Применение методики многоцветной FlpOut для изучения морфологии одноклеточного высокого разрешения и взаимодействия клеток глии в дрозофилы

Глии, население не нейрональных клеток нервной системы (NS), давно считается статическим основу для нейронов и поэтому не были изучены в деталях. Однако в организме человека, глии составляют подавляющее большинство клеток в NS (~ 90%) и делятся на несколько различных категорий, в том числе астроциты, олигодендроциты, Микроглия и Шванновские клетки. У дрозофилыглии составляют около 10% ячеек в NS. Интригующе их морфологии и функции удивительно похожи на те, нашли в позвоночных^1,2. Их морфологии включают гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) формирование эпителия, ensheathing и экзоцитоз подобных клеток.

Дрозофилы центральной нервной системы (ЦНС) состоит из следующих основных структур: области коры, которые содержат нейрональных клеток органов; neuropils, что гавань синаптических связей; аксон малые и большие участки, которые соединяют разные neuropiles; периферических нервов, которые связывают органы чувств и мышцы с ЦНС (рис. 1). Глии находятся связанные с все эти анатомические структуры: глии (CG) коры в кортикальной регионах, экзоцитоз как ГЛИА (ALG) и глии (EG) ensheathing в neuropile регионах, глии ensheathing также связаны с Центральной аксона участки и периферической нервы (EGN) и, наконец, два листа, как ГЛИА, perineurial глии (PG) и subperineurial (SPG), которые вместе образуют непрерывный слой, который охватывает весь NS (рис. 2).

Предыдущие исследования показали, что глии играют важную роль в развитии НС; они контролировать число нейрональных клеток, реагируя на системно циркулирующих инсулин как пептиды, трофических оказывать нейронов, например экзоцитоз нейрон лактат шаттл и ликвидации умирающего нейронов фагоцитоза^{3,4 , 5 , 6}. в зрелых NS, глии поддерживать BBB, занимают нейротрансмиттеров и поддержания ионного гомеостаза, выступать в качестве основных иммунные клетки в НС, так как макрофаги не может нарушать BBB и модулировать синаптической активности, а также поведение животных^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

Ли различные подтипы глиальных выполняют специализированные функции, важный вопрос остается открытым. Однако систематический анализ генома общесистемной глии, особенно в взрослых, была затруднена отсутствием соответствующих генетических инструментов для их обработки. Здесь представлен метод, который позволяет легко и эффективно характеристика форм клеток для изучения взаимодействия сложных ячеек. Этот метод был применен к характеризуют морфология различные подтипы глиальных в мозге взрослого дрозофилы , но, в зависимости от конкретного драйвера GAL4 используются, могут быть адаптированы для изучения нейронов^12,13 , каких-либо смешения клеток и в принципе любой ткани в любой стадии развития.

1. Подготовка мух для экспериментов многоцветной FlpOut (MCFO)

Примечание: MCFO техника относится к модифицированную версию так называемые ФЛП опосредованной остановить кассету эксцизии (FlpOut). Трансгенные MCFO мух нести теплового шока промоутер (ХПП)-ФЛП рекомбиназа и различных журналистов под UAS управления. Каждый репортер состоит из общей основы myristoylated (myr) супер папку зеленого флуоресцентного белка (sfGFP), в котором 10 экземпляров тега epitope (например., HA, флага или V5) были вставлены. Результате не флуоресцентные белки называются " Макаронный Монстр КГВ " (smGFPs) ¹⁴ и может быть обнаружен с помощью специфических антител против теги различных эпитопов.

1. Крест летит с кассеты MCFO и hsp-Flp (hsp ФЛП; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) в соответствующие глиальных GAL4 драйвер линии (см. таблицу материалы) .
   1. Как hsp уже активна при 25 ° C и несколько клетки могут пройти рекомбинации, ведущих к неспецифическим маркировки, создан кресты на 18 ° C для того, чтобы избежать утечки системы. Подождите около 20 дней при 18 ° C для получения поколения F1. После теплового шока (см. шаг 2), поддерживать мух при 25 ° C ( рис. 3).

2. Тепловой удар

Примечание: в зависимости от вставки сайте, могут отличаться эффективностью hsp ФЛП; таким образом, оптимального теплового шока время должен быть оптимизирован. Для этого протокола, была использована MCFO летать запасов, в который был вставлен hsp ФЛП на Х-хромосоме (см. Таблицу материалы).

1. Передачи потомства Креста на этапе 1.1 (F1 поколения мух, 3-4 дней) в новых флаконах, содержащих продуктов питания и тепла шок их при 37 ° C на водяной бане.
   Примечание: Молодые мух (1-2 дней) очень чувствительны к теплового шока. Подождите 1 или 2 более дней перед выполнением теплового шока для того, чтобы снизить коэффициент смертности, вызванной лечения. Использование некоторых из поколения F1 летит как элемент управления, без теплового шока.
2. Во время теплового шока, поддерживать мух в обычных флаконах с пищей для того чтобы уменьшить стресс индуцированного смертность. Положите женщин и мужчин в отдельных флаконов.
3. Убедитесь погрузить весь флакон в воде для обеспечения однородной теплового шока. Использовать шок 5-8 мин в качестве подходящей отправной точкой для разреженных маркировки клеток глии с многими GAL4 драйвер линиями; шок продолжительность должны быть оптимизированы для каждого водителя и эксперимент (короче или длиннее теплового шока раз может потребоваться).
4. После теплового шока, заложить флаконы по горизонтали на скамейке на несколько минут для того, чтобы позволить мух, чтобы оправиться от теплового шока.
   Примечание: Это не нужно менять флаконы.
5. Поддерживать мух при 25 ° C и вскрыть (см. шаг 3 и 4) их 2 или более дней после теплового шока для оптимального репортер выражение.

3. Рассечение подготовки и решения

1. день рассечение, готовят свежие фиксирующие раствор в 200 мкл ПЦР трубы, смешивая 180 мкл S2 клеток питательной среды с 20 мкл 20% параформальдегида (PFA) для получения 2% раствор PFA. Поддерживать фиксирующие решение на льду до и во время вскрытия.
   Предупреждение: PFA токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
   Примечание: Смешать 160 мкл S2 клеток питательной среды с 40 мкл параформальдегида (PFA) 20% в 200 мкл ПЦР-пробирку для приготовления раствора PFA 4% вместо 2% раствор.
2. Использовать один ПЦР-пробирку на генотип с максимальной 8-10 мозги за трубки для получения оптимальных результатов окрашивание.
3. Подготовить взрослого мозга, моющего раствора: 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,5% X-100 Triton в PBS.
   Примечание: В зависимости от окраски, раствора, содержащего 1% тритон X-100 могут быть необходимы. Более высокую концентрацию Тритон X-100 увеличивает проникновение в ткани антитела, и это необходимо пятно регионов, которые лежат глубоко внутри ткани (например, синаптических областей в мозге взрослого дрозофилы).
4. Подготовить блокирующие решение: 3% нормальной козьего сыворотки, сыворотке нормальный осла 3% и 0,5% Тритон X-100 в PBS.
5. Взрослого мозга мытье решения и блокирования решения могут храниться при температуре 4 ° C на несколько недель.
6. Поставить глубокую депрессию скважинах стеклянной пластины на льду и заполнить каждый хорошо с следующие решения: один с 70% этанол, один с PBS и один с S2 клетки культуры среднего.

4. Взрослый мозг рассечение

1. 3 см, рассекает блюдо на сцене стереомикроскопом и заполнить его с холодной S2 клеток питательной среды. Проведение всех вскрытия в этой среде для обеспечения здоровой ткани во время процедуры рассечение.
   Примечание: Используйте рассечения блюдо, выстроились с несколькими миллиметрами черный силикона, который обеспечивает хороший фон контраст (в картинках) и сохранения щипцы во время вскрытия.
2. Анестезировать мух желаемого генотип с CO ₂.
3. С щипцами, захватить лету крылья и вымыть в холодной 70% этанол 30 сек, затем с холодной PBS для дополнительных 30 s.
4. Передачи лету в глубокую депрессию хорошо, которая заполняется с S2 клетки культуры среднего.
5. Повторить ту же процедуру для всех мух же генотипа и поддерживать их в холодной среде культуры клеток S2 до вскрытия, которое сохранит ткани.
   Примечание: Анестезировать только количество мух, которые могут расчлененный в период времени около 30 мин долго инкубационный раз в среде культуры клеток S2 может повредить ткани.
6. Захватить лету с щипцами и под стереомикроскопом, погрузите летать в среде культуры клеток S2.
7. Отсоедините головы от остальной части тела. Отказаться от тела и держать голову, погруженной в среде культуры клеток S2. Чрезвычайно важно провести голову с щипцами для всей продолжительности рассечение. Если голова начинает плавать, это будет трудно получить его без повреждения ткани.
8. Начинают рассечение, потянув один глаз, удерживая голову с по крайней мере один щипцы во все времена. Убедитесь, что кончик щипцы находится чуть ниже сетчатки, чтобы избежать повреждения тканей под. Вытяните другой глаз и начать удаление кутикулы, пока не появится мозга.
9. Удалить все ткани трахеи и кутикулы вокруг мозга до тех пор, пока ткань кажется чистой. Убедитесь в том удалить все трахеи ткани вокруг мозга для получения оптимальных результатов окрашивание; тканях теперь готовы быть фиксированной и витражные.
10. Поддерживать все расчлененных мозги в холодной S2 клетки культуры среднего перед передачей их в раствор PFA для того, чтобы время фиксации шаг.

5. Взрослый мозг окрашивание

6. Монтаж мозги для изображений

1. отделкой и изображений до соответствующего размера, используя ножницы. Для микроскопии высокого разрешения, сэндвич образца и томографии спейсера между двумя стекло coverslips.
   Примечание: Изображения прокладки являются тонкие (0.12 мм толщиной) клей распорки, которые корки и придерживаться стекла coverslips или Микроскоп слайды, позволяя монтажа образцов без компрессии.
2. С помощью щипцов, удалите клейкие подложку с одной поверхности и применять заполнитель, липкой стороной вниз, на поверхности стекла coverslip (22 мм х 60 мм). Применить 10 мкл монтажа среды к новой стекла coverslip.
3. Пипетку с P10, передать мозги из 200 мкл трубки coverslip, рядом с падение среднего монтажа. Вместе с ткани, передавать некоторые PBS для поддержания мозги в растворе.
4. Пипетку с P10, переместите мозги от PBS на падение среднего монтажа, пытаясь ограничить количество PBS. Передача образцов в среде монтажа на coverslip с изображений разделителя. Используйте достаточно монтажа СМИ для покрытия образца.
5. Удалить клей лайнер из верхней части распорку и добавить стакан coverslip поверх образцы. С наконечником щипцы приложите нежное давление над районом клей для уплотнения. Изображения монтируется ткани сразу или хранить слайды при температуре-20 ° C для последующего анализа.

7. Видеосъемка

1. приобретать стеки конфокальный флуоресценции изображений с помощью конфокального микроскопа с 40 X (NA = 1.2, погружения в воду) цель или 63 X (NA = 1.4, масло погружения) цель (размеры пикселей = 1 024 x 1 024 в плоскости xy; Расстояние между двумя секциями конфокальный = 0,5 мкм). Настроить детектор усиление и смещение в каждом канале, таким образом, что без насыщенных пикселей и нулевые значения пикселов присутствуют на изображениях; Это позволяет избежать потери информации и обеспечивает использование полный динамический диапазон детектора.
   Примечание: Поскольку 3D визуализации времени, измерения может быть автоматизирован путем сканирования нескольких образцов одновременно в разных местах. Чтобы избежать испарения с целью погружения воды, использовать специальное масло погружения среды с преломления n = 1,33.
2. Процесс конфокальный стеки для максимальной плотности прогнозов, изменения в канал оттенок и регулировка яркости и контрастности с помощью любого стандартного образа программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы).

Этот раздел иллюстрирует примеры результатов, которые могут быть получены с помощью метода MCFO в мозге взрослого дрозофилы . На рисунке 3 показана схема метода. Три по-разному мембраны тегами журналистов (myr-smGFP ха, myr-smGFP флаг и myr-smGFP-V5) под контролем UAS хранятся немого transcriptional Терминатор, окруженный двумя FRT мест (FRT-стоп FRT). Ударный импульс тепла Индуцирует экспрессию рекомбиназа ФЛП, который случайно удаляет FRT-стоп FRT кассеты в отдельных клетках. Это приводит к массив по-разному окрашенных клеток заданной ячейки типа, указанного в GAL4 драйвер, используемый.

В целом, семь цветов возможно. Рисунок 5 и Рисунок 4 показывают один морфологии клеток EG и ALG в доле усиков дрозофилы (AL), соответственно. Увеличение теплового шока время вызывает увеличение количества помеченных клеток, в зависимости от типа драйвера GAL4, поэтому необходим первоначальный оптимизации теплового шока протокола. На рисунке 6 показана маркировка EG в доле зрительного дрозофилы (OL) с одной MCFO журналистами.

Рисунок 1: Анатомия взрослых дрозофилы NS. Корковых регионов (пунктир серые области) содержат все нейронов и глиальных клеток органов, в то время как в neuropile регионах (синим цветом) содержат синаптических связей. Тракта регионов (синий) подключить различные neuropiles. Эта цифра была изменена от Кремер и др. (2017) 18. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: универсальный глиальных подтипы в дрозофилы ЦНС. Репортер мембраны тегами GFP (UAS-mCD8-GFP) обусловлен драйверам GAL4 позволяет визуализировать пяти универсальных глиальных подтипы (PG: perineurial глии, SPG: subperineurial глии, CG: коры глии, ALG: экзоцитоз как глии и EG: глии ensheathing). Регионы Нейропиль (пурпурный районы) обнаруживаются с пресинаптической маркер NC82 (BRUCHPILOT). В нижней части также отображаются на различные подтипы глиальных клеток. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: пересечение схема для метода MCFO. Схема MCFO техники. Homozygousvirgins кассета MCFO и hsp-Flp (hsp ФЛП; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) пересекается с конкретными гомозиготных мужчины драйвер GAL4. Поколения F1 будет шокирован тепла. По словам количество FRT-стоп FRT кассет, случайно удалены из репортеров возможны семь различных цветов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: морфология ensheathing глии (EG) в усиков доле (AL). Конфокальный z стеки дрозофилы Аль после wholemount иммуноокрашивания. (A) морфология Аль обнаружены с пресинаптической маркер NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Стохастические маркировки EGcells индуцированных увеличения теплового шока раз: 8 мин (B), 8.5 мин (C) и 10 мин (D). НАПРИМЕР взять на многих разных форм и размеров, как они ensheath поверхности AL. соседних например клетки покрытия различных областях, но частично interdigitate в регионах контакта. Шкалы бар = 20 мкм. HA: гемагглютинин человеческого гриппа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: морфология экзоцитоз как ГЛИА (ALG) в усиков доле (AL). Конфокальный z стеки дрозофилы Аль после wholemount иммуноокрашивания. (A) морфология Аль обнаружено Пресинаптический маркером NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Стохастические маркировки ALG клеток индуцированных увеличения теплового шока раз: 8 мин (B), 10 мин (C) и 15 мин (D). ALG шоу переменный размер и морфологии но охватывать основном неперекрывающиеся области. Шкалы бар = 20 мкм. HA: гемагглютинин человеческого гриппа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: морфология ensheathing глии (EG) в доле оптика (OL). Конфокальный z стеки дрозофилы OL после wholemount иммуноокрашивания. (A-C) MCFO маркировка с тремя журналистами стоп кассета с ха, флаг и V5 myr-smGFPs. ФЛП рекомбиназа было вызвано 10 мин теплового шока на 37 ° C. (A-C) Показаны отдельные MCFO репортеров и слияния (D). Шкалы бар = 20 мкм. HA: гемагглютинин человеческого гриппа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.