Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сдвигая данио рерио смертоносных скелетных мутант пенетрантностью потомства тестирование

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56200

⸱

1 сентября 2017 г.

 , 
1Department of Craniofacial Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

В этой статье

Краткое содержание

Цель настоящего Протокола заключается в изменить пенетрантностью смертоносных скелетных мутант фенотипы в zebrafish путем селекции. Смертельной Мутанты не может быть выращен до совершеннолетия и разводят сами, поэтому этот протокол описывает метод для отслеживания и выбирая пенетрантностью через несколько поколений потомства тестирования.

Аннотация

Zebrafish мутант фенотипов часто неполно капиллярный, только проявляется в некоторых мутантов. Интересно фенотипов, отображаются непоследовательно может быть трудным для изучения и может привести к смешанным результатам. Протокол, описанные здесь это просто разводить парадигма для увеличения и уменьшения пенетрантностью в смертельной данио рерио скелетных мутантов. Потому что напрямую нельзя выборочно разводили смертоносных мутантов, используется классический селекции стратегия тестирования потомства. Этот метод также включает протоколы для Kompetitive аллеля конкретного ПЦР (KASP) генотипирования данио рерио и окрашивание личиночной данио рерио хряща и кости. Применение стратегии земледелия, описанные здесь может увеличить пенетрантностью интересные скелетных фенотип, позволяя более воспроизводимые результаты в нисходящие приложения. Кроме того уменьшение мутант пенетрантностью через эту стратегию селекции может выявить процессы развития, которые наиболее критически требуют функции мутировавших генов. В то время как скелет конкретно рассматривается здесь, мы предлагаем, что эта методология будет полезным для всех zebrafish мутант линий.

Введение

Данио рерио — это система мощная модель для понимания развития скелета. Штаммами zebrafish мутант биологи могут расшифровать функции гена во время skeletogenesis. Данио рерио скелетных мутант фенотипов может представлять, с переменной пенетрантностью2,1,3,4 , которые могут препятствовать развития и генетические анализы. Назначение этого метода в три раза. Во-первых генерации zebrafish мутант линии, которые постоянно производить серьезные фенотипов позволяет течению развития исследований как покадровой записи5 и трансплантации6. Эти виды исследований могут калекой, пытаясь изучить фенотипов, которые только манифест непоследовательно. Во-вторых инбридинг данио рерио штаммы могут уменьшить вариации генетический фон, содействуя тем самым экспериментальной согласованность и воспроизводимость. Например выполняя все на месте гибридизации анализы на одном выборочно инбредных деформации может уменьшить накладывающееся изменчивости и укреплять выводы. В-третьих генерации тяжелой и легкой штаммов покажет весь фенотипические серии, которая может быть результатом конкретной мутации.

На первый взгляд селекция смертоносных мутантов кажется невозможным. Как может одна порода для пенетрантностью когда мертвых животных, которые подсчитываются для отбора? К счастью методы селекции семьи выбор, специально потомства тестирования, продемонстрировали эффективность животноводства программы для многих лет7,8. Эти программы используются главным образом для селекционных признаков, которые присутствуют только в одном сексе, как производство молока коров или производство яиц в кур. Самцов этих видов не забил непосредственно, но забил их потомства и значение затем назначается для родителей. Заимствование из этой стратегии, протокола, представленные здесь включает озвучивание фиксированной и окрашенных мутант потомство от пары данио рерио, гетерозиготных для мутантного гена интереса. Пенетрантностью фенотип в гомозиготной смертоносных мутантов потомство назначается родителям при принятии решения, какие лица будет производить следующее поколение в линии. Мы считаем, что этот метод является эффективным средством перехода пенетрантностью в zebrafish смертоносных мутантов скелетных1.

Аналогично для других исследований, этот протокол селекции принимает под рассмотрение критериев, как размер сцепления, выживание потомства, нормальное развитие эмбрионов и соотношение полов9. Однако эти факторы считаются в контексте мутант фона с целью перехода мутант пенетрантностью. Таким образом этот протокол расширяет предыдущий селекции парадигмы, предлагая метод для укрепления развития мутант анализов, а также повышения однородности фона.

Этот протокол требует обширных генотипирования, поэтому важно заранее разработать надежный, быстрый генотипирования протокол. Существует много генотипирования протоколов доступна в10,11, однако мы находим KASP генотипирования12,,1314 стоимость быстрее, более эффективным и более надежным, чем методы на основе энзима ограничения расщепления усиливается последовательности10. Таким образом мы включать KASP протокол в этой работе. Кроме того мы ориентируемся на скелетные мутант фенотипы в этом протоколе и включать процедуры для Альциановый синий/ализарин красный пятнать изменение от предыдущих протоколов15.

Метод, описанный здесь является простой стратегией для смещения смертоносных мутантов пенетрантностью, вверх или вниз. Хотя этот протокол посвящен скелетных мутант фенотипов, мы считаем, что она будет полезной стратегией для земледелия всех мутантов данио рерио линий. В самом деле полезность этой стратегии разведения вероятно, выходит за рамки данио рерио. Мы прогнозируем, что этот протокол может быть изменено перенести пенетрантностью в широком диапазоне организмов. Сдвигая смертоносных пенетрантностью потомства тестирование может помочь продвигать прогресс любого развития генетик.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

все эксперименты, описанные в настоящем протоколе были завершены в соответствии и соблюдение в университете Колорадо и университета Орегон институциональный уход животных и использование комитетов (IACUC).

1. Подготовка невыбранном начиная фондовая

  1. определить гетерозиготных носителей аллеля мутанта интереса плавник клип 11 и генотипирования запас полный родственных животных методом выбора, таких как KASP 12 , , 13 14. Этот протокол был проведен с данио рерио штамм mef2ca b1086.
  2. Генотипирования KASP
    Примечание: Аллеля конкретных Праймеры для KASP разработаны компанией, которая предоставляет реагентов (см. Таблицу материалы). Для получения соответствующей концентрации красителя (ROX) 6-карбоксильной X-родамин для конкретных машины ПЦР в реальном времени посетите веб-сайт компании.
    1. Место данио рерио хвост ткани в 50 мкл буфера lysis (10 мм трис (рН 8.3), 50 мм KCl, MgCl 1,5 мм 2, 0,3% неионные ПАВ, 0,3% Octylphenyl полиэтилен гликоль). Добавьте 10 мкл 10 мг/мл протеиназы K в колодец 96-луночных ПЦР пластины и дайджест в тепловой циклователь на 55 ° C для 2-5 ч, последовал шаг инактивации 94 ° C 20 мин. Охладите лизис продукт после переваривания.
      Примечание: Lysis продукция успешно может использоваться для нескольких месяцев после подготовки. Когда ткань была анализироваться с использованием 50 мм NaOH, KASP реакции были неудачными. Эти результаты показывают, что метод NaOH геномной ДНК подготовки не совместим с KASP.
    2. Количественно геномной ДНК с помощью спектрофотометра. Разбавить геномной ДНК шаблон с помощью молекулярной биологии класса воды, так что каждая реакция содержит приблизительно 20-30 нг.
      Примечание: Количественно 4 или 5 образцов, объединить их, а затем подготовить разведениях для всех образцов, основываясь на среднем. При использовании данного протокола для взрослых хвост ткани, достаточно часто разбавления 1: 100. Не требуется точное количественное определение концентрации ДНК.
    3. Добавить 0,14 мкл KASP грунт смешать и 5 мкл KASP мастер смесь на сэмпл на льду в пробки microcentrifuge 1,5 мл и перемешать хорошо прежде чем кратко центрифугирования собирать содержимое в нижней части трубки.
      Примечание: KASP мастер смесь тепла и света чувствительных, сохранить запас на льду и избегать прямого света.
    4. 5 Накапайте µL грунт/мастер смешать раствор в колодцы 96-луночных оптические пластины ПЦР подходит для реального времени ПЦР машины используются.
    5. 5 Накапайте µL из разбавленной (примерно 5-7 нг/мкл) шаблона образцы ДНК в каждой хорошо и аспирационная с пипеткой смешивать.
    6. Добавить 5 мкл нуклеиназы свободной воды 3 скважины служить без шаблон элементов управления (НПС) и 5 мкл разбавленного подтвержденных гомозиготных дикого типа, гетерозиготной и гомозиготных мутант ДНК шаблон для положительных элементов управления.
    7. Место уплотнение оптически прозрачная пленка над пластины, обеспечивая, что фильм полностью герметичный на каждой скважине.
    8. Кратко центрифуга пластину на 600 x g собирать содержимое в нижней части и удалить пузырьки от mix.
      Примечание: Держать пластину на льду и щит от света до готовности продолжить.
    9. Использовать Велоспорт программы, показаны в таблице 1 для выполнения основной реакции KASP.
    10. Посмотреть результирующий точечная, производимые на компьютере анализа. Успешный реакции покажет 4 различных групп точек на участке ( рис. 3): три образца группировки соответствующих генотип и одна группировка фнт вблизи начала координат. Положительные элементы управления должны отделить с соответствующий образец группировки.
    11. Если компьютерная программа не распознает сюжет, что группировки как отвечающее специфическим генотипам, дополнительные Велоспорт наборы могут быть необходимы (Таблица 2). Повторите дополнительной программы, до тех пор, пока компьютер распознает жесткие группировок от генотипа.
    12. Экспортируется файл электронной таблицы для упрощения использования и анализа результатов генотипирования.
  3. Дом выявленных гетерозиготных животных вместе на основной системе воды.

2. Первый раунд из потомства забил

  1. , попарно крест брат heterozygotes
    1. после того, как животные оправиться от клип ребра, настроить попарном intercrosses. Использовать разделители для обеспечения эмбрионов синхронные 16.
    2. Собирать эмбрионы и держать родительских пар, изолированных в разведении клетки.
    3. Мониторинг отдельных взрослых так, что агрессивные рыбы могут быть разделены или с крышкой (кусочки рыбы сетки работу красиво). Следует кормить рыб и их воды изменено после IACUC рекомендации в статического воды.
  2. Зародыш воспитания
    1. стадии и поднять данио рерио эмбрионов для личинок под стандартные условия 17.
    2. Собирать фенотипически одичал тип животных с помощью стеклянной пипетки на день 5 или 6, когда надувается пузырь в 75% сцепления. Место фенотипические диких видов в питомнике, записи о которых родители принесли им.
      Примечание: С мутантных аллелей, которые рецессивный смертоносное, которая касается многих скелетных мутантов, гомозиготных мутанты не формы плавательные пузыри 18 , 19. Таким образом, фенотипические диких типов можно легко различить от их мутантов братьев и сестер, основаны на завышенных плавательные пузыри.
  3. Альциановый синий/ализарин красный хряща и кости окрашивание
    1. анестезировать личинки, которые не раздувать их плавательные пузыри с помощью 0,17 г/Л Tricaine-S в средствах массовой информации эмбриона. Соберите животных в 1,5 мл microcentrifuge пробирки с бокалом широкий родила Pasteur накапайте. Добавить не более чем 100 личинок за трубку.
    2. Удаление воды эмбриона из каждой трубки и исправить животных в 1 мл 2% параформальдегида в однократном ПБС в трубку.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Водный PFA горючих и вызовет серьезные раздражения кожи и глаз. Носить надлежащие средства личной защиты, таких как перчатки и средства защиты глаз и тщательно мыть руки после использования.
    3. Рок-за 1 ч; больше фиксации ухудшает кости пятнать. Проверить трубы регулярно в этот и все последующие качания шаги для обеспечения не личинки стали застрял в сторону или сгруппировать в нижней части трубки.
    4. Снимите фиксатор из труб с помощью стеклянной пипетки, добавляют 1 мл 50% этанола, и рок на 10 мин
    5. Подготовьте свежие окраски раствора путем добавления 20 мкл 0,5% премикс ализарин красный на 1 мл Альциановый (0,04% Альциановый синий/10 мм MgCl 2 / 80% этанола). Удаление 50% этанола, добавляют 1 мл пятнать решение каждой трубки и рок ночь. Личинки могут оставаться в пятно на срок до 5 дней.
    6. Удалить пятно решение из трубы и добавьте 1 mL 80% этанола/10 мм MgCl 2 решения для каждой трубы. Рок-трубы для по крайней мере 1 ч; ополаскивание ночь может произвести четкое пятно Альциановый синий.
    7. Удаление 80% этанола/10 мм MgCl 2 решения от трубы и добавить 1 мл 50% этанола; рок за 5 мин.
    8. Удаление 50% этанола раствор из труб и добавить 1 мл 25% этанола и рок на 5 мин
    9. Удаление 50% этанола раствор из трубы и добавить 1 мл свежеприготовленной 3% H 2 O 2 /0.5% Кох отбеливающий раствор. Оставьте открытым шапки и пусть трубы стоять в стойку микро трубка для примерно 10 минут или до тех пор, пока слабый коричневую окраску можно увидеть в верхней части решения.
      Примечание: Слой пузырьков форме на верхней части решения. Тщательного времени требуется на этот шаг, как более отбеливания приведет к плохой двойной пятно.
    10. Удалить отбеливающий раствор и добавить 1 мл 25% glycerol/0.1% Кох; рок за 10 мин до 1 ч.
    11. Удалить 25% раствора KOH glycerol/0.1% из трубы, добавить 1 мл 50% раствора KOH glycerol/0.1% в каждую пробирку, рок за 10 мин для ночевки.
    12. Удаление 50% раствора KOH glycerol/0.1% из трубы и снова добавить 50% glycerol/0.1% Кох решение в каждой трубе. Качалка на ночь поможет удалить пузырьки воздуха, которые могут накапливаться внутри личинки. Магазин окрашенных скелетных препаратов при температуре 4 ° C, когда не используется.
  4. Фенотип забил
    1. Оценка окрашенных мутант потомства для пенетрантностью выбранного фенотип. В Николс и др. 1 мутанты были забиты любого вхождения внематочная кости.
      Примечание: Поскольку данио рерио родители находятся в статических воды и ализарин красный пятно может исчезать с течением времени, важно забить скелетов в течение несколько дней завершения подготовки скелетных.
    2. Пенетрантностью является доля генотип, который имеет фенотип. Рассчитать процент пенетрантностью по следующей формуле:
      % пенетрантностью = (мутантов с фенотипом) / (общее число мутантов) × 100

3. Семейный выбор

высокого
  1. выбрать два пенетрантностью и два пенетрантностью низкой семей для следующего поколения. В дополнение к пенетрантностью важно учитывать плодовитость и бодрости, при выборе которого семьям для распространения; подробности об этом смотрите обсуждение.
  2. Дайте каждой паре родительского идентификатора суб штока: семья.01,.02, и т.д.
  3. Дом родительских пар на основной системы с несколькими смешанные секс ' компаньон ' рыбы. Компаньон рыбы может быть любой данио рерио линии с постоянными, очевидно, отличительные черты, например изменения пигментации или ребра структуры.
    Примечание: Хотя многие исследователи успешно держать только гнездящихся пар в баке, благоприятные результаты видны жилье пар с несколькими компаньон рыбы. Это необязательный шаг позволяет гнездящихся пар животных должны храниться в крупных школах и легко восстановить, поэтому они могут быть неоднократно пересекали при необходимости. Родительских пар может быть пересеченным неоднократно для создания большой полный родственных семей; Подождите, по крайней мере за одну неделю до повтора, пересекая той же родительской пары.
  4. Отбирать личиночной семей из шага 2.2.2. которые не были отобраны для следующего поколения.
  5. Ярлык цистерны, содержащие личинки одичал тип сестру из отдельных семей с пенетрантностью от их мутантов братьев и сестер и поднять до совершеннолетия как нормальное.
  6. Следующего поколения будет иметь по крайней мере четыре полный родственных семей, линии вверх и два для линии вниз.
  7. Когда личинки достигают половой зрелости, повторите протокола, начиная с шага, один с новым поколением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол является долгосрочной животноводства техника полезна для понимания данио рерио скелетных мутантов (рис. 1). Селективный разводить потомство тестирования должна принести сдвиг в общем пенетрантностью вниз и вверх в несколько поколений (рис. 2). В нашей предыдущей работы два раунда селекции вынудили средняя пенетрантностью вниз от 17% до 3%1. Аналогичным образом в нашей линии вверх, мы перешли ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Селекция раскрывает тонкости функции гена

Переход мутант фенотипов быть более или менее серьезные по селекции является простым способом получить новое понимание функции гена. По сравнению со стандартными методами невыбранном селекции, протокола, представленные здесь может принести гораздо более полного понимания мутант фенотипов. Конкретно создавая штаммов, которые являются серьезными, полная ширина мутант фенотипов могут быть выявлены, включая некоторые, которые были ненаблюд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Чак Kimmel для руководства, Джон Dowd за помощь в разработке этой стратегии разведения, Macie Walker для ее работы в области совершенствования скелетных пятно и Charline Уокер и Бонни Ullmann для данио рерио полезные советы. Эта работа была поддержана K99/R00 DE024190 к JTN.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Параформальдегид, гранулированный, твердыйTed Pella Co.18501Гранулированный PFA является более безопасной альтернативой порошкообразному PFA
Магния Хлорид, твердыйAcros Organics223210010
10x PBS, водныйFisherBP3994
190 proof Этанол
Alcian Blue, твердыйAnatech Ltd.867Должен быть из Anatech
Alizarin Red, твердыйSigmaA5533-25G
Глицерин, жидкийFisherBP229 1
Перекись водорода, жидкийFisherBP263500
Гидроксид калия,  твердыйFisherP250 500
StepOnePlus Машина для ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемы
MicroAmp Fast Optical 96-луночный реакционный планшет со штрих-кодом (0,1 мл)Applied Biosystems4346906
Microseal 'B' sealBioRadMSB1001
KASP Master Mix, High ROXLGCKBS-1016-022https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer MixLGCKBS-2100-100
Tris HCl, твердыйFisherBP153 500
хлорид калия, твердыйFisherBP366 500
Tween-20, жидкийFisherBP337 100
Nonidet P40ThermoFisher28324
трикаин-SWestern Chemicals
Proteinase KFisherBP1700 100
T100 ТермоамплификаторBioRad1861096
контролируемой каплей Пастера ПипетецFisher13-678-30
Nanodrop ThermoFisherдля количественного определения ДНК

Ссылки

  1. Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
  2. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
  3. Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938(2012).
  4. DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
  5. McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  6. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
  7. Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
  8. Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
  9. Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
  10. Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
  11. Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138(2014).
  12. He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
  13. Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
  14. Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
  15. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
  16. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  18. Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
  19. McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
  20. Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
  21. Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
  22. McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39(2015).
  25. Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23(2013).
  26. Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
  27. Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

KASP
Сдвигая данио рерио смертоносных скелетных мутант пенетрантностью потомства тестирование
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.