Протокол твердофазного синтеза олигомеров РНК, содержащий 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -тиофенилметильная модификация и характеризация с помощью циркулярного дихроизма

Andrew J. Francis; Marino J. E. Resendiz

doi:10.3791/56189

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Протокол твердофазного синтеза олигомеров РНК, содержащий 2'-

18.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56189

⸱

28 июля 2017 г.

Andrew J. Francis¹ , Marino J. E. Resendiz¹

¹Department of Chemistry, University of Colorado Denver

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлена подробная процедура твердофазного синтеза, очистки и характеризации додекамеров РНК, модифицированных при C2'- O -позиции. Фотометрический анализ методом ультрафиолетового и кругового дихроизма используется для количественной оценки и характеристики структурных аспектов, то есть одножильных или двухжильных.

Аннотация

Твердофазный синтез был использован для получения канонических и модифицированных полимеров нуклеиновых кислот, в частности ДНК или РНК, что сделало его популярной методологией для применений в различных областях и для различных исследовательских целей. Описанная здесь процедура фокусируется на синтезе, очистке и характеристике додекамеров РНК 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3', содержащих нулевую, одну или две модификации, расположенные на C2'- O -позиции. Зонды основаны на 2-тиофенилметильных группах, включенных в РНК-нуклеотиды посредством стандартного органического синтеза и вводимых в соответствующие олигонуклеотиды через их соответствующие фосфорамидиты. В этом отчете используется химия фосфорамидита через четыре канонические нуклеотиды (Uridine (U), Cytosine (C), гуанозин (G), аденозин (A)), а также 2-тиофенилметилфункциональные нуклеотиды, модифицированные на 2'- O- должность; Однако, эта методология применима к большому varКоторые были разработаны на протяжении многих лет. Олигонуклеотиды синтезировали на носителе с контролируемым поровым стеклом (CPG) с последующим отщеплением из смолы и снятием защиты в стандартных условиях, то есть смесью аммиака и метиламина (АМА) с последующим фторидом водорода / триэтиламином / N-метилпирролидиноном. Соответствующие олигонуклеотиды очищали с помощью полиакриламидного электрофореза (20% денатурации) с последующим элюированием, обессоливанием и выделением с помощью хроматографии с обращенной фазой (Sep-pak, C _18- column). Количественную оценку и структурные параметры оценивали с помощью ультрафиолетового (UV-vis) и кругового дихроизма (CD) фотометрического анализа, соответственно. Этот доклад призван служить в качестве ресурса и руководства для начинающих и экспертов-исследователей, заинтересованных в походах в эту область. Ожидается, что он будет работать в процессе разработки, поскольку будут разработаны новые технологии и методологии. Описание методологий и методов вS соответствует синтезу ДНК / РНК (восстановленному и приобретенному в 2013 году), который использует химию фосфорамидита.

Введение

Твердофазный синтез для получения олигонуклеотидов ДНК / РНК является мощным инструментом, который обслуживал несколько приложений в различных областях с 1970-х годов ¹ ^, ² ^, ³ с использованием блоков ⁴ фосфорамидита. Примеры его широкого влияние включают в себя: его воздействие в маркировке ( с помощью химии нажмите реакции) ^5, структурного зондирующее ⁶ и антисмысловые технологии ^7, а также его выяснение биологических механизмов ^{^8,}