решений высокой концентрации, гидрофобные аминокислоты до сих пор не может быть распущен полностью после vortexing, и в этом случае, они могут быть поколеблен энергично вручную для оказания помощи в процессе. Кроме того, важно, что решен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается канадской институты здравоохранения исследований, действующих грантов СС-42546 и СС-119514.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EAK16-ICanPeptide Inc.Индивидуальная пептиднаяпоследовательность: AEAKAEAKAEAKAEAK, ацетилирование N-конца и амидирование C-конца, чистота >95% с помощью HPLC
EAK16-IICanPeptide Inc.Индивидуальная пептиднаяпоследовательность: AEAEAKAKAEAEAAKAK, ацетилирование N-конца и амидирование C-конца, чистота >95% с помощью ВЭЖХ
EAK16-IVCanPeptide Inc.Специальная пептиднаяпоследовательность: AEAEAEAEAKAKAKAKAK, ацетилирование N-конца и амидирование C-конца, чистота >95% с помощью ВЭЖХ
EFK8-IICanPeptide Inc.Индивидуальная пептиднаяпоследовательность: FEFEFKFK, ацетилирование N-конца и амидирование C-конца, чистота >95% от ВЭЖХ
A6KECanPeptide Inc.пептидов: AAAAAAKE, ацетилирование N-конца и амидирование C-конца, чистота >95% от HPLC
P6KECanPeptide Inc.Индивидуальная пептиднаяпоследовательность: PPPPPPPPKE, ацетилирование N-конца и амидирование C-конца, чистота >95% с помощью ВЭЖХ
АланинSigma-AldrichA7469-100GL-аланин
изолейцинSigma-AldrichI7403-100GL-изолейцин
лейцинSigma-AldrichL8912-100GL-лейцин
метионинSigma-AldrichM5308-100GL-метионин
ПролинСигма-ОлдричP5607-100GL-Пролин
ВалинСигма-ОлдричV0513-100GL-валин
ФенилаланинСигма-ОлдричP5482-100GL-фенилаланин
триптофанСигма-ОлдричT8941-100GL-триптофан
тирозинСигма-ОлдричT8566-100GL-тирозин
ГлицинSigma-AldrichG8790-100GL-глицина
аспарагинSigma-AldrichA4159-100GL-аспарагин
ГлутаминSigma-AldrichG8540-100GL-глутамин
Серин Sigma-AldrichA7219-100GL-серин
ТреонинSigma-AldrichT8441-100GL-треонин
ГистидинСигма-ОлдричH6034-100GL-гистидин
лизинСигма-ОлдричL5501-100GL-лизин
аргининСигма-ОлдричA8094-100GL-аргинин
аспарагиновая кислотаСигма-ОлдричA7219-100GL-аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислотаСигма-ОлдричG8415-100ГL-глутаминовая кислота
ЦистеинSigma-AldrichC7352-100GL-цистеин
диметилсульфоксидSigma-AldrichD4540-500MLDMSO
ЭтанолSigma-Aldrich277649-100MLБезводный
куркуминSigma-Aldrich08511-10MGГидрофобный препарат, куркумин
RottlerinEMD Millipore557370-10MGГидрофобный препарат, роттлерин
PP2Enzo BML-EI297-0001Гидрофобный препарат, PP2
Сцинтилляционные флаконыVWR2650-66022-081Боросиликатное стекло, с завинчивающейся крышкой, 20 мл. Флаконы для взвешивания пептида.
Falcon 50 мл Конические центрифугирующие пробиркиVWR352070Полипропилен, стерильные, 50 мл. Для аминокислотных растворов.
Индивидуальная последовательность

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
  2. Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
  3. Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
  4. Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
  5. Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
  6. Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
  7. Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
  8. French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
  9. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
  10. Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
  11. Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
  12. Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
  13. Bawa, R., Fung, S. -Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
  14. Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
  15. Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
  16. Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
  17. Fung, S. -Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
  18. Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrophobic CompoundsSelf assembling PeptidesAmino Acid SolutionsSolubility TestingDrug FormulationCo solvent OptimizationPeptide Amino Acid CombinationsCurcumin SolubilityAqueous Solution DeliveryTherapeutic Function

Related Articles