Цель настоящего Протокола заключается в изменить пенетрантностью смертоносных скелетных мутант фенотипы в zebrafish путем селекции. Смертельной Мутанты не может быть выращен до совершеннолетия и разводят сами, поэтому этот протокол описывает метод для отслеживания и выбирая пенетрантностью через несколько поколений потомства тестирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сдвигая данио рерио смертоносных скелетных мутант пенетрантностью потомства тестирование
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Zebrafish мутант фенотипов часто неполно капиллярный, только проявляется в некоторых мутантов. Интересно фенотипов, отображаются непоследовательно может быть трудным для изучения и может привести к смешанным результатам. Протокол, описанные здесь это просто разводить парадигма для увеличения и уменьшения пенетрантностью в смертельной данио рерио скелетных мутантов. Потому что напрямую нельзя выборочно разводили смертоносных мутантов, используется классический селекции стратегия тестирования потомства. Этот метод также включает протоколы для Kompetitive аллеля конкретного ПЦР (KASP) генотипирования данио рерио и окрашивание личиночной данио рерио хряща и кости. Применение стратегии земледелия, описанные здесь может увеличить пенетрантностью интересные скелетных фенотип, позволяя более воспроизводимые результаты в нисходящие приложения. Кроме того уменьшение мутант пенетрантностью через эту стратегию селекции может выявить процессы развития, которые наиболее критически требуют функции мутировавших генов. В то время как скелет конкретно рассматривается здесь, мы предлагаем, что эта методология будет полезным для всех zebrafish мутант линий.
Введение
Данио рерио — это система мощная модель для понимания развития скелета. Штаммами zebrafish мутант биологи могут расшифровать функции гена во время skeletogenesis. Данио рерио скелетных мутант фенотипов может представлять, с переменной пенетрантностью2,1,3,4 , которые могут препятствовать развития и генетические анализы. Назначение этого метода в три раза. Во-первых генерации zebrafish мутант линии, которые постоянно производить серьезные фенотипов позволяет течению развития исследований как покадровой записи5 и трансп....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
все эксперименты, описанные в настоящем протоколе были завершены в соответствии и соблюдение в университете Колорадо и университета Орегон институциональный уход животных и использование комитетов (IACUC).
1. Подготовка невыбранном начиная фондовая
- определить гетерозиготных носителей аллеля мутанта интереса плавник клип 11 и генотипирования запас полный родственных животных методом выбора, таких как KASP 12 , , 13 14. Этот протокол был проведен с данио рерио штамм mef2ca b1086.
- <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол является долгосрочной животноводства техника полезна для понимания данио рерио скелетных мутантов (рис. 1). Селективный разводить потомство тестирования должна принести сдвиг в общем пенетрантностью вниз и вверх в несколько поколений (рис. 2). В нашей предыдущей работы два раунда селекции вынудили средняя пенетрантностью вниз от 17% до 3%1. Аналогичным образом в нашей линии вверх, мы перешли .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Селекция раскрывает тонкости функции гена
Переход мутант фенотипов быть более или менее серьезные по селекции является простым способом получить новое понимание функции гена. По сравнению со стандартными методами невыбранном селекции, протокола, представленные здесь может принести гораздо более полного понимания мутант фенотипов. Конкретно создавая штаммов, которые являются серьезными, полная ширина мутант фенотипов могут быть выявлены, включая некоторые, которые были ненаблюд.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Чак Kimmel для руководства, Джон Dowd за помощь в разработке этой стратегии разведения, Macie Walker для ее работы в области совершенствования скелетных пятно и Charline Уокер и Бонни Ullmann для данио рерио полезные советы. Эта работа была поддержана K99/R00 DE024190 к JTN.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Параформальдегид, гранулированный, твердый | Ted Pella Co. | 18501 | Гранулированный PFA является более безопасной альтернативой порошкообразному PFA |
| Магния Хлорид, твердый | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, водный | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Этанол | |||
| Alcian Blue, твердый | Anatech Ltd. | 867 | Должен быть из Anatech |
| Alizarin Red, твердый | Sigma | A5533-25G | |
| Глицерин, жидкий | Fisher | BP229 1 | |
| Перекись водорода, жидкий | Fisher | BP263500 | |
| Гидроксид калия, твердый | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Машина для ПЦР в реальном времени | Прикладные биосистемы | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-луночный реакционный планшет со штрих-кодом (0,1 мл) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, твердый | Fisher | BP153 500 | |
| хлорид калия, твердый | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, жидкий | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| трикаин-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Термоамплификатор | BioRad | 1861096 | |
| контролируемой каплей Пастера Пипетец | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop ThermoFisher | для количественного определения ДНК |
Ссылки
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
