Method Article

Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

DOI:

10.3791/56176

⸱

January 10th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 3Department of Neurological Surgery, University Hospital-Case Medical Center, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективный скрининг протокол представлен для идентификации малых молекул, которые способствуют астроглиальных дифференцировки стволовых клеток глиобластомы (GSCs). Assay основан на которой выражение расширенной GFP (eGFP) управляется человека промоутер СВМС репортер дифференцировки стволовых клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенным и наиболее смертоносных первичного мозга опухоль в взрослых, вызывая примерно 14 000 смертей каждый год в США в одиночку. Медиана выживаемости после диагностики находится менее чем в 15 месяцев с максимальной хирургической резекции, радиации и Темозоламид химиотерапии. Проблемы, присущие в разработке более эффективных методов лечения GBM стали все более очевидными и включить его непоколебимой инвазивность, его устойчивость к стандартной процедуры, ее генетических сложности и молекулярных адаптируемость и субпопуляций GBM клетки с фенотипические сходство с обычной стволовых клеток, далее именуемая глиобластома стволовых клеток (GSCs). Потому что GSCs необходимы для роста опухоли и прогрессии, на основе дифференциации терапия представляет механизм эффективным методом лечения для этих неизлечимой новообразования.

Следующий протокол описывает коллекцию процедур установить высокую пропускную способность, скрининг платформы, направленные на выявление малых молекул, которые способствуют GSC астроглиальных дифференцировки. Ядром системы является конструкцией репортер дифференциация глиальных фибриллово кислой белка (СВМС). Протокол содержит следующие общие процедуры: (1) создание РКГ дифференциация репортер линии; (2) тестирование/Проверка актуальности репортер GSC self обновление/колониеобразования емкости; и (3) высокой емкости цитометрии наркотиков скрининг.

Скрининг платформа обеспечивает простой и недорогой подход для выявления малые молекулы, которые способствуют GSCs дифференцировки. Кроме того использование библиотек FDA утвержденных препаратов имеет потенциал для идентификации агентов, которые можно многократно использовать более быстрыми темпами. Кроме того методы лечения, которые способствуют дифференцировки стволовых клеток рака, как ожидается, синергетически работать с текущей «стандарт медицинской помощи» терапии, которые показали и ликвидации прежде всего более дифференцированной раковые клетки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние исследования показали, что опухоли содержат небольшой численностью населения клеток, Рак стволовых клеток (ПОК) или инициирование опухоли клетки, которые отвечают за прогрессии опухоли, метастазы и устойчивость к химио - и радио терапии 1, 2. наличие раковых стволовых клеток и их более дифференцированной потомков в опухоли считается важным фактором содействия внутриопухолевых неоднородность и таким образом является главным препятствием в лечении рака3. Опухоли клеток иерархии, представленной теории стволовых клеток рака, вдохновило развитие новых стратегий для лечения рака

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Астроглиальных и нейрональных человека репортер систем были приобретены как расфасованных, концентрированные лентивирусные препаратов. Базовые знания потока цитометрии техники не требуется. Кроме того для полного использования этого протокола пользователю необходим доступ к проточный цитометр с высокой пропускной способностью (принимает 96-луночных пластины как источника выборки).

1. лентивирусные Transcriptional репортер системы

Примечание: В всех анализов гранулярных потока, используйте для создания базовых флуоресценции родителей, не преобразованы, ячейки или преобразованы вектор (не люминесцентные).....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Три независимых пациента производные neurospheres линии были преобразованы с журналистом астроглиальных человека, кодирование для Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) сливается в рама с Zeocin сопротивление кассету и управляется элементом человеческого СВМС промоутер ( Рисунок 1). Следующий индивидуальные клоны были изолированы от обшивки 0.7 ячеек на скважину в 96 хорошо пластины (рис. 2), последовало потока гранулярных определен.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя большинство предыдущих исследований GSCs, сосредоточены главным образом на маркеры, которые определяют их в этом исследовании мы решили взять обратный подход. Мы ориентируемся прежде всего на дифференцированной потомков, порожденных GSCs (например, клетки, выражая астроглиальных и нейрональных маркеры). Здесь мы продемонстрировать использование препарата на основе ячеек высокую пропускную способность, скрининг системы, которая основана на человека СВМС промоутер зависимой выражения гена GFP. Все эксперименты были пр.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа частично поддерживается R01CA187780 низ.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ESGRO Complete AccutaseEMD MilliporeSF006
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma AldrichD2650
HBSS (Сбалансированный раствор соли Хэнка)Sigma AldrichH6648
Дифференцировщик GFAP человека (pGreenZeo, вирус)SBI (System Biosciences)SR10015VA-1
50 мл стерильный одноразовый реагент резервуарыCorning4870
6-луночная пластинаThermo Fisher Scientific130184
96-луночная пластинаFalcon353072
Biolite T25 cm² Колба вентилируемаяThermo Fisher Scientific130189
Biolite T75 см² Колба вентилируемаяThermo Fisher Scientific130190
15 мл ЦентрифугаCelltreat229411
1,5 мл Микроцентрифужные пробиркиFisher Scientific05-408-129
Многоканальная пипетка Ovation, 12 каналов, 0,5 - 20 мклVistaLab Technologies1060-0020
Многоканальная пипетка Ovation, 12 каналов, 5-250 мклVistaLab Технологии1060-0250
Наконечники для дозаторов мульти 12-канальные 25 μ lVistaLab Technologies4060-1002
Наконечники для дозаторов мульти 12-канальные 250 μ l VistaLab Technologies4060-9025
Guava easyCyte 5HT Настольный проточный цитометрEMD Millipore0500-4005
NIH Клинические коллекции 1 и 2 библиотеки малых молекулEvotec
Название<strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Для приготовления сред нейральных стволовых клеток (500 мл)Конечная концентрация
BSAGoldBio.comA-421-2500,20%
DMEM/F12 10XCorning90-091-PB1X
Гепарин натриевая сольSigma AldrichH31490,0002%
HEPES 1MSigma AldrichH40365,4 мМ
Инсулин-трансферрин-селен (ИТС-Г) (100X)Life Technologies41400-0451X
NaHCO3Sigma AldrichS-576114,5 мМ
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) 100XGibco15140-1221X
ПрогестеронSigma AldrichP878316 нМ
ПутресцинSigma AldrichP57804.8 &микро; M
Basic FGF (FGF2), HumanGoldBio1140-02-5010 нг/мл
ЭФР, HumanGoldBio1150-04-10020 нг/мл
Фильтр для бутылок, 150 мл, 33 мм, 0,22 мкм, Pes, S, IndCorning431160Используется для фильтрации стерилизуемых сред

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-406....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glioblastoma Stem CellsFlow Cytometry ScreeningGFAP Reporter ConstructSmall Molecule ScreeningCellular Differentiation AssayDrug Repurposing PlatformLentivirus TransductionNeurosphere FormationGFP Positive CellsHigh Throughput Screening

Related Articles