Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK

24.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56191

⸱

9 августа 2017 г.

 ,  ,  , 
1UCLA Immunogenetics Center, Department of Pathology and Laboratory Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Здесь показан поток на основе цитометрии метод количественно определить цитотоксическую активность человека естественных клеток-киллеров.

Аннотация

В пределах иммунной системы эффекторные лимфоциты, известный как естественный убийца (НК) клетки играют важную роль в принимающей обороны против аберрантных клеток, специально устраняя опухолевых и вирусно зараженных клеток. Около 30 известных моногенных дефектов, наряду с множеством других патологических состояний, вызвать функциональные или классический NK клеток дефицит, проявляется в снижена или отсутствует цитотоксической активности. Исторически цитотоксичность исследована с радиоактивных методов, которые являются громоздкой, дорогостоящей и потенциально опасными. Эта статья описывает метод, основанный на цитометрии обтекаемый, клинически применимых потока для количественного определения цитотоксическую активность NK клеток. В этот assay мононуклеаров периферической крови (получения) или очищенного NK клеток препараты совместно инкубируют в различных соотношениях с целевой линии клеток опухоли, известный быть чувствительным к НК клеточный цитотоксичности (NKCC). Клетки-мишени предварительно помечены с Люминесцентную краску, чтобы позволить их дискриминацию с эффекторных клеток (НК-клеток). После инкубационного периода убитых целевых ячеек определяются по пятно нуклеиновой кислоты, который специально проникает мертвых клеток. Этот метод является поддаются как диагностических и исследовательских приложениях и, благодаря возможности Многопараметрический проточной цитометрии, имеет дополнительное преимущество, потенциально позволяя более глубокий анализ фенотипа NK клеток и функции.

Введение

Природные убийца (НК) клетки являются подмножеством сложные лимфоцитов человека врожденной критически участвующих в ликвидации вирусно зараженных клеток, трансформированных клеток и другие патогенные угроз 1,2. NK клеток литические гранулы дом цитотоксических белков, таких как Перфорины и granzymes. После активации НК-клетки образуют сложное взаимодействие с их целями, известный как иммунологический синапса, whereby эти цитолитических молекулы локально выпускаются, приводит к прямой целевой лизис клеток и апоптоз, вместе с цитокинов и хемокиновых релиз и в конечном итоге в индукции воспалительных состояние 1,3,4.

Активации клеток NK предполагает сложную строку активации и тормозящий взаимодействий между НК клеток рецепторов и лигандами, выраженные на поверхности клеток-мишеней, образуя жестко регулируемой системы. Одним из наиболее изученных механизмов активации клеток NK является «пропавших без вести себя». Действительно отсутствие определения класса, который я основной комплекс гистосовместимости (MHC), или человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) молекулы, на зараженных или преобразованы клетки триггеры NK клеток цитотоксичности. Опухоли и инфицированные вирусом клетки обычно помощью Эти антигены бежать T клеточный иммунитет, таким образом став основной NK клеток цели 1,3,4.

Оценка функции NK клеток главным образом разделить дегрануляции или цитотоксичности анализов. Однако дегрануляция анализов, например обнаружение потока гранулярных дегрануляции ассоциированного маркера CD107a, только ориентировочные активации НК клеток, а не их конечной функции, прямое убийство целевых ячеек 5,6,,78. Таким образом это ограничение было обращено следователи цитотоксичность анализов в качестве альтернативы более ярким и более прямой.

Долгое время «золотым стандартом» для оценки cell-mediated цитотоксическую активность T и NK клеток является пробирного выпуска хрома (CRA). CRA подразумевает радиоактивно маркировки целевых ячеек с 51Cr и совместно инкубации их с эффекторных клеток. Этот assay погружен в принципе, что лизис клеток приводит в выпуске белка прыгните 51Cr в надосадке, который может быть измерен путем подсчета гамма. Этот assay, время эффективным, является проблематичным для целого ряда причин: высокие затраты на материалы, обращения и утилизации радиоактивных 51Cr, спонтанное выпуск 51Cr и трудно стандартизации - что делает его совершенно непрактично 9,10.

С тех пор, был разработан ряд нерадиоактивные анализов, с участием люминесцентные маркировки, фермент релиз и даже биолюминесценции, как альтернативы CRA 11,12,,1314. Здесь мы описываем потока на основе цитометрии метод измерения NK клеток цитотоксической активности на клетки-мишени K562, простой, чувствительной и воспроизводимость. K562 клетки являются клетки человеческого erythroleukemic линии с сокращением выражение HLA класса I и повышенной выражение лигандов для activatory NK рецепторов, что делает их особенно подверженными НК клеточный цитотоксичность 15. В этот assay клетках K562 предварительно помечены Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира (CFSE) и совместно культивируемых в различных соотношениях с либо мононуклеаров периферической крови (получения) или очищенного NK клеток 1. CFSE является стабильной, связывание с белками Люминесцентную краску, которая позволяет дискриминацию клеток-мишеней от эффекторных NK клеток 16,17. После совместного инкубации пятно нуклеиновой кислоты, специально пронизывающей мембраны мертвых клеток, используется для идентификации погибших целевых клеток (см. таблицу материалов). Затем образцы приобретаются на проточный цитометр определить процент умерших (то есть, stain +) CFSE + клеток-мишеней.

Этот assay может использоваться как Рутинный скрининг диагностики для Моногенные дефектов, влияющих на отсеке NK клеток, которых насчитывается около 30 известных дефектов, вызывая функциональных или классический NK клеток дефицит, и первичный или вторичный гемофагоцитный лимфогистиоцитоз. Это также полезно для расследования НК-клеточной активности у больных с периодические, тяжелая герпеса вирусных инфекций, для оценки иммунного восстановления после трансплантации гемопоэтических клеток или пост иммуномодулирующей терапии 18,19,20и за целый ряд фундаментальных исследований приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы были собраны в соответствии с этическими принципами, установленными Программой защиты исследований человека Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и одобренными IRB.

1. Приготовление реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, все реагенты должны быть сбалансированы при комнатной температуре перед использованием. Все реагенты должны оставаться стерильными.

  1. Приготовьте 2-кратный рабочий раствор Tween-20 (т.е. 0,2%), добавив 10 мкл раствора Tween-20 к 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) без кальция и магния с помощью пипетки p20.
    1. Учитывая высокую вязкость Tween-20, примите следующие меры для обеспечения точности: собирайте медленно, чтобы избежать образования пузырьков, не погружайте весь наконечник, чтобы избежать переноса, и несколько раз пипетируйте вверх и вниз в PBS, чтобы смыть весь Tween-20 с наконечника.
  2. Добавьте 2 мкл стокового раствора IL-2 (2,1E6 МЕ/мл) к 198 мкл готовой среды (т.е. разведение 1:100), которая представляет собой RPMI с 1% пенициллин-стрептомицином и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), затем перейдите к дополнительному разведению 1:100, добавив 2 мкл промежуточного раствора IL-2 к 198 мкл готовой среды для получения 7x рабочего раствора (210 МЕ/мл).
  3. Добавьте 2 мкл стокового раствора CFSE (5 мМ) к 500 мкл простой среды (RPMI). Вортекс, отжимайте вниз, чтобы удалить капли с колпачка, затем продолжайте дополнительное разбавление 1:20, добавляя 50 мкл промежуточного раствора CFSE к 950 мкл простого RPMI, чтобы получить 2-кратный рабочий раствор 1 мкМ. Вортекс хорошо и храните в защищенном от света месте.

2. Выделение PBMC в качестве эффекторных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ был проверен на эффективность использования с общим количеством PBMC от здоровых контрольных групп. Тем не менее, рекомендуется проверять содержание NK-клеток с каждым препаратом PBMC (Рисунок 1). Кроме того, объем цельной крови для сбора основан на частоте NK-клеток в периферической цельной крови, и она может варьироваться от человека к человеку, особенно между здоровыми донорами и пациентами.

  1. Соберите не менее 4 мл цельной крови человека в пробирки для сбора крови с гепаринизацией натрия или лития. Храните образцы крови при комнатной температуре после сбора и используйте в течение 30 часов после сбора.
  2. Разбавьте цельную кровь 4 мл PBS (т.е. объем PBS равен объему цельной крови).
  3. Добавьте 4 мл раствора градиента плотности (см. таблицу материалов) в коническую пробирку объемом 15 мл. Тщательно наложите разбавленную цельную кровь на градиент плотности раствора, наклонив пробирку.
  4. Центрифугируйте при давлении 650 x g в течение 24 мин при выключенном тормозе.
  5. Аккуратно соберите слой мононуклеарных клеток, который представляет собой тонкий белый слой ниже верхнего слоя плазмы и тромбоцитов, в новую коническую трубку объемом 15 мл. Доведите объем до 15 мл с помощью PBS.
  6. Центрифугируйте при давлении 450 x g в течение 10 минут с включенным тормозом. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 0,5 мл полной среды.
  7. Используйте автоматический счетчик клеток или гемоцитометр для подсчета клеток и отрегулируйте концентрацию PBMC до 5x106 клеток/мл с полной средой.
  8. Проверьте содержание NK-клеток с помощью проточной цитометрии (см. шаг 4).
  9. Начните анализ в течение 30 мин. Держите клетки при комнатной температуре до 10 мин или поместите в увлажненный инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

3. Выделение NK-клеток в качестве эффекторных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола является альтернативой использованию общего количества PBMC в качестве эффекторных клеток. Типичный выход из 4 мл цельной крови здорового человека составляет примерно 4x105 NK-клеток, или примерно 5-15% PBMC, хотя эта частота варьируется у разных доноров 21. После изоляции рекомендуется провести проверку чистоты.

  1. Соберите не менее 4 мл цельной крови человека в пробирки для сбора крови с гепаринизацией натрия или лития. Возьмите 50 μл цельной крови для окрашивания в качестве образца для предварительного обогащения.
  2. Добавьте обогащающий коктейль в образцы крови в концентрации 50 мкл/мл (см. таблицу материалов). Хорошо перемешать и выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
  3. Добавьте равный объем PBS + 2% FBS, чтобы разбавить образец, и аккуратно перемешайте.
  4. Добавьте 4 мл раствора градиента плотности в коническую пробирку объемом 15 мл. Аккуратно наложите разведенный образец поверх градиентной среды плотности.
  5. Центрифуга при давлении 1 200 x g в течение 10 минут при выключенном тормозе.
  6. Аккуратно соберите слой обогащенных клеток в новую коническую трубку объемом 15 мл. Промойте ячейки, доведя объем до 50 мл с PBS + 2% FBS.
  7. Центрифугируйте при 300 х г в течение 10 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите промывку.
  8. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 0,5 мл полной среды.
  9. С помощью автоматического клеточного счетчика или гемоцитометра подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию до 5х105 клеток/мл. Возьмите 50 μл очищенной клеточной суспензии для окрашивания в качестве образца после обогащения.
  10. Камеры выдерживают при комнатной температуре до 10 минут или помещают в увлажненный инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C до готовности к использованию.

4. Иммунофенотипирование для оценки содержания NK-клеток

  1. Используя 50 мкл полностью выделенных PBMC, цельную кровь предварительного обогащения или очищенные NK-клетки, окрашивание анти-CD56 флуорохром-конъюгированным антителом в качестве маркера NK-клеток. Маркеры для других типов клеток и линий (т.е. CD3+ Т-клеток, CD19+ В-клеток) также могут быть включены для оценки происхождения контаминации, если таковая имеется.
  2. Инкубировать в течение 20 минут при температуре 4 °C и промыть, добавив 2 мл PBS + 2% FBS.
  3. Центрифугируйте при 450 х г в течение 5 мин.
  4. Для PBMC или NK-клеток аспирировать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 100 мкл PBS + 2% FBS.
  5. Для образцов цельной крови выполните лизис эритроцитов (эритроцитов):
    1. После центрифугирования аспирировать надосадочную жидкость и ресуспендировать в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (31,75 г хлорида аммония + 4,16 г трисового основания + 6,65 г ЭДТА, растворенных в 5000 мл деионизированной воды).
    2. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
    3. Повторите промывку дважды, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте лизированный образец в 100 мкл PBS + 2% FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лизис эритроцитов также может быть выполнен перед окрашиванием.
    4. Приступайте к проточному цитометрическому анализу.

5. Размораживание, культивирование и сбор клеток-мишеней K562

  1. Возьмите 10 мл готовой среды в коническую пробирку объемом 15 мл и дайте нагреться на водяной бане при температуре 37 °C. Для размораживания и культивирования клеток K562 используйте только среду, предварительно нагретую до 37 °C на всех этапах.
  2. Поместите один флакон замороженных клеток K562 в водяную баню при температуре 37 °C, пока большая его часть не оттает.
  3. Перенесите полуразмороженные элементы K562 в готовую среду, предварительно нагретую до 37 °C, в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте внутреннюю часть криогенного флакона предварительно подогретым средством и добавьте промывку в пробирку объемом 15 мл.
  4. Центрифугируйте при давлении 140 x g в течение 7 минут с включенным тормозом. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл готовой среды.
  5. Аликвотируйте соответствующее количество клеточной суспензии для подсчета клеток с помощью автоматического клеточного счетчика или гемоцитометра.
  6. Отрегулируйте концентрацию до 1x10, 5-2x10,5 клеток/мл и культивируйте в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 °C в течение не менее 2 дней перед использованием. Поддерживайте культуру в этом диапазоне плотности не более 3 месяцев, затем размораживайте новую аликвоту. Никогда не превышайте концентрацию клеток 1x106 клеток/мл в культуре.
  7. Для использования в анализе хорошо перемешайте культуру клеток K562 с серологической пипеткой объемом 10 мл и удалите аликвоту для подсчета и оценки жизнеспособности клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и окрашивания Trypan Blue.
    1. Если жизнеспособность составляет менее 85%, перейдите к следующим этапам удаления мертвых клеток.
      1. При необходимости добавьте 15 мл раствора градиента плотности в конические пробирки объемом 50 мл. Соберите все клетки из культуры и медленно наложите клеточную суспензию на раствор градиента плотности, наклонив трубку.
      2. Центрифугируйте при 650 x g в течение 24 мин с выключенным тормозом. Тщательно соберите слой живых клеток в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Доведите объем до 50 мл с помощью PBS.
      3. Центрифугируйте при давлении 450 x g в течение 10 минут с включенным тормозом. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл готовой среды. Подсчитайте клетки и проверьте жизнеспособность клеток (как в пункте 5.7).
      4. Культивировать в увлажненном инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C не менее 2 дней до использования.
  8. Соберите 5x105 K562 клеток-мишеней и центрифугируйте при 140 x g в течение 7 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 μл в среде с 1% FBS.

6. Маркировка клеток-мишеней K562

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что элементы K562 хорошо подвешены, прежде чем добавлять рабочий раствор CFSE.

  1. Пипетируйте 500 мкл рабочего раствора CFSE на 500 мкл клеток K562 до конечной концентрации 0,5 мкМ. Используя тот же наконечник объемом 1000-1250 мкл, немедленно перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз 3-5 раз.
  2. Инкубировать на водяной бане 37 °C или в увлажнённом инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при 37 °C в течение 10 минут в темноте><. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку время задержки температурного равновесия в инкубаторе больше по сравнению с водяной баней, может потребоваться корректировка времени инкубации, особенно для объемов > 1 мл.
  3. Погасить реакцию мечения 10 мл готовой среды в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
  4. Центрифугируйте меченые клетки K562 при давлении 140 x g в течение 7 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 1 мл готовой среды.
  5. Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и доведите концентрацию до 1x105 клеток/мл в полной среде.
  6. Поместите клетки во увлажненный инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Клетки можно хранить при комнатной температуре до 10 минут или во влажном инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Не хранить в холодильнике.

7. Покрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: Если NK-клетки ограничены, концентрация как K562, так и NK-клеток может быть уменьшена вдвое, так что половина клеток будет покрыта в анализе. Анализ дает сопоставимые результаты при вдвое меньшем количестве клеток (при условии, что соотношения остаются постоянными).

  1. При использовании общего количества PBMC пометьте 96-луночный U-образный планшет, обработанный культурой тканей, для следующих условий на лунку: (1) Эффектор (E) : мишень (T) = 50 : 1 + IL-2 - положительный контроль цитотоксичности NK-клеток; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12,5 : 1; (5) E : T = 6,25 : 1; (6) T - только клетки-мишени - отрицательный контроль для смерти K562; (7) E - только эффекторные клетки; (8) T + Tween - положительный контроль для смерти от K562
  2. При использовании очищенных NK-клеток пометьте 96-луночный U-образный планшет, обработанный культурой тканей, для следующих условий на лунку: (1) Эффектор (E) : мишень (T) = 5: 1 + IL-2 - положительный контроль цитотоксичности NK-клеток; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2,5 : 1; (4) E : T = 1,25 : 1; (5) E : T = 0,625: 1; (6) T - только клетки-мишени - отрицательный контроль для смерти K562; (7) E - только эффекторные клетки; (8) T + Tween - положительный контроль для смерти от K562
  3. Добавьте 100 мкл готового фильтрующего материала в условия 3, 4, 5, 6, 7. Для этого и всех последующих шагов (рекомендуется) использовать многоканальную пипетку.
  4. Добавьте 100 мкл эффекторных клеток (PBMCs при 5x106 клеток/мл или очищенных NK-клеток при 5x105 клеток/мл) в условия 1, 2, 3. Добавьте эффекторные ячейки для условий 4-7 путем последовательного разведения. Не меняйте чаевые от состояния к состоянию.
    1. Смешайте кондицию 3, возьмите 100 мкл и переложите в кондицию 4.
    2. Смешайте кондицию 4, возьмите 100 мкл и переложите в кондицию 5.
    3. Смешайте условие 5, возьмите 100 μл и переложите в состояние 7; Условие 6 не имеет эффекторных клеток.
  5. Добавьте 100 мкл приготовленного 2x 0,2% рабочего раствора Tween в условие 8 (конечная концентрация: 0,1% Tween-20); условие 8 не содержит эффекторных клеток.
  6. Добавьте 30 мкл рабочего раствора ИЛ-2 в условие 1. IL-2 следует добавлять в суспензию эффекторных клеток до добавления суспензии клеток-мишеней (конечная концентрация: 27 МЕ/мл).
  7. Добавьте 100 мкл клеток-мишеней (меченых K562 клеток при концентрации 1x105 клеток/мл) в условия 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. Условие 7 не имеет клеток-мишеней.
  8. Перемешайте все лунки с помощью многоканальной пипетки и центрифугируйте планшет при давлении 120 x g в течение 2 минут.
  9. Инкубировать в увлажненном инкубаторе CO2 при температуре 37 °C в течение 4 часов. В конце инкубации поместите пластину на лед и приступайте к окрашиванию на жизнеспособность в течение 30 минут.

8. Окрашивание для жизнеспособности и приобретения

  1. Приготовьте окрашивание от мертвых клеток (см. таблицу материалов), добавив 3 мкл стокового раствора 5 мкМ к 600 мкл PBS.
  2. Добавьте 50 мкл разбавленного красителя для мертвых клеток в каждую лунку до конечного объема 250 мкл и конечной концентрации 0,005 мкм. Хорошо перемешайте многоканальной пипеткой.
  3. Приступайте к проточному цитометрическому анализу. Используя проточный цитометр, соберите не менее 1000 событий в клеточном вороте-мишени (рисунок 2) для получения статистически значимых результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Перед настройкой assay, настоятельно рекомендуется, что содержимое ячейки НК оцениваться в населенности эффекторных выбора. На рисунке 1 показана типичная пятнать CD56 до (светло-голубой) и после (красный) НК клеток обогащения. НК-клетки составляют до 15% репликацию и должно быть по меньшей мере 80% чистого после обогащения.

Анализ потока гранулярных в этот assay включает обнаружение двух параметров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный здесь представляет собой простой и экономически альтернативу традиционной 51Cr релиз assay оценить активность цитотоксических клеток НК. Этот метод чувствительных, воспроизводимые и меньше времени, чем предыдущие стандартные методы, как АКБ и может использоваться для обоих клинических и исследований приложений.

В то время как assay работает с общей репликацию и обогащенного НК-клеток, возможность использовать репликацию без необходимости очистить клеточных популяций...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конфликты финансового интереса.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Джилл Narciso, иммуногенетики центр UCLA, за её помощь в подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатно-солевой буфер (1x, без Ca2+ и Mg2+)Corning (Cellgro)21-040-CM
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Tween-20SigmaBP337-100
RPMI 1640 MediaCorning (Cellgro)10-040-CV
Термоинактивированная фетальная бычья сывороткаOmega ScientificFB-02
Пенициллин СтрептомицинLife Technologies15140-163Стоковый раствор при концентрации 10 000 Ед/мл
IL-2R& D Systems202-IL-050Лиофилизация из 0,2 μ m фильтрованный раствор в ацетонитриле и ТФК с БСА в качестве белка-переносчика. Восстановите 500 мкл при 100 μ г/мл в стерильных 100 мМ уксусной кислоте, содержащей не менее 0,1% бычьего сывороточного альбумина (2,1x10E6 МЕ/мл)
K562 КлеткиATCCCCL-243Линия раковых клеток 
Колбы для клеточных культур T-75Corning431464
CFSE набор для пролиферации клетокLife Technologies (CellTrace)C34554Rerecover I флакон с 18 мкл ДМСО для приготовления стокового раствора 5 мМ. Не замораживать/размораживать.
Решение Sytox RedLife TechnologiesS34859Stock предоставляется по адресу 5 μ М в 1 мл ДМСО. Раствор ДМСО может быть подвергнут многократным циклам замораживания-размораживания без деградации реагента.
Пробирки для забора крови с гепарином натрия/литияBD02-687-95
U-образное дно 96-луночная пластинаCorningCLS3897
серологические пипеткиBD Falcon
Полистирольные пробирки с круглым дном (5 мл)BD Falcon14959-5
50 мл полипропиленовая коническая трубкаBD Falcon352070
15 мл полипропиленовая коническая трубкаBD Falcon352097
Резервуар для реагентовСША Scientific2321-2230
Коктейль для обогащения NK-клеток человекаStemCell Technologies (RosetteSep)15065

Ссылки

  1. Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  4. Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
  5. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
  6. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).
  7. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  8. Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
  9. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  10. Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
  12. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  13. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357(2014).
  14. Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
  15. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
  16. Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
  17. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
  18. Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152(2016).
  19. Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
  20. Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578(2015).
  21. Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
  22. Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
  23. Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
  24. Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1(2015).
  25. Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was updated from:

Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death.

to:

Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis.

Теги

K562
На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.