Здесь показан поток на основе цитометрии метод количественно определить цитотоксическую активность человека естественных клеток-киллеров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
В пределах иммунной системы эффекторные лимфоциты, известный как естественный убийца (НК) клетки играют важную роль в принимающей обороны против аберрантных клеток, специально устраняя опухолевых и вирусно зараженных клеток. Около 30 известных моногенных дефектов, наряду с множеством других патологических состояний, вызвать функциональные или классический NK клеток дефицит, проявляется в снижена или отсутствует цитотоксической активности. Исторически цитотоксичность исследована с радиоактивных методов, которые являются громоздкой, дорогостоящей и потенциально опасными. Эта статья описывает метод, основанный на цитометрии обтекаемый, клинически применимых потока для количественного определения цитотоксическую активность NK клеток. В этот assay мононуклеаров периферической крови (получения) или очищенного NK клеток препараты совместно инкубируют в различных соотношениях с целевой линии клеток опухоли, известный быть чувствительным к НК клеточный цитотоксичности (NKCC). Клетки-мишени предварительно помечены с Люминесцентную краску, чтобы позволить их дискриминацию с эффекторных клеток (НК-клеток). После инкубационного периода убитых целевых ячеек определяются по пятно нуклеиновой кислоты, который специально проникает мертвых клеток. Этот метод является поддаются как диагностических и исследовательских приложениях и, благодаря возможности Многопараметрический проточной цитометрии, имеет дополнительное преимущество, потенциально позволяя более глубокий анализ фенотипа NK клеток и функции.
Введение
Природные убийца (НК) клетки являются подмножеством сложные лимфоцитов человека врожденной критически участвующих в ликвидации вирусно зараженных клеток, трансформированных клеток и другие патогенные угроз 1,2. NK клеток литические гранулы дом цитотоксических белков, таких как Перфорины и granzymes. После активации НК-клетки образуют сложное взаимодействие с их целями, известный как иммунологический синапса, whereby эти цитолитических молекулы локально выпускаются, приводит к прямой целевой лизис клеток и апоптоз, вместе с цитокинов и хемокиновых релиз и в конечном итоге в индукции воспалительных состояние
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Образцы были собраны в соответствии с этическими принципами, установленными Программой защиты исследований человека Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и одобренными IRB.
1. Приготовление реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, все реагенты должны быть сбалансированы при комнатной температуре перед использованием. Все реагенты должны оставаться стерильными.
- Приготовьте 2-кратный рабочий раствор Tween-20 (т.е. 0,2%), добавив 10 мкл раствора Tween-20 к 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) без кальция и магния с помощью пипетки p20.
- Учитывая высокую вязкость Tween-20, примите след....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перед настройкой assay, настоятельно рекомендуется, что содержимое ячейки НК оцениваться в населенности эффекторных выбора. На рисунке 1 показана типичная пятнать CD56 до (светло-голубой) и после (красный) НК клеток обогащения. НК-клетки составляют до 15% репликацию и должно быть по меньшей мере 80% чистого после обогащения.
Анализ потока гранулярных в этот assay включает обнаружение двух параметров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, описанный здесь представляет собой простой и экономически альтернативу традиционной 51Cr релиз assay оценить активность цитотоксических клеток НК. Этот метод чувствительных, воспроизводимые и меньше времени, чем предыдущие стандартные методы, как АКБ и может использоваться для обоих клинических и исследований приложений.
В то время как assay работает с общей репликацию и обогащенного НК-клеток, возможность использовать репликацию без необходимости очистить клеточных популяций.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют не конфликты финансового интереса.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Джилл Narciso, иммуногенетики центр UCLA, за её помощь в подготовке рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фосфатно-солевой буфер (1x, без Ca2+ и Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Термоинактивированная фетальная бычья сыворотка | Omega Scientific | FB-02 | |
| Пенициллин Стрептомицин | Life Technologies | 15140-163 | Стоковый раствор при концентрации 10 000 Ед/мл |
| IL-2 | R& D Systems | 202-IL-050 | Лиофилизация из 0,2 μ m фильтрованный раствор в ацетонитриле и ТФК с БСА в качестве белка-переносчика. Восстановите 500 мкл при 100 μ г/мл в стерильных 100 мМ уксусной кислоте, содержащей не менее 0,1% бычьего сывороточного альбумина (2,1x10E6 МЕ/мл) |
| K562 Клетки | ATCC | CCL-243 | Линия раковых клеток |
| Колбы для клеточных культур T-75 | Corning | 431464 | |
| CFSE набор для пролиферации клеток | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Rerecover I флакон с 18 мкл ДМСО для приготовления стокового раствора 5 мМ. Не замораживать/размораживать. |
| Решение Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock предоставляется по адресу 5 μ М в 1 мл ДМСО. Раствор ДМСО может быть подвергнут многократным циклам замораживания-размораживания без деградации реагента. |
| Пробирки для забора крови с гепарином натрия/лития | BD | 02-687-95 | |
| U-образное дно 96-луночная пластина | Corning | CLS3897 | |
| серологические пипетки | BD Falcon | ||
| Полистирольные пробирки с круглым дном (5 мл) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 мл полипропиленовая коническая трубка | BD Falcon | 352070 | |
| 15 мл полипропиленовая коническая трубка | BD Falcon | 352097 | |
| Резервуар для реагентов | США Scientific | 2321-2230 | |
| Коктейль для обогащения NK-клеток человека | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Ссылки
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
