Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение уровня мРНК со временем во время дрожжей S. cerevisiae гипоксических ответа

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56226

⸱

10 августа 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, с помощью РНК seq для мониторинга уровня мРНК со временем во время гипоксических ответ S. cerevisiae клеток. Этот метод может быть адаптирована для анализа экспрессии генов в течение любого клеточного ответа.

Аннотация

Сложные изменения в экспрессии генов посредником обычно большую часть клеточного ответа. Каждый ген может изменить выражение с уникальными кинетика как ген регулируется конкретного времени одной из многих раздражителей, сигнальные пути или вторичные эффекты. Для того, чтобы захватить весь ген выражение ответ к гипоксии в дрожжей S. cerevisiae, РНК seq анализ был использован для контроля уровня мРНК всех генов в определенное время после воздействия гипоксии. Гипоксия была создана путем выращивания клеток в ~ 100% N2 газ. Важно отметить, что в отличие от других гипоксических исследований, эргостерол и ненасыщенных жирных кислот не были добавлены в СМИ потому, что эти метаболиты влиять на экспрессию генов. Моменты времени были выбраны в диапазоне от 0 - 4 h после гипоксии, потому что этот период отражает значительные изменения в экспрессии генов. В каждый момент времени, середине журнала гипоксии клетки были быстро фильтруется и мороженые, ограничивая воздействие O2 и сопутствующие изменения в экспрессии генов. Общая РНК было извлечено из клеток и используется для обогащения для мРНК, который затем преобразуется cDNA. От этого cDNA мультиплекс библиотеки были созданы и восемь или более образцов были упорядочены в одной полосе секвенсор следующего поколения. Описан трубопровода после виртуализации, которая включает в себя базовый качества обрезки, читать картирования и определения количество считываний за гена. DESeq2 в пределах R статистики окружающей среды была использована для выявления генов, которые существенно изменить в любом из пунктов гипоксических время. Анализ трех биологических реплицирует показал высокую воспроизводимость, гены различных кинетики и большое количество O2-регулируется генов. Эти методы могут быть использованы для изучения, как клетки различных организмов реагировать гипоксии с течением времени и адаптированы для изучения экспрессии генов в ходе других клеточных реакций.

Введение

Многих организмов реагировать гипоксии, или низкой O2, изменяя ген выражение 1,2,3. Этот ответ помогает справиться с отсутствием субстрата, решающее значение для аэробного дыхания и несколько биосинтетических реакций, но и с меняющейся окислительно-восстановительного состояния 4клетки. Несколько microarray исследования в S. cerevisiae показывают, что уровни mRNA сотен генов, изменения в ответ на гипоксии 5,6,,78,9 , 10 , 11 , 12. Недавно, РНК seq был использован для характеристики изменения выражения гена с течением времени при гипоксии 13. Здесь представлены экспериментальные данные и обсуждены.

Гипоксия может достигаться различными способами, каждая из которых производит другой уровень O2. Здесь, гипоксия была учреждена постоянно течет ультра высокой чистоты N2 в колбы, который понижает [O2] распущен сразу с воспроизводимые кинетики 10. Вполне возможно, что есть некоторые O2 молекулы настоящий влияющих на метаболизм и ген выражение, но эта среда считается очень недалеко от анаэробных. В отсутствие O2дрожжевых клеток не biosynthesize гема, эргостерол и ненасыщенных жирных кислот 4,12,14. Таким образом предыдущие исследования включили эти метаболиты, когда рост дрожжей без кислорода 5,10,15. Однако многие гипоксических ответы опосредовано истощения этих метаболитов и таким образом пополнения их меняет гипоксических ген выражение ответы 12,16. Чтобы имитировать природные гипоксии, эти метаболиты не были добавлены в средствах массовой информации. В короткое время, что клетки были подвержены гипоксии без присутствия этих основных метаболитов был не заметное увеличение гибели клеток (данные не показаны), ни длительного стресса ответ 13.

Ответ также зависит от напряжения и его генотипа. Особенно важными являются аллели известных регуляторы гипоксических ответы 2. Фон штамм S288C весьма желательно так, что результаты можно сравнить с другими геномных исследований, выполненных с этот штамм. Однако S288C содержит частичные потери функции аллеля HAP1 гена 17, транскрипционный анализ критических регулятор для гипоксических ответ. Эта аллеля было отремонтировано в S288C с помощью wildtype копии от Σ1278b штамма фон 11.

Экспрессия генов сильно зависит от клеточной среды. Таким образом при выполнении анализа генома общесистемной мРНК, важно поддерживать постоянный окружающей среды при различной еще один параметр, например время, стимул или генотипа. Для достижения высокой воспроизводимости результатов, рассмотрим эти три практики для исследования и все его биологических или технических реплицирует. Во-первых же experimenter(s) следует провести исследование, так как технической практики может различаться между экспериментаторов. Во-вторых той же партии ингредиентов должны использоваться в средствах массовой информации роста, как каждая партия имеет несколько иной состав, который может влиять на экспрессию генов. В-третьих чтобы свести к минимуму последствия клеточного цикла, каждый момент времени должна состоять из асинхронных клеток в середине журнала фазе роста (1-2 x 10-7 кл/мл).

При характеристике сложный ответ как ответ выражение гена к гипоксии, курс является выгодным для определения кинетика различных мероприятий. Конкретное время точек должен быть выбран, что будет захватить крупные изменения ответа. В этом исследовании были замечены время точек между 0 и 4 h, потому что последние эксперименты показали широко распространенные изменения в экспрессии генов в течение этого периода 13.

Для измерения глобального ген выражение, РНК seq был используется 18,19. Этот метод использует секвенирование нового поколения для определения относительного изобилия транскрипт каждого гена. По сравнению с microarray анализ ДНК, РНК seq экспонатов выше чувствительность (для выявления менее обильные стенограммы), более широкий динамический диапазон (для измерения более раз изменения) и Улучшенный воспроизводимости (чтобы точно следовать экспрессии генов с течением времени). Как правило наиболее клеточной РНК — рибосомной РНК, которые так много методов были разработаны для обогащения для конкретных видов РНК 20. Здесь поли T бусины были использованы для того чтобы очистить поли A-содержащих мРНК стенограммы, хотя различные коммерчески - доступные наборы истощения рРНК также может быть эффективным в мРНК обогащения.

Здесь характеризовался ответ выражение гена S. cerevisiae гипоксии. Клетки были подвержены гипоксии и затем отведать в восемь раз точки (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 мин). Чтобы подтвердить воспроизводимость и выявления статистически измененные стенограммы, три биологических реплицирует были исполнены. РНК добытых столбец очистки и механические нарушения и затем обработаны для РНК seq анализа. Описан трубопровода после виртуализации и программирования сценариев предоставляются, которые позволяют выполнять точное репликации анализов. В частности Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R статистической среды 24и DESeq2 пакет 25 были использованы для обработки данных, РНК seq и выявления 607 генов, которые существенно изменить во время гипоксия. Анализ главных компонент (СПС) и выражение гена реплицирует указали воспроизводимость метода. Кластеризация и карты показали широкое выражение кинетики, в то время как генная Онтология (GO) анализ показал, что многих клеточных процессах, как аэробного дыхания, обогащаются в наборе кислорода регулируется генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. склонение гипоксии

  1. Один день или более до гипоксии время курс: подготовка инкубатор телефоны, фильтрации системы, вакуум, бензобак, фляги, пробки, стеклянные трубки и трубки, как показано в Таблице материалов.
  2. Место N2 танка, инкубатор, вакуумные и фильтрации системы в непосредственной близости, чтобы включить быстрый обработки клеток.
  3. Подготовка стерильных жидких сред YPD (1%, экстракт дрожжей, Пептон 2%, 2% раствор глюкозы) путем смешивания компонентов в стеклянной бутылке и автоклавирования.
  4. План схема колбы в инкубаторе.
    Примечание: От бака2 N, первый флакон будет ловушку воды, второй флакон будет последний момент времени, третий настой будет точкой второй до последнего времени и так далее до последнего настой, который является окончательное вода ловушку. Рисунок 1 показывает порядок и соединения между колбы.
  5. За день до времени курс прививок колонией дрожжей в культуру 5 мл жидкости YPD в стерильную пробирку. В частности подберите полный колонии от пластины с помощью стерильных аппликатор ручки. Установите ручку в жидком YPD и встряхнуть палку, пока большинство клеток в суспензии.
  6. Поворот трубы при 30 ° C ночь (~ 16 h).
    Примечание: После 16 h, wildtype клетки будет добиться насыщения (~ 2 x 108 клеток/мл), указал на очень облачно культуры. Другие штаммы может занять больше времени, чтобы добраться до насыщения и должна быть проверена измерения концентрации клеток с спектрофотометр, как указано в шаге 1.9.4.
  7. В день время курс после 16 ч инкубации, разбавить насыщенных культуры 1:50 с помощью пипетки 5 мл поставить 4 мл ночь культуры в 196 мл жидкого YPD в стерильных 500 мл флакон. Расти с встряхивания на ~ 200 rpm для 4 ч при температуре 30 ° C.
    Примечание: После 4 ч, wildtype культура достигнет в середине журнала концентрации ~ 1-2 x 107 кл/мл.
  8. В течение 4 ч инкубации метки колбы (для ловушки гипоксии и воды) и 50 мл трубки для сбора. Если инкубатор в шаге 1.7 выше не используется для курса время гипоксия, включите другой инкубатор и до 30 ° C.
  9. Как раз перед подвергать гипоксии клетки:
    1. Добавьте два из стерильных 250 мл колб, которые будут служить в качестве ловушки воды ~ 50 мл воды.
    2. Заполните 1/3 льда ковша жидким азотом и погружать пенополистирола стойку провести 50 мл пробирок.
    3. Настройка фильтра системы сбора клеток. Добавление диска стерильного фильтра на дно блок системы фильтрации с использованием стерильных пинцетов, стараясь коснуться только края фильтра диска. Поместите верхний фильтр на дно блок фильтра и Закрепите зажимы, предоставляемых системой. Убедитесь, что нижней и верхней единиц выравниваются, так что есть плотное прилегание и отсутствие утечки.
    4. Измерение концентрации клеток с спектрофотометром. Разбавьте клетки так, что они могут быть измерены в линейный спектр спектрофотометр –600 ОД между ~0.2 - 0,6, в зависимости от спектрофотометра.
      Примечание: Одна единица600 ОД является ~ 3 x 107 кл/мл, в зависимости от морфологии клеток и спектрофотометра. ~ 1-2 x 107 кл/мл концентрация ожидается, соответствующий ОД600 ~0.33 - 0.66.
    5. Быстро получите образец time 0.
      1. Подключите фильтр системы к сильным (~ 10 мбар) вакуума через вакуумные трубки и колбу ловушку 1000 мл. Включите пылесос. Налейте антресоль культуры (обычно ~ 20 мл) и ждать к быть вытягивано через фильтр жидкости (~ 10 s, в зависимости от силы вакуум).
      2. Осторожно извлеките диск фильтр с помощью пинцета, чистой и место в 50 мл пластиковых пробирок. Сразу же место пластиковых пробирок в стойку, погруженной в жидком азоте. Главное не предварительно охладите трубы перед вставкой фильтр как трубы будет взорваться.
      3. После > 30 s, место трубку в морозильной камере-80 ° C для последующего извлечения РНК. После каждого фильтрации очистки и заново соберите систему фильтрации. Промойте систему, потянув воды 10 s без фильтра диска. Наконец вытрите системы с бумажным полотенцем.
    6. Разбавьте 4 h культуры в различных колбы для различных точек времени, таким образом, чтобы каждый настой достигает середины журнала концентрации (~ 1-2 x 107 кл/мл) в точке указано время гипоксии.
      Примечание: В таблице 1 показаны разведений, которые были использованы для гаплоидным штамма одичал типа S288C HAP1+ . Мы рекомендуем вам проверить каждого штамма в этих условиях гипоксических культуры и соответственно корректировать разведениях.
    7. После того, как клетки и СМИ добавляются колбы, замените алюминиевой фольги, охватывающих колбу, открытие с пробкой, содержащий две стеклянные трубки вставляется.
    8. Место колбы в инкубаторе в макете, определены ранее.
    9. Надежно подключите труб, как показано на рисунке 1.
    10. Проверьте, что все пробки плотно толкнул в колбу отверстия.
  10. В момент времени 0 откройте клапан-регулятор. Затем установите расходомер до 3 Л/мин.
    Примечание: Восходящей будет наблюдаться в обеих водных настоев, указанием надлежащего газового потока. Если это не так, проверьте, что все пробки плотны и трубки присоединена правильно.
  11. Закройте инкубатора и установите скорость встряхивания ~ 200 об/мин. Запустите таймер.
  12. Перед каждой точке времени настроить фильтр системы, как описано выше в шаге 1.9.3.
  13. В каждый момент времени (например, 5 минут, 10 минут и т.д.) у двух человек быстро обработать клетки следующим образом:
    1. Первого лица: удалите соответствующие настой из держателя и вынуть пробку (с стеклянная трубка прилагается).
      Примечание: Это не нарушит поток N2 к любой из оставшихся колбы культуры, но временно прерывания потока в последний ловушку воды.
    2. Второе лицо: Пипетки 1 мл культуры и обойтись в кювет. Подсоедините трубку от культуры настой, который сейчас находится в конце строки до последней ловушку воды (одна трубка и одна пробка будут удалены в процессе.). Затем измерения концентрации клеток в кювет, как описано выше в шаге 1.9.4.
    3. Первого лица: вылейте оставшуюся часть культуры в системе вакуумной фильтрации, а затем выполнить фильтрацию и замораживания, как описано выше в шаге 1.9.5.
  14. Закончив все моменты времени, выключите газ N2 . Сначала закройте регулятор и ждать давление, чтобы освободить и затем отключить расходомер. Наконец разбирать систему и очистить все материалы с водой, а затем на 70% спирте.

2. РНК добыча

  1. Подготовьте RLT буфер для очистки столбец РНК, как описано в Таблица материалов.
  2. Подготовка рабочего раствора DNase, добавив 10 мкл DNase Стоковый раствор 70 мкл буфера RDD на сэмпл (см. Таблицу материалов).
  3. Удаление 50 мл пробирки, содержащие фильтры и клетки из морозильной камеры-80 ° C и место на лед таять (~ 15 мин). Выполните следующие действия с трубками на льду.
  4. Метка 2 мл трубки колпачок и разместить их на льду, одна трубка для каждого образца. Добавьте ~0.6 мл кислоты промывают бисера в каждой трубе, с помощью пробки microcentrifuge 1,5 мл совок и измерить бисер.
  5. Добавьте 0,6 мл холодного RLT буфера в 50 мл трубки.
  6. Накапайте вверх и вниз, чтобы удалить клетки из фильтра и приостановить в раствор. Избегайте, позволяя фильтр остаются в решении, как фильтр будет впитывать решение. Удалить все решения впитывается в фильтр с помощью кончика пипетки выжать фильтр к стене трубы.
  7. Передать все жидкости из 50 мл трубки-колпачок пробирки, содержащие бусины.
  8. Поместите колпачок трубы в гомогенизатор мельница шарик и запустить за 1 мин.
    Сразу же место трубы на льду для трех мин. Опять же вставьте трубки в гомогенизатор и запустить за 1 мин.
  9. Удаление трубы из гомогенизатор и место на льду на 5 мин. Бисер будет располагаться в нижней части трубы.
  10. Выполните остальные шаги при комнатной температуре.
  11. С помощью пипетки, передавать только lysate (~ 350 мкл), избегая бисер, чтобы новые пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  12. Microcentrifuge за 2 мин макс скорость и затем передать новые пробки microcentrifuge 1,5 мл супернатант.
  13. Добавьте 1 объем 70% этанола (сделанные из 200 доказательство молекулярной биологии класс этанола). Смешайте хорошо закупорить.
  14. Передача решения и любые поспешные РНК столбец, который был помещен внутрь 2-мл пробирку коллекции.
  15. Центрифуги для 15 s на ≥12, 000 x g и отмены потока через (жидкость в трубе).
  16. 350 мкл буфера RW1, в столбце. Центрифуги для 15 s на ≥12, 000 x g и отмены потока через.
  17. 80 мкл DNase I инкубации микс для столбца мембраны (не получить на сторонах трубки) и позволить сидеть в течение 15 мин.
  18. Мкл 350 буфера RW1 столбец. Microcentrifuge 15 s на ≥12, 000 x g и отмены потока через.
  19. Добавьте 500 мкл буфера НПП в столбце. Поток через Microcentrifuge 15 s на ≥12, 000 x g и отменить.
  20. Добавьте 500 мкл буфера НПП в столбце. Microcentrifuge за 2 мин на ≥12, 000 x g.
  21. Осторожно удалите столбец и поместите в новой коллекции 2-мл пробирку. Microcentrifuge на полной скорости в течение 1 мин (полностью высохнуть мембраны).
  22. Отказаться от сбора трубки и столбце в пробки microcentrifuge 1,5 мл. 30 мкл РНКазы свободной воды, в столбце мембраны.
  23. Элюировать РНК из столбца по microcentrifuging за 1 мин на ≥12, 000 x g. При загрузке столбцы в microcentrifuge, убедитесь, что крышки коллекции трубки сталкиваются в направлении центрифуги вращается, чтобы предотвратить крышками, облом.
  24. Мкл еще 30 РНКазы свободной воды для столбца мембраны, сохраняя столбец в том же пробки microcentrifuge.
  25. Microcentrifuge за 1 мин на ≥12, 000 x g, так что окончательный элюата объем 60 мкл.
  26. Храните каждый 1,5 мл трубка, содержащая 60 мкл РНК в морозильной камере-80 ° С.

3. Определение концентрации РНК и качества

  1. Измерение концентрации РНК и ДНК в каждой пробе РНК, используя флуориметр (, (b) ДНК-РНК конкретных и флуоресцентных красителей и трубок (c) анализа, как указано в Таблице материалов. Следуйте инструкциям флуориметр и красители.
  2. Кроме того, измерения концентрации нуклеиновых кислот с УФ спектрофотометры на 260 Нм.
    Примечание: Чтение260 A 1.0 является эквивалентом ~ 40 мкг/мл одноцепочечной РНК.
  3. Тест качества РНК, запустив РНК на анализатор коммерческих нуклеиновой кислоты (см. Таблицу материалов) или на стандартный формальдегида/агарозы гель 26.

4. РНК seq анализ

  1. От суммарного РНК составляют 21 µL 100 нг/мкл РНК в РНКазы свободной воды. Используйте 1 мкл этой 21 мкл для тестирования концентрации РНК как указано выше. Отправить оставшиеся 20 мкл (2 мкг) всего РНК к внешней последовательности центр для обогащения мРНК, подготовка стренги библиотеку (с восемью или более штрих-кодов для мультиплексирования) и виртуализации (см. Таблицу материалов). Кроме того, локально выполнить мРНК обогащения и подготовка библиотеки, а затем представить библиотеку для виртуализации.
  2. Бассейн восемь или более мультиплексированных образцы и последовательность в одной полосе секвенсор следующего поколения.
  3. Скачать файл FASTQ, содержащий все считывает последовательность и читает соответствующий индекс. Кроме того Скачайте текстовый файл, содержащий мультиплекс штрих-кодов.
    Примечание: Индекс считывает могут присутствовать в отдельный файл FASTQ. Поместите все эти файлы в один каталог.
  4. Поместите сценарий оболочки, представленная здесь, «fastq_pipeline.sh», в том же каталоге. Редактировать этот сценарий в случае необходимости для эксперимента и каталогов компьютера.
    Примечание: Этот сценарий содержит обширные аннотации, объясняя шаги. Вкратце качество сценария планки читает, сопоставляет читает генома и генерирует файл с разделителями табуляции, содержащий количество считываний за гена для каждого образца.
  5. Депозит в Омнибус выражение гена NCBI до публикации 27FASTQ файлы и необработанные данные чтения. Следуйте инструкциям для «Отправка последовательности высокой пропускной способности данных GEO»: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Импорт данных чтения count в R статистики окружающей среды и выполнить статистический анализ, используя сценарий R, представленная здесь, «time_course_script. R». Редактировать этот сценарий в случае необходимости для эксперимента и каталогов компьютера.
    Примечание: Этот сценарий содержит обширные аннотации, объясняя шаги. Вкратце этот сценарий импортирует читаемых данных, нормализует читает, идентифицирует генов, которые существенно измениться в течение времени, выполняет анализ СПС и графики выражение отдельных генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Гипоксия время курс и РНК seq анализа проводились независимо друг от друга три раза. Для изучения воспроизводимость трех реплицирует, данных выражение гена для всех генов был проанализирован с помощью анализ главных компонент (PCA). Рисунок 2 показывает, как изменить образцы на первых двух основных компонентов, которые вместе представляют 58,9% изменчивости. Этот анализ показал, что каждый раз курс exhibits подобные изменения (как изображено на аналогичные фо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании уровни mRNA для всех генов был измерен при гипоксии в дрожжей S. cerevisiae. Целью было анализировать как глобальные изменения выражения гена из-за роста в контролируемой среде, вблизи аноксии. Некоторые шаги были приняты для обеспечения тщательно контролируемых и воспроизводимый метод, описанный здесь. Во-первых, клетки были подвержены точно определенная гипоксических среды: 99,999% N2 в богатых СМИ (YPD). Другие исследования гипоксии закрыты колбу или трубки воздуха

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Льюис-Сиглер Институт интегративной геномики последовательности основного фонда в Принстонском университете для технических консультаций и подготовки библиотеки РНК и последовательности. Эта работа была поддержана грантов от Университет Роуэна и низ NIGMS R15GM113187 M.J.H.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Закрытый сухой инкубаторThermo ScientificMaxQ 4000Установите при температуре 30°C. Измените дверцу, чтобы разрешить вход одной пробирки Tygon. В качестве альтернативы можно использовать инкубатор New Brunswick G25, который содержит трубчатый порт. Не используйте встряхиватель для воды под открытым небом, так как в трубках между колбами будет собираться конденсат, который может привести к перекрестному загрязнению культур.
Фильтродержатель для микроанализаMilliporeXX1002530диаметром 25 мм, опора из нержавеющей стали, No 5 перфорированных силиконовых стопорных креплений в стандартной фильтрующей колбе объемом 125 мл
Сильный вакуумEdwardsE-LAB 2 дом» Вакуум может быть слишком слабым. В качестве альтернативы можно использовать портативный вакуумный насос с электроприводом, подобный перечисленному здесь.
объемом 1 000 млДействовать как вакуумная ловушка.
~ 2 фута длины толстостенных вакуумных трубок, внутренний диаметр 3/8 дюйма, внешний диаметр 7/8 вTygon38TTДве части: первая соединяет вакуум с ловушкой, а вторая соединяет ловушку с системой фильтрации.
высокого давления N2чистота 99,999%, > 1 000 фунтов на квадратный дюйм, с регулятором и регулятором расхода газа
Автоклавная колбаОтверстие закрыто алюминиевой фольгой. По одному на каждый штамм дрожжей.
Автоклавные колбыОтверстия покрыты алюминиевой фольгой. По одному для каждой временной точки плюс два для водяных ловушек.
Пробки для колб (размер 6, два отверстия диаметром 5 мм)Стерилизованы 70% этанолом. По одному на каждую флягу.
Стеклянная трубка, длина 9 см или 17 см, внутренний диаметр 2 мм, внешний диаметр 5 ммСтерилизована 70% этанолом. По две трубки на каждую колбу. Поместите в отверстия каждого стопора. На рисунке 1 показано размещение трубок размером 9 и 17 см.
~25 см длины пластиковой трубки, внутренний диаметр 5 ммTygonE-3603По одной штуке на каждую колбу. Стерилизован 70% этанолом.
Стерильные фильтрующие дискиMilliporeHAWP02500диаметром 25 мм, 0,45 &; m размер пор, по одной на каждый момент времени
Стерильные dH2O (~100 мл)
1 мл кюветДля измерения OD600 (т.е. концентрации клеток)
50 мл стерильных пробирок для центрифуги Поодной на каждый момент времени
Чистый и стерильный пинцет
Жидкий азотДля замораживания клеток
промытые кислотой бусиныSigmaG8772Держать при 4 градусах; C для лизирования клеток
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104Для очистки колонки РНК
Qiagen RLT буферПодготовьте путем добавления 10 & микро; L β-меркаптоэтанола на 1 мл буфера RLT, держитесь на уровне 4 °C.
2 мл пробирки для сбораQiagenвходят в состав Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPEQiagenвходят в состав Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1Qiagenвходят в состав Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I стоковые и рабочие растворыQiagen79254Фермент ДНКаза I выпускается в виде лиофилизированного порошка в стеклянном флаконе. С помощью стерильной иглы и шприца введите 550 & микро; Л воды, не содержащей РНКазы (входит в комплект Qiagen) во флакон. Перемешайте, аккуратно перевернув бутылку. Чтобы избежать денатурации фермента, не делайте вортс. С помощью пипетки извлеките этот исходный раствор из флакона и храните в морозильной камере (-20°С; В) в одноразовых аликвотах (80 & микро; L каждый). Исходный раствор не следует размораживать и повторно замораживать.
Буфер RDDQiagenвходит в комплект Qiagen DNase Kit
Ледяные 2 мл пробиркиДля лизирования клеток при экстракции РНК
гомогенизатор бисерной мельницыBiospec Mini-Beadbeater-24112011Хранить в холодном помещении
Bacto PeptoneBDDF0118для жидких сред YPD
Экстракт дрожжей BactoBDDF0886для жидких YPD среда
глюкозаFisherD16для жидких сред YPD
Пробирки для анализа кубитовThermo FisherQ32856для измерения концентрации нуклеиновых кислот
Quant-iTTM dsDNA BR Assay KitThermo FisherQ32853для измерения концентрации нуклеиновых кислот
Quant-iTTM RNA Assay Kit ThermoFisherQ32855для измерения концентрации нуклеиновых кислот
Кубит ФлуориметрThermo FisherQ33216для измерения концентрации нуклеиновых кислот
Коммерческая система электрофорезаAgilentBioanalyzer 2100для измерения качества нуклеиновых кислот
Секвенатор нового поколенияIlluminaHiSeq 2500для секвенирования библиотек
Автоматизированная система обработки жидкостейWafergenApollo 324для создания библиотеки секвенирования
PrepX PolyA mRNA Isolation KitWafergen400047для выделения мРНК из общей РНК
PrepX РНК SEQ для Illumina Library KitWafergen400039для создания специфичных для нитей библиотек секвенирования из общего количества РНК
Barcode Splitterhttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, который включает в себя командуhttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (устанавливается до TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (устанавливается до R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (бесплатная версия)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Колба Газовый бак объемом 500 мл 250 мл с завинчивающейся крышкой gzip

Ссылки

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106(2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13(2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Гипоксический ответ дрожжейизмерение уровня мРНКанализ RNA-seqэксперимент с временным курсомгипоксия азотным газомэкстракция тотальной РНКконверсия в кДНКсоздание мультиплексных библиотексеквенирование следующего поколенияанализ DESeq2
Измерение уровня мРНК со временем во время дрожжей S. cerevisiae гипоксических ответа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.