Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

Краткое содержание

Эффективный скрининг протокол представлен для идентификации малых молекул, которые способствуют астроглиальных дифференцировки стволовых клеток глиобластомы (GSCs). Assay основан на которой выражение расширенной GFP (eGFP) управляется человека промоутер СВМС репортер дифференцировки стволовых клеток.

Аннотация

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенным и наиболее смертоносных первичного мозга опухоль в взрослых, вызывая примерно 14 000 смертей каждый год в США в одиночку. Медиана выживаемости после диагностики находится менее чем в 15 месяцев с максимальной хирургической резекции, радиации и Темозоламид химиотерапии. Проблемы, присущие в разработке более эффективных методов лечения GBM стали все более очевидными и включить его непоколебимой инвазивность, его устойчивость к стандартной процедуры, ее генетических сложности и молекулярных адаптируемость и субпопуляций GBM клетки с фенотипические сходство с обычной стволовых клеток, далее именуемая глиобластома стволовых клеток (GSCs). Потому что GSCs необходимы для роста опухоли и прогрессии, на основе дифференциации терапия представляет механизм эффективным методом лечения для этих неизлечимой новообразования.

Следующий протокол описывает коллекцию процедур установить высокую пропускную способность, скрининг платформы, направленные на выявление малых молекул, которые способствуют GSC астроглиальных дифференцировки. Ядром системы является конструкцией репортер дифференциация глиальных фибриллово кислой белка (СВМС). Протокол содержит следующие общие процедуры: (1) создание РКГ дифференциация репортер линии; (2) тестирование/Проверка актуальности репортер GSC self обновление/колониеобразования емкости; и (3) высокой емкости цитометрии наркотиков скрининг.

Скрининг платформа обеспечивает простой и недорогой подход для выявления малые молекулы, которые способствуют GSCs дифференцировки. Кроме того использование библиотек FDA утвержденных препаратов имеет потенциал для идентификации агентов, которые можно многократно использовать более быстрыми темпами. Кроме того методы лечения, которые способствуют дифференцировки стволовых клеток рака, как ожидается, синергетически работать с текущей «стандарт медицинской помощи» терапии, которые показали и ликвидации прежде всего более дифференцированной раковые клетки.

Введение

Недавние исследования показали, что опухоли содержат небольшой численностью населения клеток, Рак стволовых клеток (ПОК) или инициирование опухоли клетки, которые отвечают за прогрессии опухоли, метастазы и устойчивость к химио - и радио терапии ^{1, 2}. наличие раковых стволовых клеток и их более дифференцированной потомков в опухоли считается важным фактором содействия внутриопухолевых неоднородность и таким образом является главным препятствием в лечении рака³. Опухоли клеток иерархии, представленной теории стволовых клеток рака, вдохновило развитие новых стратегий для лечения рака ⁴. Один из подходов для ориентации Рак стволовых клеток заключается в выявлении и подавляют сигнальных путей, которые известны как требуется во время эмбрионального развития пораженного органа. Действительно мы и другие ранее опубликовали несколько документов, описывающих текущие требования нервные стволовых клеток соответствующие сигнальные пути Еж Соник и паз, глиобластома^5,6,7. Эта работа помогла застывающих обоснование несколько GBM клинических испытаний. Второй подход для ориентации Рак стволовых клеток заключается в содействии их дифференциация. Этот подход получил много поддержки из-за благоприятные результаты доклинических и клинических исследований в лечении острого promyelocytic лейкоза с ретиноевой кислоты (ATRA, аналог витамина А). Здесь был найден ATRA удалить блок созревания и поощрять дифференциацию клеток рака⁸. Совсем недавно Пикирилло и коллеги элегантно показали, что BMP-4 вызывает дифференцировку РКГ в астроциты с значительным анти GBM эффекты in vitro и in vivo⁹.

Основания для нынешнего исследования основана на подходе «обратный инжиниринг» для ориентации GSCs. Учитывая огромные неоднородность, присутствующие в GBM и с плохой дифференциацией, будучи одним из отличительных признаков рака, мы спросили, если мы могли бы содействовать более благоприятные фенотип - дифференциация в экзоцитоз подобное состояние. Здесь мы не имеют предварительных знаний о сигнальных путей, которые поддерживать GSCs в данной опухоли образец, но скорее стремимся достичь желаемого фенотип (например СВМС позитивности).

В настоящем докладе описываются процедуры, используемые для установления GSC дифференциация репортер линии от трансдукции GSC-обогащенный культур GSC клонового отбора. Глиобластома нейросферы линии, используемые были созданы в лаборатории профессора Анджело Вескови от пациентов с диагнозом первичной глиобластомы в госпитале San Raffaele - Милан, Италия. Эти линии были широко изучены в ряде публикаций ^{6,10,11,12,13,14}. Настоятельно рекомендуется, что люди, которые заинтересованы в осуществлении этих методов в их лаборатории определяют актуальность репортер способность самообновления Рак стволовых клеток в клетки, они планируют изучать (это верно для любого репортер). Подробный протокол для одного в vitro колониеобразования анализов в поле предоставляется для достижения этого^15,16. Наконец подробный протокол описания использования дифференциация репортер линий на экране наркотиков цитометрии основе предоставляется в конце. Следует отметить аналогично системе дифференциации астроглиальных, описанных здесь, мы успешно создали и проверены линии репортер GSC интеграции репортер (нейрональных дифференциации) MAP2:GFP. Таким образом, методологии описывают в этом бумаги могут быть применены для изучения клеточной дифференцировке в различные ячейки.

Некоторые из фигур в настоящем докладе можно найти в недавней публикации: «атракурия бесилат других нервно блокирующих агентов астроглиальных дифференциация и содействия разрушающим стволовых клеток глиобластомы¹⁸.

Протокол

Примечание: Астроглиальных и нейрональных человека репортер систем были приобретены как расфасованных, концентрированные лентивирусные препаратов. Базовые знания потока цитометрии техники не требуется. Кроме того для полного использования этого протокола пользователю необходим доступ к проточный цитометр с высокой пропускной способностью (принимает 96-луночных пластины как источника выборки).

1. лентивирусные Transcriptional репортер системы

Примечание: В всех анализов гранулярных потока, используйте для создания базовых флуоресценции родителей, не преобразованы, ячейки или преобразованы вектор (не люминесцентные). Кроме того Обратите внимание, что на всех этапах, где механические Тритурация вызывается, быть нежным. Суровые Тритурация может убить значительное количество хрупкие GSCs и влияние потока цитометрии результаты.

1. Пластина 1 x 10⁶ клеток в 2 мл среднего роста полного нервных стволовых клеток в пластине 6-multiwell.
2. Передают клетки путем добавления человека репортер на разносторонности инфекции (МВД) равен 5.
3. 2 мкл Полибрен для окончательного концентрации 8 мкг/мл.
4. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO₂ на ночь.
5. Следующий день, замените роста средних удалить несвязанные вирус. Поместите пластины обратно в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂ и инкубировать в течение 24 ч.
6. Урожай 0,5 мл общего объема; спин вниз клетки на 360 x g 5 мин при комнатной температуре в 15 мл Конические трубки и удалить супернатант путем аспирации. Добавить 0,5 мл свежего нервных стволовых клеток роста средних в остальные ячейки и возвращение пластину в инкубатор для дальнейшего расширения.
7. Добавить 200 мкл Реагента диссоциации и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
8. Разбить ячейки, нежно закупорить вверх и вниз.
   Примечание: Жестковатый Тритурация может привести к значительным убийство GSCs, полной диссоциации обычно достигается через 20 - 30 раз.
9. Чтобы свести к минимуму клеток вложение или агрегирования, мкл 800 из Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) для заключительного тома 1 мл.
10. Трансфер 200 мкл каждого суспензию клеток хорошо 96-multiwell пластины.
11. Для выполнения этой процедуры используйте проточный цитометр benchtop с возможностью 96-луночных пластины с голубой лазер для возбуждения и с возможностью обнаружения Зеленый флуоресцирующий белок. Анализ потока гранулярных с по крайней мере 10 000 жизнеспособным клетки для каждого приобретения.
12. Определите процент GFP-положительных клеток проточной цитометрии.

2. subclone отбора, расширение и проверки

1. Плита клетки в 100 мкл среды нервных стволовых клеток на плотность 0.7 клеток на хорошо 96-multiwell пластины.
2. Культура клоны 11 дней при 37 ° C и 5% CO₂. Этот шаг является весьма зависит от типа ячейки и скорее всего потребует корректировки, основанные на линии клеток. Как общее правило сфере диаметр ≥ 100 мкм является хорошим свидетельством присутствия колониеобразования GSCs в neurospheres.
3. С помощью флуоресцентного микроскопа с фильтром FITC, Марк скважин, которые содержат один нейросферы где ~ 1-5% клеток являются GFP-позитивными.
   Примечание: Определение точный процент GFP-положительных клеток не слишком критически настроен на данный момент. Каждый из subclones позднее будет оцениваться проточной цитометрии. Этот шаг выполняется для снижения общее количество клонов анализируемым с упором на neurospheres, которые происходят, недифференцированный, СВМС отрицательно, GSC.
4. Разверните узел выбранного репортер клоны до тех пор, пока существует достаточное количество клеток для анализа проточной цитометрии. Югу вырожденная хорошо 6-multiwell плиты, содержащего ≤ 1.5x10⁵ клеток/мл следует обеспечить достаточное количество клеток.
   Примечание: Подробная процедура для изоляции и расширение GSCs является наличие ¹⁷.

3. определение выражения GFAP:GFP подачей Cytometry

1. Урожай Алиготе клеток (0,5 мл) от каждого репортера клон и элементы управления, не преобразованы, чтобы определить точный процент GFP-положительных клеток. Учитывая репортер клоны, которые содержат ~ 1-5% GFP-положительных клеток.
2. Спина клетки на 360 x g 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант путем аспирации.
3. Для каждой гранулы 200 мкл Реагента диссоциации клеток и инкубировать трубы на водяной бане, равным 37 ° C.
4. Нарезанных клетки осторожно, чтобы достичь одну ячейку подвеска (обычно от 20 до 30 раз).
5. Для сведения к минимуму клеток вложение или агрегирования, добавьте 800 мкл HBSS окончательный объем 1 мл.
6. Трансфер 200 мкл на хорошо 96-multiwell плиты из каждой ячейки подвеска.
7. Для выполнения этой процедуры используйте проточный цитометр benchtop с возможностью 96-луночных пластины. Анализ потока гранулярных с по крайней мере 10 000 жизнеспособным клетки для каждого приобретения.

4. ЭЛЬДА самообновлению Assay оценить способность колониеобразования

Примечание: Для элементов управления, как родителей, не преобразованы, так GFP-выражая преобразованы человека клетки, должны использоваться для определения относительной колониеобразования потенциал линии репортер дифференциация GSC к оригинальной GSC культур, из которых они были производные.

1. Отделить subclones дифференциация репортер в сингл клеточных суспензий, как описано выше.
2. Плита клетки в 96-multiwell пластины в 100 мкл полного нервных стволовых клеток роста средств массовой информации в ячейки плотность колеблется от 5 до 500 клеток на хорошо.
3. Инкубации клеток для 9-11 дней при 37 ° C и 5% CO₂.
4. Оценка положительных скважин по прямой визуализации neurospheres под микроскопом света. Также следует рассматривать «позитивные», если он содержит по крайней мере один большой нейросферы.
5. Подключите данные: всего скважин проанализированы и количество положительных скважин с использованием ЭЛЬДА онлайн интерфейса доступны на http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5. наркотиков библиотека разрежения подготовка

1. Удалить библиотеку пластины из хранения при температуре-80 ° C, накрыть алюминиевой фольгой (защита светочувствительных соединений). Оттепель на около 30 минут до часа при комнатной температуре.
2. Использование 12-канальный многоканальных дозаторов для разбавления библиотека соединений до 0,2 мм в среде полного нервных стволовых клеток. Разбавляют ДМСО до 10% роста средней
   Примечание: Конечная концентрация ДМСО должно быть 0,1% при добавлении к клеткам. Более высокой концентрации ДМСО в культуре может привести к токсичности. По этой причине мы рекомендуем вам проверить чувствительность к ДМСО в клетки линии, до лечения.
3. Использование ДМСО как управления транспортным средством для лечения клетки обнаружены в левой и правой колонки каждой пластины (колонки 1 и 12; Уэллс А через час).
4. Накладки разреженных библиотека с алюминиевой фольгой и вернуть оригинальных пластин библиотека в морозильник-80 ° C для длительного хранения.

6. наркотиков экран

Примечание: ДМСО лечение клетки следует использовать для задания базовых флуоресценции и отрегулировать стробирования.

1. Клемная 5 x 10³ клеток в 96-multiwell пластины в 99 мкл среднего роста полного нервных стволовых клеток.
2. Использование 12-канальный многоканальных дозаторов, лечить клетки с разбавленным библиотека соединений в конечной концентрации 2 мкм (1 мкл препарата 0,2 мм в 99 мкл суспензии клеток) или с ДМСО (управления). Инкубируйте пластины для 72 ч при 37 ° C и 5% CO₂.
3. С помощью 12-канальный многоканальных дозаторов 150 мкл Реагента диссоциации клеток для каждой скважины и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
4. Разбить ячейки, нежно истирание с 12-канальный многоканальных дозаторов, вплоть до отдельной ячейки подвеска (обычно от 20 до 30 раз). Количество времени, которое требуется отделить neurospheres полностью будет варьироваться между линиями GSC. В то время как реагент диссоциации рекомендованные клеток (см. материалы) является безопасным и инкубации до 45 минут никак не влияет на жизнеспособность в многострочный GSC испытания, проверки на каждой РКГ линии для использования в скрининга.
   Примечание: Окончательный объем в каждом хорошо должно быть примерно 250 мкл (100 мкл суспензии клеток + 150 мкл Реагента диссоциации клеток).
5. Определите процент клеток, выражая репортер GFAP:GFP проточной цитометрии. Используйте стандартные стробирования стратегию. Во-первых сюжет вперед и боковых рассеивает получить общее ощущение размер ячейки и жизнеспособности. Затем поместите ворота на жизнеспособные населения одной ячейки. Это население, для которого будет определяться Зеленая флуоресценция (eGFP). Любые смеси, что приводит к увеличению доли GFP-положительных клеток путем более трех стандартных отклонений контроль над (ДМСО лечение) рассматривается как положительный «хит». Этот порог должен быть скорректирован согласно конкретных приложений и желаемой жесткости.
   Примечание: Для высокой пропускной способности экрана рекомендуется с помощью единого subclone репортер GSC. После удара идентификации должно проверяться каждый удар против дополнительных репортер subclones от одной и той же линии GSC. Для повышения доверия для истинной хитов также рекомендуем тестирование соединения против репортера subclones изолированы от различных GSC neurospheres линии.

Результаты

Три независимых пациента производные neurospheres линии были преобразованы с журналистом астроглиальных человека, кодирование для Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) сливается в рама с Zeocin сопротивление кассету и управляется элементом человеческого СВМС промоутер ( Рисунок 1). Следующий индивидуальные клоны были изолированы от обшивки 0.7 ячеек на скважину в 96 хорошо пластины (рис. 2), последовало потока гранулярных определен...

Обсуждение

Хотя большинство предыдущих исследований GSCs, сосредоточены главным образом на маркеры, которые определяют их в этом исследовании мы решили взять обратный подход. Мы ориентируемся прежде всего на дифференцированной потомков, порожденных GSCs (например, клетки, выражая астроглиальных и нейрональных маркеры). Здесь мы продемонстрировать использование препарата на основе ячеек высокую пропускную способность, скрининг системы, которая основана на человека СВМС промоутер зависимой выражения гена GFP. Все эксперименты были пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (Сбалансированный раствор соли Хэнка)	Sigma Aldrich	H6648
Дифференцировщик GFAP человека (pGreenZeo, вирус)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 мл стерильный одноразовый реагент резервуары	Corning	4870
6-луночная пластина	Thermo Fisher Scientific	130184
96-луночная пластина	Falcon	353072
Biolite T25 cm² Колба вентилируемая	Thermo Fisher Scientific	130189
Biolite T75 см² Колба вентилируемая	Thermo Fisher Scientific	130190
15 мл Центрифуга	Celltreat	229411
1,5 мл Микроцентрифужные пробирки	Fisher Scientific	05-408-129
Многоканальная пипетка Ovation, 12 каналов, 0,5 - 20 мкл	VistaLab Technologies	1060-0020
Многоканальная пипетка Ovation, 12 каналов, 5-250 мкл	VistaLab Технологии	1060-0250
Наконечники для дозаторов мульти 12-канальные 25 μ l	VistaLab Technologies	4060-1002
Наконечники для дозаторов мульти 12-канальные 250 μ	l VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Настольный проточный цитометр	EMD Millipore	0500-4005
NIH Клинические коллекции 1 и 2 библиотеки малых молекул	Evotec
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	>Комментарии
Для приготовления сред нейральных стволовых клеток (500 мл)			Конечная концентрация
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0,20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Гепарин натриевая соль	Sigma Aldrich	H3149	0,0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5,4 мМ
Инсулин-трансферрин-селен (ИТС-Г) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14,5 мМ
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) 100X	Gibco	15140-122	1X
Прогестерон	Sigma Aldrich	P8783	16 нМ
Путресцин	Sigma Aldrich	P5780	4.8 &микро; M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 нг/мл
ЭФР, Human	GoldBio	1150-04-100	20 нг/мл
Фильтр для бутылок, 150 мл, 33 мм, 0,22 мкм, Pes, S, Ind	Corning	431160	Используется для фильтрации стерилизуемых сред