Method Article

Применение методики многоцветной FlpOut для изучения морфологии одноклеточного высокого разрешения и взаимодействия клеток глии в дрозофилы

DOI:

10.3791/56177

⸱

October 20th, 2017

 ,  ,  , 
1Gene Center and Department of Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки отображать различные морфологии и установить различные взаимодействия со своими соседями. Этот протокол описывает раскрыть морфология одиночных клеток и исследовать взаимодействия ячеек с помощью хорошо отлаженная система Gal4/Уан выражение.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ячейках отображаются различные морфологии и сложные анатомические взаимоотношения. Как клетки взаимодействуют с их соседями? Отличаются ли взаимодействие между типами клетки или даже в пределах данного типа? Какие виды пространственных правил они следуют? Ответы на такие фундаментальные вопросы в vivo пока сдерживаются отсутствием инструментов для маркировки одноклеточного высокого разрешения. Здесь приводится подробный протокол для одиночных клеток с техникой многоцветной FlpOut (MCFO). Этот метод опирается на три по-разному тегами Репортеры (HA, флаг и V5) под контролем UAS которые хранятся немого transcriptional Терминатор, окруженный двумя FRT мест (FRT-стоп FRT). Ударный импульс тепла Индуцирует экспрессию теплового шока индуцированной ФЛП рекомбиназа, который случайно удаляет FRT-стоп FRT кассеты в отдельных клетках: выражение происходит только в клетках, которые также express драйвер GAL4. Это приводит к массив по-разному окрашенных клеток типа ячейки, который позволяет визуализировать морфологии отдельных клеток с высоким разрешением. Например метод MCFO может сочетаться с драйверам глиальных GAL4 для визуализации морфологии различные подтипы глиальных в мозге взрослого дрозофилы .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глии, население не нейрональных клеток нервной системы (NS), давно считается статическим основу для нейронов и поэтому не были изучены в деталях. Однако в организме человека, глии составляют подавляющее большинство клеток в NS (~ 90%) и делятся на несколько различных категорий, в том числе астроциты, олигодендроциты, Микроглия и Шванновские клетки. У дрозофилыглии составляют около 10% ячеек в NS. Интригующе их морфологии и функции удивительно похожи на те, нашли в позвоночных1,2. Их морфологии включают гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) формирование эпителия, ensheathing и экзоцитоз подобных клеток.

Дрозофилы центральной нервной системы (ЦНС) состоит из следующих основных структур: области коры, которые содержат нейрональных клеток органов; neuropils, что гавань синаптических связей; аксон малые и большие участки, которые соединяют разные neuropiles; периферических нервов, которые связывают органы чувств и мышцы с ЦНС (рис. 1). Глии находятся связанные с все эти анатомические структуры: глии (CG) коры в кортикальной регионах, экзоцитоз как ГЛИА (ALG) и глии (EG) ensheathing в neuropile регионах, глии ensheathing также связаны с Центральной аксона участки и периферической нервы (EGN) и, наконец, два листа, как ГЛИА, perineurial глии (PG) и subperineurial (SPG), которые вместе образуют непрерывный слой, который охватывает весь NS (рис. 2).

Предыдущие исследования показали, что глии играют важную роль в развитии НС; они контролировать число нейрональных клеток, реагируя на системно циркулирующих инсулин как пептиды, трофических оказывать нейронов, например экзоцитоз нейрон лактат шаттл и ликвидации умирающего нейронов фагоцитоза3,4 , 5 , 6. в зрелых NS, глии поддерживать BBB, занимают нейротрансмиттеров и поддержания ионного гомеостаза, выступать в качестве основных иммунные клетки в НС, так как макрофаги не может нарушать BBB и модулировать синаптической активности, а также поведение животных6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.

Ли различные подтипы глиальных выполняют специализированные функции, важный вопрос остается открытым. Однако систематический анализ генома общесистемной глии, особенно в взрослых, была затруднена отсутствием соответствующих генетических инструментов для их обработки. Здесь представлен метод, который позволяет легко и эффективно характеристика форм клеток для изучения взаимодействия сложных ячеек. Этот метод был применен к характеризуют морфология различные подтипы глиальных в мозге взрослого дрозофилы , но, в зависимости от конкретного драйвера GAL4 используются, могут быть адаптированы для изучения нейронов12,13 , каких-либо смешения клеток и в принципе любой ткани в любой стадии развития.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка мух для экспериментов многоцветной FlpOut (MCFO)

Примечание: MCFO техника относится к модифицированную версию так называемые ФЛП опосредованной остановить кассету эксцизии (FlpOut). Трансгенные MCFO мух нести теплового шока промоутер (ХПП)-ФЛП рекомбиназа и различных журналистов под UAS управления. Каждый репортер состоит из общей основы myristoylated (myr) супер папку зеленого флуоресцентного белка (sfGFP), в котором 10 экземпляров тега epitope (например., HA, флага или V5) были вставлены. Результате не флуоресцентные белки называются " Макаронный Монстр КГВ " (smGFPs) 14 и может быть обнаружен с помощью специфических антител против теги различных эпитопов.

  1. Крест летит с кассеты MCFO и hsp-Flp (hsp ФЛП; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) в соответствующие глиальных GAL4 драйвер линии (см. таблицу материалы) .
    1. Как hsp уже активна при 25 ° C и несколько клетки могут пройти рекомбинации, ведущих к неспецифическим маркировки, создан кресты на 18 ° C для того, чтобы избежать утечки системы. Подождите около 20 дней при 18 ° C для получения поколения F1. После теплового шока (см. шаг 2), поддерживать мух при 25 ° C ( рис. 3).

2. Тепловой удар

Примечание: в зависимости от вставки сайте, могут отличаться эффективностью hsp ФЛП; таким образом, оптимального теплового шока время должен быть оптимизирован. Для этого протокола, была использована MCFO летать запасов, в который был вставлен hsp ФЛП на Х-хромосоме (см. Таблицу материалы).

  1. Передачи потомства Креста на этапе 1.1 (F1 поколения мух, 3-4 дней) в новых флаконах, содержащих продуктов питания и тепла шок их при 37 ° C на водяной бане.
    Примечание: Молодые мух (1-2 дней) очень чувствительны к теплового шока. Подождите 1 или 2 более дней перед выполнением теплового шока для того, чтобы снизить коэффициент смертности, вызванной лечения. Использование некоторых из поколения F1 летит как элемент управления, без теплового шока.
  2. Во время теплового шока, поддерживать мух в обычных флаконах с пищей для того чтобы уменьшить стресс индуцированного смертность. Положите женщин и мужчин в отдельных флаконов.
  3. Убедитесь погрузить весь флакон в воде для обеспечения однородной теплового шока. Использовать шок 5-8 мин в качестве подходящей отправной точкой для разреженных маркировки клеток глии с многими GAL4 драйвер линиями; шок продолжительность должны быть оптимизированы для каждого водителя и эксперимент (короче или длиннее теплового шока раз может потребоваться).
  4. После теплового шока, заложить флаконы по горизонтали на скамейке на несколько минут для того, чтобы позволить мух, чтобы оправиться от теплового шока.
    Примечание: Это не нужно менять флаконы.
  5. Поддерживать мух при 25 ° C и вскрыть (см. шаг 3 и 4) их 2 или более дней после теплового шока для оптимального репортер выражение.

3. Рассечение подготовки и решения

  1. день рассечение, готовят свежие фиксирующие раствор в 200 мкл ПЦР трубы, смешивая 180 мкл S2 клеток питательной среды с 20 мкл 20% параформальдегида (PFA) для получения 2% раствор PFA. Поддерживать фиксирующие решение на льду до и во время вскрытия.
    Предупреждение: PFA токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
    Примечание: Смешать 160 мкл S2 клеток питательной среды с 40 мкл параформальдегида (PFA) 20% в 200 мкл ПЦР-пробирку для приготовления раствора PFA 4% вместо 2% раствор.
  2. Использовать один ПЦР-пробирку на генотип с максимальной 8-10 мозги за трубки для получения оптимальных результатов окрашивание.
  3. Подготовить взрослого мозга, моющего раствора: 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,5% X-100 Triton в PBS.
    Примечание: В зависимости от окраски, раствора, содержащего 1% тритон X-100 могут быть необходимы. Более высокую концентрацию Тритон X-100 увеличивает проникновение в ткани антитела, и это необходимо пятно регионов, которые лежат глубоко внутри ткани (например, синаптических областей в мозге взрослого дрозофилы).
  4. Подготовить блокирующие решение: 3% нормальной козьего сыворотки, сыворотке нормальный осла 3% и 0,5% Тритон X-100 в PBS.
  5. Взрослого мозга мытье решения и блокирования решения могут храниться при температуре 4 ° C на несколько недель.
  6. Поставить глубокую депрессию скважинах стеклянной пластины на льду и заполнить каждый хорошо с следующие решения: один с 70% этанол, один с PBS и один с S2 клетки культуры среднего.

4. Взрослый мозг рассечение

  1. 3 см, рассекает блюдо на сцене стереомикроскопом и заполнить его с холодной S2 клеток питательной среды. Проведение всех вскрытия в этой среде для обеспечения здоровой ткани во время процедуры рассечение.
    Примечание: Используйте рассечения блюдо, выстроились с несколькими миллиметрами черный силикона, который обеспечивает хороший фон контраст (в картинках) и сохранения щипцы во время вскрытия.
  2. Анестезировать мух желаемого генотип с CO 2.
  3. С щипцами, захватить лету крылья и вымыть в холодной 70% этанол 30 сек, затем с холодной PBS для дополнительных 30 s.
  4. Передачи лету в глубокую депрессию хорошо, которая заполняется с S2 клетки культуры среднего.
  5. Повторить ту же процедуру для всех мух же генотипа и поддерживать их в холодной среде культуры клеток S2 до вскрытия, которое сохранит ткани.
    Примечание: Анестезировать только количество мух, которые могут расчлененный в период времени около 30 мин долго инкубационный раз в среде культуры клеток S2 может повредить ткани.
  6. Захватить лету с щипцами и под стереомикроскопом, погрузите летать в среде культуры клеток S2.
  7. Отсоедините головы от остальной части тела. Отказаться от тела и держать голову, погруженной в среде культуры клеток S2. Чрезвычайно важно провести голову с щипцами для всей продолжительности рассечение. Если голова начинает плавать, это будет трудно получить его без повреждения ткани.
  8. Начинают рассечение, потянув один глаз, удерживая голову с по крайней мере один щипцы во все времена. Убедитесь, что кончик щипцы находится чуть ниже сетчатки, чтобы избежать повреждения тканей под. Вытяните другой глаз и начать удаление кутикулы, пока не появится мозга.
  9. Удалить все ткани трахеи и кутикулы вокруг мозга до тех пор, пока ткань кажется чистой. Убедитесь в том удалить все трахеи ткани вокруг мозга для получения оптимальных результатов окрашивание; тканях теперь готовы быть фиксированной и витражные.
  10. Поддерживать все расчлененных мозги в холодной S2 клетки культуры среднего перед передачей их в раствор PFA для того, чтобы время фиксации шаг.

5. Взрослый мозг окрашивание

< ol>
  • Переноса изолированного мозга с пипеткой P10 в PFA решение при комнатной температуре (RT). Чтобы избежать повреждения тканей, никогда не используйте щипцы для передачи мозги после вскрытия. Выполните все шаги в 200 мкл ПЦР труб на nutator.
  • Для всех шагов, прежде чем выбросить старое решение с пипеткой P200, позволяют мозги, чтобы поселиться в нижней части трубки. Попробуйте удалить супернатант без аспирационных ткани. Защищать от воздействия света ткани.
  • Исправить мозги в 200 мкл 2% ПФА в S2 клетки культуры среднего за 1 ч или 4% PFA для 30 минут. Держать фиксации раз идентичные между выборками для увеличения воспроизводимость.
  • После 3 (или более) моет 15 минут в 200 мкл взрослого мозга моющего раствора, блокировать тканей с 200 мкл преграждая разрешение для 30 минут. Более длительное время инкубации в блокировании решение возможно.
  • Инкубировать мозги на ночь при 4 ° C с первичных антител, разбавленных в взрослого мозга моющего раствора в общем объеме 200 мкл.
    Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа используемых антитела. Длиннее инкубаций может быть необходимым.
    1. Для маркировки трех маркеров MCFO, инкубировать мозги с анти-Ха (1: 500), анти флаг (DYKDDDDK epitope) (1: 100) и первичных антител анти V5.
    2. Начальной непосредственно конъюгированных антител может использоваться вместо обычных первичной + вторичной комбинации (например., анти-V5:DyLight 549 (1: 200)). В этом случае лечить непосредственно конъюгированных антител как вторичные антитела.
      Примечание: Для каждого генотипа, держите мозги как элементы управления для проверки специфика окрашивания. Пропустить основное антитело инкубации и перейти напрямую к следующему шагу.
  • Стирать ткани 3 раза за 1 ч в 200 мкл взрослого мозга моющего раствора (шаг 3.3) и инкубировать их с вторичной Флюорофор конъюгаты/первичный непосредственно конъюгированных антител разводят в взрослого мозга моющего раствора на ночь в отеле 4 ° C или 4 h на RT, в общем объеме 200 мкл
    Примечание: примеры соответствующих антител: AlexaFluor 488 (1: 250), анти-V5:DyLight 549 (1: 200) и DyLight 647 (1: 100)-конъюгированных антител.
  • Промыть мозги 3 раза за 1 ч в 200 мкл взрослого мозга моющего раствора, после окончательного мыть в 200 мкл PBS на ночь при 4 ° C или 1-2 ч на RT; окончательной стирки шаг в PBS удаляет все следы Тритон X-100 и необходима для оптимальные результаты окрашивания. Смонтировать мозги в среде монтажа с агентом анти затухания на стекло coverslips.

    • 6. Монтаж мозги для изображений

    прокладка
    1. отделкой и изображений до соответствующего размера, используя ножницы. Для микроскопии высокого разрешения, сэндвич образца и томографии спейсера между двумя стекло coverslips.
      Примечание: Изображения прокладки являются тонкие (0.12 мм толщиной) клей распорки, которые корки и придерживаться стекла coverslips или Микроскоп слайды, позволяя монтажа образцов без компрессии.
    2. С помощью щипцов, удалите клейкие подложку с одной поверхности и применять заполнитель, липкой стороной вниз, на поверхности стекла coverslip (22 мм х 60 мм). Применить 10 мкл монтажа среды к новой стекла coverslip.
    3. Пипетку с P10, передать мозги из 200 мкл трубки coverslip, рядом с падение среднего монтажа. Вместе с ткани, передавать некоторые PBS для поддержания мозги в растворе.
    4. Пипетку с P10, переместите мозги от PBS на падение среднего монтажа, пытаясь ограничить количество PBS. Передача образцов в среде монтажа на coverslip с изображений разделителя. Используйте достаточно монтажа СМИ для покрытия образца.
    5. Удалить клей лайнер из верхней части распорку и добавить стакан coverslip поверх образцы. С наконечником щипцы приложите нежное давление над районом клей для уплотнения. Изображения монтируется ткани сразу или хранить слайды при температуре-20 ° C для последующего анализа.

    7. Видеосъемка

    1. приобретать стеки конфокальный флуоресценции изображений с помощью конфокального микроскопа с 40 X (NA = 1.2, погружения в воду) цель или 63 X (NA = 1.4, масло погружения) цель (размеры пикселей = 1 024 x 1 024 в плоскости xy; Расстояние между двумя секциями конфокальный = 0,5 мкм). Настроить детектор усиление и смещение в каждом канале, таким образом, что без насыщенных пикселей и нулевые значения пикселов присутствуют на изображениях; Это позволяет избежать потери информации и обеспечивает использование полный динамический диапазон детектора.
      Примечание: Поскольку 3D визуализации времени, измерения может быть автоматизирован путем сканирования нескольких образцов одновременно в разных местах. Чтобы избежать испарения с целью погружения воды, использовать специальное масло погружения среды с преломления n = 1,33.
    2. Процесс конфокальный стеки для максимальной плотности прогнозов, изменения в канал оттенок и регулировка яркости и контрастности с помощью любого стандартного образа программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Этот раздел иллюстрирует примеры результатов, которые могут быть получены с помощью метода MCFO в мозге взрослого дрозофилы . На рисунке 3 показана схема метода. Три по-разному мембраны тегами журналистов (myr-smGFP ха, myr-smGFP флаг и myr-smGFP-V5) под контролем UAS хранятся немого transcriptional Терминатор, окруженный двумя FRT мест (FRT-стоп FRT). Ударный импульс тепла Индуцирует экспрессию рекомбиназа ФЛП, который случайно уд...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Этот протокол описывает простой и эффективный метод для изучения морфологии различных типов клеток в ткани интерес с высоким разрешением. С MCFO техникой несколько репортеров с различных эпитопов Теги используются в сочетании для многоцветного стохастических маркировки (рис. 2). Как и другие методы, такие как Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO увеличивает лейбл разнообразия через маркер ИССЛЕДОВАНИџ, поз...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы благодарят Арним Jenett, Aljoscha Нёрн и другие члены Рубин лаборатории для консультаций и совместное использование неопубликованных реагентов и Janelia летать свет команде проекта для создания конфокальный изображений. Авторы также поблагодарить членов в Галлии лаборатории для комментариев на рукопись.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Водяная баняGrantGD100
    ПЦР пробиркиSarstedt72.737.002
    ЩипцыDumont11251-20
    Препарирующая чашка 30 мм x 12 ммЭлектронная микроскопия Sciences70543-30Стеклянная чашка для препарирования
    Pyrex 3 Стеклянная точечная пластинаCorning7223-34Стеклянные пластины для препарирования
    Sylgard BlackSYLGARD, Sigma-Aldrich805998домашнее приготовление с древесным углем
    ExpressFive S2 среда для культивирования клетокInvitrogen10486-025
    20% PFAЭлектронная микроскопия Sciences15713
    Triton X-100Roth3051.3
    Нормальная козья сывороткаJackson Laboratories005-000-121
    Нормальная Сыворотка ослаJackson Laboratories017-000-121
    Бычья сыворотка АльбуминSigmaA9647
    Кролик HA-tagCell SignalingC29F4Первичное антитело, разведение 1:500
    Крыса FLAG-tagNovus BiologicalsNBP1-06712Первичное антитело, разведение 1:100
    Мышь V5-метка: DyLight 549AdSerotec0411Конъюгированное антитело, разведение 1:200
    анти-кролик AlexaFluor 488InvitrogenA11034Вторичное антитело, разведение 1:250
    анти-крыса DyLight 647Jackson Laboratories712-605-153Вторичное антитело, разведение 1:100
    Vecta ShieldVector LaboratoriesH-1000
    SlowFate GoldInvitrogenS36937
    Secure Seal SpacerGrace BiolabsСвяжитесь с компанией для заказа
    покровного стекла микроскопа 22 X 60 ммMarienfeld101152
    Защитное стекло микроскопа 22 x 22 ммRothH874
    Стереомикроскоп, Leica MZ6Leica
    Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM710Zeiss
    ImmersolZeiss518 FИммерсионное масло для флуоресцентной микроскопии, не содержит галогенов
    ImmersolZeissW 2010Иммерсионная жидкость для водно-иммерсионных объективов, не содержит галогенов
    R56F03-GAL4 (EG)Bloomington Stock Center39157GAL4 драйвер
    R86E01-GAL4 (ALG)Bloomington Stock Center45914GAL4 драйвер
    hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5Bloomington Stock Center64085UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
    Fiji (Image J)Программное обеспечение для анализа изображений
    Multi Time MacroZeissSoftware для автоматизированного сканирования

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
    2. Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
    3. Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
    4. Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
    5. Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
    6. Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
    7. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
    8. Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
    9. Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
    10. Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
    11. Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
    12. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
    13. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
    14. Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
    15. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
    16. Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
    17. Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
    18. Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    MultiColor FlpOut TechniqueSingle Cell MorphologiesGlial Cell InteractionsDrosophila BrainHeat Shock InductionFLP RecombinaseUAS Control SystemGAL4 DriversEpitope Tag ReportersImmunofluorescence Staining

    Related Articles