Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Смешанных изображений и анализ мыши лазерно индуцированным хориоидеи неоваскуляризация модели

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56173

⸱

21 января 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Experimentica Ltd., 2Leica Microsystems, 3Spective LLC, 4Department of Ophthalmology, Stritch School of Medicine, Loyola University Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем полезность продольных в vivo изображений в прослеживании морфологические изменения лазерно индуцированным хориоидеи неоваскуляризация мышей.

Аннотация

Лазерно индуцированным хориоидеи неоваскуляризации (CNV) является устоявшейся модель для имитации влажных форме возрастной макулярной дегенерации (AMD). В этом протоколе мы стремимся руководствоваться читателя не просто через технические соображения генерации лазерно индуцированным поражения вызвать неоваскулярной процессы, но скорее сосредоточиться на мощный информацию, которая может быть получена из смешанных продольной в естественных условиях изображений на протяжении всего последующего периода.

Лазерно индуцированным мыши CNV модель была порождена администрации лазерный диод. Методы визуализации смешанных в естественных условиях были использованы для мониторинга CNV индукции, прогрессирование и регрессии. Во-первых, спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) была выполнена сразу после лазерная проверка разрыв мембраны Бруха. Последующие в vivo изображений с помощью fluorescein ангиография (ФА) подтвердил успешные повреждение мембраны Бруха от последовательного изображения, полученные на уровне хориоидеи. Продольные последующей CNV распространения и регрессии на 5, 10 и 14 дни после лазерная выполнялось с помощью SD-OCT и Англии. Простой и надежный классификации Дырявый ЦНВ leasions из Англии изображения представлены. Автоматизированный сегментации для измерения толщины всего сетчатки, в сочетании с применением ручной калибр для измерения толщины сетчатки в ЦНВ сайтов, позволяют беспристрастной оценки наличия отеков. Наконец Гистологическая верификация CNV осуществляется с помощью isolectin GS-IB4 окрашивания на хориоидеи flatmounts. Окрашивание показатели, и isolectin позитивных площадь вычисляется с ImageJ.

Этот протокол является особенно полезным в терапии исследований, требующих высокой пропускной способности, как скрининг CNV патологии, как он позволяет быстро, смешанных и надежной классификации CNV патологии и сетчатки отек. Кроме того высоким разрешением SD-OCT позволяет запись других патологических признаков, как накопление субретинальное или Интраретинальные жидкости. Однако этот метод не предоставляет возможность автоматизировать анализ объема CNV от SD-Окт изображения, которая должна быть выполнена вручную.

Введение

Первая успешная попытка имитировать патологии человека CNV грызунов было продемонстрировано почти три десятилетия назад с криптона лазерных в Лонг-Эванс крысы1. После этого криптона лазерных был использован сломать мембраны Бруха в самых популярных мыши напрягаться, C57BL/6J2,3,4. Показатель успеха CNV индукции было проверено с FA и гистологической пятна. Быстрое развитие методов неинвазивной визуализации, например OCT, способствовали росту поля грызунов доклинических моделей. Возможность контролировать морфологические изменения в сетчатке глаза в нескольких точках время тот же глаз значительно способствует сокращению использования животных и увеличивает эффективность в ходе экспериментальных исследований. Гистологическая Оценка CNV поражения довольно прост и требует маркировки ненормальныйа рост сосудов вокруг сайт лазерной администрации, загрузки изображений и площадь/объем оценки с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Напротив в естественных условиях визуализации формы внедрить более сложные анализы CNV патологии и его толкования.

Здесь мы представляем простой и относительно быстрый способ индукции класс, прогрессии и регрессии CNV с помощью Англии, SD-Октябрь, и метод автоматической сегментации в мыши лазерно индуцированным CNV модель.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные рассматривались в соответствии с заявлением Арво для использования животных в глазной и видение исследования и Директива 86/609/EEC для экспериментов на животных, с использованием протоколов утвержденные и контролируется животного эксперимента Совет Финляндии.

1. лазерно индуцированным мышь CNV модель 5

  1. Проверяйте глаза животного макроскопически для каких-либо отклонений.
  2. Вес мыши.
  3. Рассчитать и подготовить соответствующее количество обезболивающих средств для использования, на основании веса животного, например смесь medetomidine (1 мг/кг), кетамин (75 мг/кг) и дистиллированной воды (0,9% раствор NaCl) в соотношении 1:1.5:2.5, или кетамин (40-75 мг/кг), Ксилазина (5 мг/кг) и дистиллированной воды (0,9% раствор NaCl) в соотношении 1: 2. 5:1; 20 g мыши вводить 0,1 мл смеси.
  4. Инъекционные анестетики внутрибрюшинно.
  5. Место мыши обратно в клетке и ждать, пока животное находится под наркозом. Убедитесь, что мышь должным образом под наркозом, отсутствие педали рефлекс.
  6. Обеспечить использование лазерной безопасности средств индивидуальной защиты.
  7. Включите щелевой лампы и 532 нм Лазер диода.
  8. Удалите мышь из клетки и место на грелку.
  9. Нанесите одну каплю Тропикамид для зрачков дилатация. Подождите 3-5 мин для зрачков дилатация полный (3 мм).
  10. Поместите курсор мыши на сцене щелевой лампы.
  11. Поместите одну каплю глазничного жидкого геля на coverslip к applanate роговицы.
  12. Расположите мышь глаз с главой зрительного нерва в центре.
  13. Установить мощность лазера до 100 МВт, продолжительность до 100 мс и пятно размером до 50 мкм.
  14. Фокус лазерного луча на пигментный эпителий сетчатки (ПЭС).
  15. Сделайте три лазерного выстрела в один глаз, избегая сетчатки сосудов идеально на 4, 8 и 12 часов позиции вокруг зрительного нерва, соответственно. Осмотрите глазного дна, после того, как все Лазерные выстрелы для отсутствия сетчатки кровотечения. Контралатеральной глаз служит элемент лессировку.
  16. Отменить coverslip и место мыши на грелку.
  17. Нанесите одну каплю PEG гель капель на обоих глазах.

2. SD-Окт 6,7

  1. Поместите указатель мыши в стадии грызунов выравнивание и иммобилизации головы.
  2. Совместите объектив SD-Окт системы (например, Bioptigen/Leica Envisu R2200) грозит глаз в vivo образов с помощью X - и Y-этап контроллеры.
  3. Выполнять проверку SD-OCT для проверки перерывы мембраны Бруха: как только SD-Окт сканирует весь глаз, вручную переместить исходной линии на гравированных сайтах. Перерывы мембраны Бруха должна быть отчетливо видна в гравированных областях (см. Рисунок 1).

3. fluorescein ангиография 7,8,9

  1. Удаление мышь с держателем и поместите его на системе FA (например, Heidelberg Spectralis HRA2).
  2. Фокус на лазер сжечь области глазного дна с помощью режима ИК отражения с главой зрительного нерва в середине окна просмотра.
  3. Придать 0,1 мл 5% флуоресцеин натриевой соли для мыши 20 g, подкожно или внутрибрюшинно.
  4. Сосредоточиться на уровне хориоидеи.
  5. Возьмите изображения от уровня хориоидеи фокус.
  6. Переориентировать на уровне сетчатки и принять изображение.
  7. Подождите 30 s и повторите шаги 3.4-3.6.
  8. Выньте из держателя мыши и поместите его на грелку.
  9. Обратный анестезии, α2-антагонистов для medetomidine, Атипамезола (0,5 мг/кг, и.п.) или ждать восстановления животных от анестезии.
  10. Повторите в vivo SD-OCT и FA изображений на наркотизированных животных в последующие дни 5, 10 и 14.

4. CNV классификации

  1. Класс повреждение мембраны Бруха от октября изображения и хориоидеи FA снимки сразу после лазерная день 0 следующим:
    0 - не повреждена мембрана Бруха
    1 - успешный повреждение мембраны Бруха
  2. Класс присутствие CNV от гравированных пятна, которые были утечки, как отмечалось, сравнивая динамику флуоресцеин сигнала в серии сетчатки FA изображений следующим:
    0 - нормальный вид сетчатки
    0.5 - слабый пятнать утечки
    1.0 - Дырявый CNV областей
    Примечание: Используйте OCT изображений для дополнительного подтверждения CNV или сомнительных FA где присутствие Интраретинальные жидкости в OCT изображения будет предложить CNV классификации.

5. сетчатки толщин

  1. Использование программного обеспечения автоматизированной сегментации для измерения толщины сетчатки. Убедитесь, что общая толщина сетчатки считается, толщина всех слоев из слоя нервных волокон НПП (здоровый измерения сайты), или воображаемой линии, соединяющей НПП вокруг места повреждения (лазером участков) (см. также рис. 7).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Пузыря или кровотечение сразу после лазерная subretinal не всегда видны. Таким образом SD-Окт особенно важно проверить повреждение мембраны Бруха. На рисунке 1 показан пример OCT изображений в разное время точках после лазерной администрации.

figure-results-1
Рисунок 1 : OCT en лицо глаза глазног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Смешанных изображений предлагает ценные инструменты для оценки CNV патологии. Здесь мы представили изображений протокол, состоящий из Англии, SD-OCT и автоматической сегментации для быстрого, воспроизводимые и надежной оценки CNV патологии. Разрыв мембраны Бруха после лазерной администрации было подтверждено. Кроме того использование SD-Октябрь на данном этапе также позволило немедленно визуализация возможных Интраретинальные и субретинальное кровоизлияния, которые могут сбить с толку интерпретацию результатов. Сетчатки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор Symantas Рагаускас, к.т.н. является работник (научный сотрудник) и акционер компании Experimentica Ltd., который предлагает контракта служб исследований доклинических CNV модель, используемая в этой статье.

Автор Eva Kielczewski является сотрудником (инженер приложений, Окт) Leica Microsystems, который производит SD-Окт систем, используемых в этой статье.

Автор Джозеф Vance является сотрудником (NA октября директор по продажам) компании Leica Microsystems, который производит SD-Окт систем, используемых в этой статье. Джозеф Вэнс также является президентом и управляющим директором щего, ООО.

Автор Симон Kaja, к.т.н.-консультант главный научный сотрудник и акционер компании Experimentica Ltd., доклинические контрактно-исследовательская организация, предлагает контракт исследовательских услуг, включая доклинические CNV модель используется в этой статье. Симон Kaja, кандидат также Генеральный директор K & научных P, ООО, наук о жизни консалтинговой фирмы и выступает в качестве д-р Джон P. и Тереза E. Малкахи наделены профессором офтальмологии в университете Лойолы, Стритч школа медицины. Условия этого соглашения были рассмотрены и одобрены Университет Лойолы в соответствии с его политикой конфликта интересов.

Автор Гедрюс Kalesnykas, Ph.D. — сотрудника (ГАС) и акционер компании Experimentica Ltd., который предлагает контракта служб исследований доклинических CNV модель, используемая в этой статье.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Юлия Наумчук (Университет Лойолы) и Агне Žiniauskaitė (Experimentica ООО) за отличную техническую и видеографическая поддержку. Программа исследований доктор Kaja поддерживается Dr. John P. и Тереза E. Малкахи наделены профессуру в офтальмологии в университете Лойолы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Медетомидин (коммерческое название Domitor)OrionVnr 01 56 02Анестезия
KetamineIntervetVnr 51 14 85Анестезия
0,9% NaClB Braun357 0340Анестезия
Ксилазин (коммерческое название Rompun vet)Bayervnr 14 89 99Анестезия
TropicamideSantenVnr 04 12 36Mydriatic
Средство ViscotearsAlconVnr 44 54 81Лубрикант
SystaneAlcon -Лубрикант
5% Флуоресцеин Натриевая сольSigma AldrichF6377-100GФлуорезент
Атипамезол (коммерческое название Антиседан)OrionVnr 47 19 53Анестезия

Ссылки

  1. Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
  2. Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
  3. Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
  4. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
  5. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502(2015).
  6. Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
  7. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643(2015).
  8. Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
  9. Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
  10. Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo
В естественных условиях Смешанных изображений и анализ мыши лазерно индуцированным хориоидеи неоваскуляризация модели
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.