Методическая статья

Техника минимально инвазивной поперечной аорты сдавливания в мышей для индукции гипертрофия левого желудочка

DOI:

10.3791/56231

⸱

25 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Veterinary Physiology and Zurich Center for Integrative Human Physiology (ZIHP), University of Zurich, 2Laboratoire d'Innovation Thérapeutique, UMR7200, Université de Strasbourg - CNRS, 3Department of Cardiology, Canton Hospital Lucerne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью настоящего Протокола является описание шаг за шагом технику минимально инвазивной поперечной сужение аорты (TAC) мышей. Ликвидация интубации и вентиляции, которые являются обязательными для часто используемых стандартной процедуры миниинвазивная TAC упрощается процедура оперативного и уменьшает нагрузку на животное.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поперечная сужение аорты (TAC) мышей является одним из наиболее распространенных хирургических методов для экспериментального исследования давление перегрузки индуцированной оставил гипертрофия желудочков (ГЛЖ) и ее прогрессирования сердечной недостаточности. В большинстве сообщенных расследований эта процедура выполняется с интубации и вентиляции животное, которое делает его сложных и трудоемких и добавляет к хирургической бремя для животного. Целью настоящего Протокола является описание упрощенной методики малоинвазивной TAC без интубации и вентиляции мышей. Важнейшие шаги техники подчеркнуты достижения низкой смертности и высокой эффективности в стимулировании ГЛЖ.

Самцов мышей C57BL/6 (10-недельных, 25-30 g, n = 60) были под наркозом с одной внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина и ксилазина. В спонтанно дыхание животных после 3-4 мм верхний частичной стернотомия, сегмент 6/0 Шелкового шва резьбой через глаз помощи лигирование был принят под аорты и связали над притупляются 27-иглы. Шам эксплуатируемых животных прошли же хирургической подготовки, но без сужение аорты. Эффективность процедуры в стимулировании ГЛЖ подтверждено значительное увеличение соотношения вес сердца/тела. Этот показатель получен в течение 3, 7, 14 и 28 дней после операции (n = 6-10 в каждой группе и каждый момент времени). Используя нашу технику, ГЛЖ наблюдается по сравнению с фиктивным животных от 7 день через день 28 ТЭК. Оперативное и поздно (более 28 дней) смертности являются весьма низкие на 1,7%.

В заключение наша экономически техника минимально инвазивной TAC в мышах носит очень низкой постановляющей части и послеоперационная смертность и очень эффективна в привлечении ГЛЖ. Это упрощает процедура оперативного и уменьшает нагрузку на животное. Она может быть легко выполнена, следуя критические шаги, описанные в настоящем Протоколе.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние годы, было проведено исследование сердечной недостаточности в жизнеспособных животных модели1. По сравнению с больших животных моделей сердечной недостаточности, малые животные модели имеют многочисленные потенциальные преимущества. Рядом с нижней расходы жилищного строительства и технического обслуживания малые животные модели доступны для больше исследователей из-за менее сложных необходимое2.

Мышь сердечной недостаточности модели предлагают многие из те же преимущества, как крыса модели. В дополнение к сокращению жилья стоит3, мышь модели выгоду от наличия соответствующих штаммов трансгенных и нокаут (KO). Возможность конкретного типа, индуцибельной KO ячейки или трансгенных стратегии сделать мышь бесценным инструментом для изучения патогенеза сердечной недостаточности и попытаться определить новые терапевтические схемы3.

Среди мыши модели сердечной недостаточности в настоящее время используется4, поперечной аорты сужения (TAC), который был впервые описан Rockman5 является предпочтительной моделью для создания давления перегрузки индуцированной левого желудочка гипертрофия (ГЛЖ)1 , 3. самое главное преимущество этой модели является возможность разрешить стратификации ГЛЖ2, хотя левой вентрикулярной Ремоделирование в ответ на TAC переменной между различными мыши штаммов. Мышей C57BL/6, в частности, разработать быстрого LV дилатация после TAC, что не может произойти с другими штаммов4,6,7.

Внезапного возникновения гипертонии, достигнутые с причинами TAC примерно 50% увеличение LV массы в течение 2 недель, позволяя быстро изучить действие фармакологических или молекулярные вмешательств, направленных на плавного развития ГЛЖ4. Острый индукции тяжелой гипертензии, TAC не точно воспроизвести прогрессивного левого желудочка гипертрофия и Ремоделирование наблюдается в клинических условиях аортальный стеноз или артериальной гипертензии. Тем не менее эта модель используется для определения и изменения роман терапевтических целей в сердечной недостаточности4многих детективов.

Выполнение TAC в мышах требует больше хирургического опыта, чем требуется для других методов, используемых для побудить ГЛЖ и последующих сердечной недостаточности2. Большинство авторов выполнить эту процедуру, интубирование и вентиляции животных2,8, который делает эту процедуру более требовательной и длительным и добавляет к хирургической бременем для животного. Только несколько исследователи использовали минимально инвазивной TAC в их исследовании с краткое хирургическая процедура9,10,11.

Целью настоящего Протокола является описать пошаговую инструкцию упрощенный и удобный метод минимально инвазивной поперечной аорты сдавливания в мышей, выделив на критических этапах процедуры. Выполнив следующие ключевые шаги, один можно легко выполнить эту технику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

мужчины C57BL/6J мышей (10 недель, 25-30 г, n = 60) используются в настоящем Протоколе. Животные получают гуманной помощи в соответствии с руководящими принципами, сформулированными французским министерством сельского хозяйства и высшего образования и научных исследований, и все процедуры выполняются в соответствии с директивой Совета Европейского сообщества от 24 ноября 1986 () 86/609/EEC) и французских законов. Протокол был утвержден " региональный комитет по этике для животных экспериментов CREMEAS " (#2016092816207606).

1. Подготовка к операции

  1. сохранить мышей на одну неделю после прибытия в объекте животных на 12h / 12h цикла свет/темно, в стандартные корпуса, с пищей (для Подробнее см. таблицу материалы) и вода доступна объявление Либитум.
  2. В день операции, место мышей в отдельных клетках за несколько минут до индукции анестезии, для того чтобы избежать каких-либо дополнительных стресс для животного. Стерилизовать всех хирургических инструментов за день до операции.
  3. Вставки внутри peritoneally разовая доза смесь кетамин (51.4 мг/кг) и ксилазина (3,3 мг/кг) разводят в физиологический раствор (0,9% NaCl).
  4. Убедитесь, что из глубины анестезии отсутствие мыс отступление рефлекс.
  5. Бритья бритвой коммерчески доступных шею и грудь животного и дезинфицировать области побрился с 70% спирта.
  6. Животное лежа на площадку Рабочая чистого Корк и исправить лапы с клейкой лентой.

2. Хирургия

  1. хирургических стерильных используется всей процедуры. В спонтанно дыхание животных, выполняют разрез продольной средней шейки матки более 10 мм с 11-лезвие ножа из выше грудной вырез на середину груди для того, чтобы разоблачить грудины ( рис. 1).
  2. Убрать щитовидной железы, передав шовный материал полипропилен пребывания леска 4/0 с Crile-Вуд иглодержатель и ленту его на рабочую площадку.
  3. Отдельные тупо предварительно трахеи мышцы с микро хирургические щипцы раскрыть трахеи.
  4. Слайд аккуратно гладкой накренилась изогнутые микро хирургические щипцы с закрытой пасти над трахеи и за грудиной.
  5. , Тщательно открытия и закрытия челюстей гладкой наконечником щипцы изогнутые микрохирургическое осуществлять тупым диссекция под заранее трахеи мышцы и за грудиной отойти плевра.
  6. Понять право выше ключицы мышцы с гладкой наконечником прямо микро хирургические щипцы и потяните вверх нежно грудь животного.
  7. Слайд нижней челюсти кости щипцы под грудины и выполнить верхняя частичной стернотомия, 3-4 мм ( рис. 2). Прямой в нижней части мини стернотомии слегка к левой.
  8. Пройти второй межреберное пространство леска 7/0 полипропилен пребывания шовный материал от внутри к вне на каждой стороне с помощью микро хирургические иглодержатель мини стернотомии. Оставайтесь рядом реберно грудинном угол, чтобы избежать травм межрёберные и внутренней грудной судов или плевры.
  9. Распространения края грудины, с помощью 7/0 Мононить полипропиленовая пребывания швы на каждой стороне и исправить их на рабочую площадку с помощью скотча.
  10. Осторожно двигаться в сторону предварительно трахеи мышц, средостения жира и вилочковой железы с помощью накренилась гладкой изогнутые микрохирургическое щипцы для визуализации аорты под увеличением малой мощности (2-3 X) ( рис. 3). Будьте особенно осторожны, чтобы не коснуться или повреждение париетальной плевры для предотвращения развития пневмоторакса.
  11. Разоблачить мягких тканей под аорты, связывая щипцы ( рис. 4 A) и аккуратно распространение его челюсти. Подготовить тоннель в мягких тканей под аорты с второй связывая щипцами осторожно открытия и закрытия челюстей в мягких тканей.
  12. Пройти сегмента 6/0 шелк лигатура резьбой через глаз лигирование помощи ( Рисунок 4 B), в левой руке под аорты и извлечь его, связывая щипцами в правой руке между происхождение право непоименованных и левой общей сонной артерии ( рис. 5).
  13. Вырезать 27-иглы длиной 5 мм и тупые обоих концах, нажав их с Crile иглодержателя. Место притупляются 27-иглы рядом с аорты ( рис. 6) с гладкой наконечником прямо микро хирургические щипцы и связать шовный материал плотно вокруг иглы и аорты между правом непоименованных и левой общей сонной артерии артерий, используя два связывая щипцы ( рис. 7). Плотно завязать шовный материал, выполните первоначальные двойным узлом, следуют четыре дополнительных узла. Убедитесь, что все узлы являются плоскими.
  14. После перевязки, удалить быстро, но осторожно, игла для достижения сужение диаметром 0,4 мм и воспроизводимый поперечной 65-70% аорты сужение.
  15. Проверить гемостаза мягких тканей вокруг аорты, грудной края и предварительно трахеи мышц. Положите рассасывающимся Кровоостанавливающая марля, где просачивание крови наблюдается. Удалить, 7/0 Мононить полипропиленовая остаться шовные материалы, используемые для распространения края грудины.
  16. Пройти простой 6/0 Мононить полипропиленовая шовный материал с микро хирургические иглодержателя от снаружи к внутри левой второй межреберное пространство и затем от внутри вне право второй межреберное пространство. Оставайтесь рядом реберно грудинном угол, чтобы избежать травм межрёберные и внутренней грудной судов или плевры.
  17. Объединить края грудины, связывая 6/0 Мононить полипропиленовая шовный материал с Crile-Вуд иглодержатель.
  18. Закройте кожи с 5/0 Мононить полипропиленовая, управлением шовный материал в один слой с Crile-Вуд иглодержатель.
  19. Выполнения Шам процедуры идентичны для сужения операцию, но не связывая швом вокруг аорты.

3. Послеоперационное восстановление

  1. очень внимательно следить за животных. передавать отдельные клетки мыши и поместить его в положении лежа.
  2. Разрешить, мыши, чтобы восстановить под потепления света до тех пор, пока полностью проснуться (менее 1 ч после вызывая анестезии).
  3. Для послеоперационного обезболивания, придать 0,1 мг/кг бупренорфина внутрибрюшинно. повторить подкожной инъекции 0,1 мг/кг каждые 8 ч бупренорфина в первые три дня, как указано.
  4. Место эксплуатация мышей в стандартных клетках (максимум 3 мышей в клетке) и минимум 2 мышей на клетке.

4. Сердце урожай

  1. в день анализа, усыпить мышь с раствором кетамина 300 мг/кг и ксилазина 20 мг/кг в солевых внутрибрюшинной инъекцией.
  2. Сначала собирают кровь из нижней полой вены и затем через линию же залить 5 мл раствора 2.6 мм ЭДТА в Салине.
  3. Урожая сердце, удалить предсердия и вес сердца (левого и правого желудочков без предсердия).
  4. Отдельные слева от правой ventrучастие с носовой перегородки, оставшиеся части левого желудочка. Весят как образцы тканей и заморозить их в жидком азоте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оперативное и конце выживания
Постановляющей части выживания был очень высоким, 98,3% (59 из 60) для всей серии (TAC и Шам эксплуатируемых животных). Только смерть наступила в результате кровотечения осложнение в мыши, строганные Шам операции. Послеоперационные выживания в период наблюдения за 28 дней также был отличный, 98,3% (58 из 59). Только в конце послеоперационные смерть произошла в TAC мыши на день (D) 16, возможно, сердечного происхождения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель настоящего Протокола заключается в представлении Пошаговые иллюстрации хирургической техники для малоинвазивных поперечной сужение аорты в мышах. 2,других авторов8сообщила подробное техническое описание поперечной сужение аорты у мышей. Однако, эти следователи выполняют операции после интубации и вентиляции животных. Использование дополнительного шага интубации-вентиляции увеличивает сложность и продолжительность всей процедуры и глобальной стресса животное ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Грант (N ° 32016) швейцарского фонда сердечно-сосудистой системы в рт.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хирургический микроскопOlympusSZX2-TR30
БритваRowentaNomad TN3650FO
<прочный>шов:
Полипропилен 7/0EthiconBV-1X
Полипропилен 6/0BBraunC0862061
Шелк 6/0 лигатура FST18020-60
Полипропилен 4/0Этикон8683
Полипропилен 5/0ЭтиконZ303
<стронг>Лекарства:
кетаминМериалИмалг&эгрейв; ne 1000, LBM154AD
КсилазинБайерРомпун 2%, KP09PPC
БупренорфинЦеваВетергезик, 072013
Инструменты: 
Кусачкидля кости Тонкие хирургические инструменты16101-10
Приспособление для лигированияТонкие хирургические инструменты18062-12
Щипцы для связыванияТонкие хирургические инструменты18026-10
Иглодержатель Crile-WoodТонкие хирургические инструменты12003-15
Микрохирургические щипцы Тонкие хирургические инструменты11003-12
Микрохирургические щипцы Тонкие хирургические инструменты11002-12
Тканевые щипцыТонкие хирургические инструменты11021-12
Иглодержатель для микрохирургииТонкие хирургические инструменты12076-12
Ножницы для микрохирургииТонкие хирургические инструменты91501-09
Ножницы МайоТонкие хирургические инструменты14511-15
Нож с 11 лезвиямиFine Surgical Инструменты10011-00
РНК экстракция и qPCR:
TriReagentEuromedexTR-118-200
Rneasy Mini kitQiagen74704
Qubit Флуориметрический анализ РНКFisher Scientific10034622
RNA 6000 Nano kitAgilent5067-1511
Высокопроизводительный набор кДНКFisher Scientific10400745
Taqman Master MixFisher Scientific10157154
Taqman BNP праймерыFisher ScientificMm01255770_g1
Taqman ANP праймерыFisher ScientificMm01255747_g1 
Праймеры Taqman ACEFisher ScientificMm00802048_m1
Праймеры Taqman Col1a1 Fisher ScientificMm00801666_g1
Taqman TGFb праймерыFisher ScientificMm01178820_m1
Taqman Gapdh праймерыFisher ScientificMm99999915_g1
ABIPrism  ТермоамплификаторApplied Biosystems7000
Программное обеспечение:
GraphPad PrismGraphPad Prism 7
Корм для животных
Полнорационный рацион для взрослых крыс/мышейБезопасныйUB220610R

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molinari, F., Malara, N., Mollace, V., Rosano, G., Ferraro, E. Animal models of cardiac cachexia. Int. J. Cardiol. 219 (15), 105-110 (2016).
  2. Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods. Mol. Biol. 573, 115-137 (2009).
  3. Verma, S. K., Krishnamurthy, P., Kishore, R., et al. Transverse aortic constriction: a model to study heart failure in small animals. Manual of Research Techniques in Cardiovascular Medicine. Ardehali, H. , Wiley, J., & Sons. 164-169 (2014).
  4. Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure. Development of novel therapies, past and present. Circ. Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
  5. Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (18), Erratum in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Page 9907 8277-8281 (1991).
  6. Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292 (5), 2119-2130 (2007).
  7. Deschepper, C. F., Olson, J. L., Otis, M., Gallo-Payet, N. Characterization of blood pressure and morphological traits in cardiovascular-related organs in 13 different inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 97 (1), 369-376 (2004).
  8. Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. T. Transverse aortic constriction in mice. J. Vis. Exp. (38), April 21 (2010).
  9. Hu, P., Zhang, D., Swenson, L., Chakrabarti, G., Abel, E. D., Litwin, S. E. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285 (3), 1261-1269 (2003).
  10. Faerber, G., et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: Reduced peroxisome proliferator-activated receptor ϒ coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (2), 492-500 (2011).
  11. Andersen, N. M., Tang, R., Li, L., Javan, H., Zhang, X. Q., Selzman, C. H. IKK-β inhibition prevents adaptive left ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 178 (1), 105-109 (2012).
  12. Nemska, S., Monassier, L., Gassmann, M., Frossard, N., Tavakoli, R. Kinetic mRNA profiling in a rat model of left ventricular hypertrophy reveals early expression of chemokines and their receptors. PLoS ONE. 11 (8), 0161273(2016).
  13. Liao, Y., et al. Echocardiographic assessment of LV hypertrophy and function in aortic-banded mice: necropsy validation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (5), 1703-1708 (2002).
  14. Stansfield, W. E., et al. Characterization of a model to independently study regression of ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 142 (2), 387-393 (2007).
  15. Beetz, N., et al. Ablation of biglycan attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis after left ventricular pressure overload. J. Mol. Cell. Cardiol. 101, December 145-155 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи