Method Article

Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

DOI:

10.3791/56187

⸱

October 27th, 2017

 ,  , 
1Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой подход для анализа всей транскриптом от zebrafish эмбриона, личинки, или сортировка клеток. Мы включать изоляции РНК, путь анализа данных RNASeq и на основе ПЦР qRT Проверка изменения выражения гена.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ изменения выражения гена глобальных является ценным инструментом для выявления роман пути, лежащие в основе наблюдаемых фенотипов. Данио рерио является прекрасным примером для быстрой оценки всего транскриптом из всего животного или отдельных клеточных популяций из-за легкости изоляции RNA от большого количества животных. Здесь представлен протокол для анализа глобальных ген выражение в данио рерио эмбрионов, с помощью РНК последовательности (RNASeq). Мы описываем подготовка РНК из всей эмбрионов или клеточных популяций, полученные с помощью ячейку Сортировка в трансгенных животных. Мы также описать подход для анализа данных RNASeq для выявления обогащенного пути и онтология гена (GO) термины в наборах данных глобальной ген выражение. Наконец мы предоставляем протокол для проверки изменения выражения гена, с использованием количественных обратной транскриптазы ПЦР (qRT ПЦР). Эти протоколы может использоваться для сравнительного анализа, контроля и экспериментальных наборов данио рерио для определения изменения выражения гена Роман и обеспечить молекулярной понимание фенотипов интерес.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнительный анализ экспрессии генов глобальных является ценным инструментом для выявления роман гены способствуя наблюдаемых фенотипов. Такой анализ обычно полагаются на количественную оценку транскрипта изобилия по сравнению между экспериментальной и контроль образцов. Целевые подходы, такие как qRT ПЦР относительно быстрой и точной для исследования изменения выражения одного гена. РНК последовательности (RNASeq) предлагает широкий, гипотеза свободный подход к выявить значительные изменения в экспрессии генов между образцами, что делает его теперь стандарт для таких расследований экспериментальных систем.

Данио рерио стали известные моде....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

всех животных протоколы, изложенные ниже, в соответствии с и утверждена Университета Мэриленд институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC).

1. Подготовка эмбрионов

  1. Создание эмбрионов через природных спаривания
    1. культуры эмбрионов до 3 месяцев, репродуктивного зрелости 5 , 8 .
    2. Отделить взрослых мужчин и женщин рыб от нужного напряжения в разделенном спаривания танки вечером перед эмбриона коллекции и добавить 2 кобеля и 3 суки в каждой цистерне.
      Примечание: Использование штамма флуоресцентные репортер трансген....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сортировка дифференциально выразил генов:

Для выявления дифференциально выраженной генов в личиночной стадии данио рерио моделей Alström синдром и Синдром Барде-Бидля (BBS), мы ориентированы либо alms1 или bbs1 стенограммы путем инъекций ранее проверены сплайс блокирование MOs в одичал тип zebrafish эмбриона16,17. На 5 дней после оплодотворения (dpf), два .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подход, описанный в настоящем Протоколе предлагает сравнительно быстрое и экономически эффективные стратегии транскриптом уровень анализа всего животных или конкретных отсортированных клеточных популяций. Данио рерио обеспечивает модель выгодно для этот тип исследования из-за легкость и быстрота в генерации большого количества начиная материала, простота реализации генетических или экспериментальных условий окружающей среды и наличия большой спектр трансгенных репортер линий, позволяя для изоляции типа клеток конкретные .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) и T32DK098107 (T.L.H. и J.E.N.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильно>коммерческие реагенты
лизисный реагент
TrypLEGibco12604013буфер диссоциации 1
FACSMaxGenlantisT200100буфер диссоциации 2
вода, обработанная DEPC Sigma95284
FirstStrand конверсия кДНКThermo ScientificK1621набор для преобразования кДНК
2X SYBR Green Master MixRoche4707516001qRT-PCR Master Mix
FACS буферFisher Scientific50-105-9042
хлороформSigma Aldrich288306
ацетат натрияSigma AldrichS2889
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
Штаммы данио
TuebingenZIRCZL57
ins2a:mCherryZIRCZL1483
Name< strong>CompanyНомер в каталоге<strong>Комментарии
Оборудование40
трубка FACSBD Falcon352063
гемоцитометрSigmaZ359629
Препарирующий микроскопZeiss
NanodropThermo Scientific
Illumina HiSeqIllumina
LightCycler 480Roche
Брачные баки 1,0 л Crossing Tank SetAquaneeringZHCT100
FACS tube 5 мл полипропиленовая трубкаBD Falcon352063
НазваниеCompanyКаталожный номер>Комментарии
Software
Excel
Microsoft Consensus Path DBАнализ
GOhttp://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis
TriZol Thermo Scientific 15596026 микронный сетчатый фильтр Sigma CLS431750 Инвертированный микроскоп Zeiss обогащения http://cpdb.molgen.mpg.de/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  2. Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
  3. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish RNASeqGene Expression AnalysisRNA IsolationCell SortingqRT PCR ValidationPathway EnrichmentGO Term AnalysisDifferential ExpressionTranscriptome ProfilingEmbryo Staging

Related Articles