Этот протокол направлен для описания метода для изучения Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +- срабатывает митохондриальной отек изолированных митохондриях SH-SY5Y клеток, шаг за шагом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Митохондриальной Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек Assay
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Производства АТФ, окислительное фосфорилирование является основной функцией митохондрий. Митохондрий у высших эукариот также участвуют в цитозольной Ca2 + буферизации, и производства АТФ в митохондриальной может быть опосредовано intramitochondrial бесплатно Ca2 + концентрации. CA2 + водоудерживающего потенциала может рассматриваться как митохондрии возможность сохранить кальция в матрице митохондриальной. Накопленные внутриклеточных Ca2 + приводит к проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, назвал открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), что приводит к утечке молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа. CA2 +-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Здесь мы описываем двух анализов для изучения Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях. После определенного количества Ca2 + добавляются все шаги можно завершить за один день и записан Считыватель микропланшетов. Таким образом, эти два простых и эффективных анализов могут быть приняты для оценки Ca2 +-связанных митохондриальной функции.
Введение
Митохондрии являются основной сотовой органов производить почти 95% АТФ, используемые окислительного фосфорилирования в mammalian клетках. Сообщается, что поглощенных всех концентрации Ca2 + , митохондрии, присутствие ADP и неорганического фосфата может использоваться для фосфорилировать ADP синтеза АТФ1. Когда концентрация цитозольной Ca2 + идет выше порога, митохондрии можно поглощение Ca2 + быстро и измеряем его медленно. Таким образом функционирования митохондрий может приток увеличение цитозольной Ca2 +. Отношения к участию в окислительного фосфорилирования, митохондриальных Ca2 + также принимают участие в цитозольной кальция сигналов и активировать механизм митохондриальной apoptotic, вызывая открытие mPTP в внутренней митохондриальной 2мембраны. Широко признано, что аномальные повышение внутриклеточной Ca2 + может вызвать митохондриальной массивные отеки, открыв mPTP3. Таким образом, этот протокол призван оценить функцию митохондрий путем определения количественных показателей митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-trigged митохондриальной отек.
CA2 + водоудерживающего потенциала является измерение способности митохондрий цитозольной поглощение кальция. Митохондрий может регулировать кальций зависимых клеточных процессов поглощения кальция в виде неактивных преципитаты и буфере цитозольной свободного кальция. Нарушением Ca2 + водоудерживающего потенциала происходит в стресс явления, связанные с ограничением энергии и даже нейродегенеративных заболеваний4,5. Изолированных митохондриях или digitonin-permeabilized клетки могут использоваться для идентификации Ca2 + водоудерживающего потенциала, и повышенной способностью накапливать Ca2 + , изолированных митохондриях с дополнительная глутамата и малат не осуществляется митохондриальной изоляции процедура6. Титруемая количество digitonin должен быть использован для разрушения мембран плазмы из различных типов клеток. Hexapotassium соль Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя, Ca2 +-чувствительных клеток impermeant видимый свет возбудимых индикатор, был широко используется7. CA2 +-привязки зеленого флуоресцентного красителя является показателем низкого сродства и используется, чтобы показать, что внутриклеточные бесплатно Ca2 + концентрации продолжать расти в течение длительного (5 мин) стимуляцию8. Этот метод был менее чувствительны, чем метод радиоактивных фильтр, но была значительно упрощена. Дополнительные Ca2 + возвышает кальция Зеленая Флуоресценция и Ca2 + поглощение митохондрий возвращает флюоресценция базовой линии. Последовательных добавлений Ca2 + были сделаны до тех пор, пока митохондрии не поглощения extramitochondrial Ca2 + 9. Считыватель микропланшетов флюоресценции может использоваться непрерывно доклад кальция зеленой флуоресценцией.
После Ca2 + накопления митохондрии деполяризованный, выпущенный Ca2 + в среду и начал набухать. CA2 +-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Электронная микроскопия и уменьшение поглощения света на 540 Нм может использоваться для измерения Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек10,11. Митохондрии тома можно непосредственно определяется Форвард угол рассеяния света12, где уменьшение поглощения отражают пассивной отек митохондриальной матрицы.
Здесь, мы иллюстрируем методологии для изучения митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях от SH-SY5Y клеток.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. изоляция митохондрий
Примечание: Все решения и оборудование следует охладить до 0 - 4 ° C и хранится на льду.
- Семя клетки6 SH-SY5Y около 3 x 10 на 10 см клетки культуры блюдо. Культура клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная среднего орла с 10% плода бычьим сывороточным, пенициллин (100 ед/мл)-стрептомицином (100 мкг/мл). Сохранять при 37 ° C в инкубаторе, содержащей 5% CO2 на ночь.
Примечание: по крайней мере 1-2 x 107 SH-SY5Y клетки необходимы для калибровочных изоляции. - Удаление среды и вымыть клетки с около 1 мл холодного льда PBS в блюдо культуры клеток 10 см 3 раза.
- Добавить новый 1 мл холодного льда PBS в 10 см клетки культуры блюдо и скрип адэрентных клеток в новой 1,5 мл трубки. Центрифуга на 800 x g 10 мин при 4 ° C.
- Во время центрифугирования Подготовьте 5 мл митохондриальной изоляции буфера (250 мм сахарозы, 10 мм HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-пиперазина ethanesulfonic кислоты), 10 мм KCl, 1,5 мм MgCl2, 1 мм ЭДТА) дополнены 50 мкл акций ингибиторы протеазы решение (100 x концентрации; 1 ЭДТА бесплатные таблетки растворяют в 500 мкл ddH2O).
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 1 мл буфера митохондриальной изоляции. Инкубируйте 1,5 мл на льду за 30 мин.
- Лизируйте подвесной клетки с стекла гомогенизатора (15-25 штрихи) вверх и вниз вручную на льду.
Примечание: Убедитесь, что есть никаких пузырей, когда гомогенизированные клетки. Граф нетронутым клеток и обнажённая ядер Микроскоп визуально и подтвердить, что > 90% клеток поломка произошла. - Перенесите огневки в 1,5 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C для удаления мусора (ядер и оставшихся нетронутыми клетки).
- Перевести супернатант в новой 1,5 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут 4 ° C.
- Супернатант передать новой трубки и центрифуги в 14.000 x g 15 мин 4 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы, содержащие митохондрии с 1 мл буфера митохондриальной изоляции.
- Центрифуга решение для 15 мин на 14 000 x g 4 ° C для митохондрий.
- Результате гранулы митохондрий должны хранится на льду и высокомобильна в 50-100 мкл KCl СМИ (125 мм KCl, 2 мм K2HPO4, 1 мм MgCl2, 20 мм HEPES, 5 мм глутамата, малат 5 мм и 2 мкм ротенон, рН 7,4) согласно Пелле тома перед любой осел Ай.
- Используйте 5 мкл митохондриальной решения для измерения концентрации митохондриальных белок стандартного анализа BCA, измерения OD562 с помощью пластины читатель13.
2. Определение митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала
- Подготовить KCl СМИ и добавить Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя до конечной концентрации 0,5 мкм до эксперимента.
- Передача 1 мл изолированных митохондриях (0,4 мг/мл) в СМИ KCl, содержащий 0,5 мкм Ca2 +-привязка зеленый Люминесцентную краску в каждом 6-ну пластины хорошо.
- Инкубировать митохондрии и Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя в пластину 6-ну при комнатной температуре в защищенном от окружающего света за 1 мин добавить 4 мкл аликвоты 20 мм CaCl решение2 (20 мм CaCl2, 127 мм KCl, 1 MgCl2 20 мм HEPES, 5 мм глутамата, 5 мм малат, рН 7,4) для каждой пластины 6-Ну хорошо, с помощью автоматического обойтись параметр ввести 200 нмоль Ca2 +/mg митохондриальных белок.
- Используйте спектрометр флюоресценции для мониторинга флуоресценции изменений каждые 3 s 2 мин с волны возбуждения 506 Нм и длина волны излучения 531 Нм. Пластины оснащен встряхивания на 600 об/мин для 3 s между чтений, контролируемых программного обеспечения (рис. 1).
- Добавьте дополнительные 4 мкл Алиготе 20 мм CaCl2 решения для каждой скважины и отслеживать изменения флюоресценции каждые 3 s 2 мин повторить этот шаг до тех пор, пока флюоресценция увеличивается с течением времени.
Примечание: Митохондрий оспариваются с добавил Ca2 + свидетельствует увеличение записи флуоресценции. При открытии mPTP флюоресценция возрастает со временем. - Интерпретируйте общее количество Ca2 + добавлены до тех пор, пока mPTP открывается как Ca2 + водоудерживающего потенциала.
3. Определение Ca 2 +-индуцированной митохондриальной опухоль
- Подготовьте KCl СМИ до эксперимента.
- Передача 1 мл изолированных митохондриях (0,4 мг/мл) в СМИ KCl в каждом 6-ну пластины хорошо.
- Добавьте 10 мкл 20 мм CaCl2 водный раствор (500 нмоль/мг митохондриальных белок) в митохондриальных белок, чтобы вызвать митохондриальной отек.
- Запись уменьшение поглощения на 540 Нм каждые 3 s на Считыватель микропланшетов контролируемых программного обеспечения для 10 мин (рис. 2). Флуоресценции изменения были вызваны притоком растворенных веществ через внутреннюю мембрану митохондрий.
Примечание: Снижение поглощения на 540 Нм соответствует опухшие митохондрий. Если читатель не наблюдать уменьшение поглощения, больше читать интервал или читая время может быть принят.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представитель результаты Ca2 + водоудерживающего потенциала:
Результаты были высказаны как флуоресценции значения. С дополнительные импульсы Ca2 + (200 nmols/мг митохондриальных белок), увеличилось на двойной выше базовой линии с открытием mPTP флуоресценции. 5 мкм Bongkrekate (BKA), ингибитор Ca2 +-индуцированной mPTP открытия, или 1 мкм atractyloside (ATR), активатор Ca2 +-индуцированной mPTP открытия, были добавлены в изолированны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь, мы описали простой и эффективный протокол для митохондриального Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек пробирного.
Для митохондриального изоляции убедитесь, что все материалы и трубы находятся на льду, особенно когда гомогенизации клетки. трипсин 0.25%-ЭДТА может также использоваться для отсоединения клетки от блюдо для 5 минут при 37 ° C. После 15-25 ударов необходимо соблюдать нетронутыми мембраны клетки под микроскопом и...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
X. Sun руководил экспериментов. Wei Li выполняются экспериментов. Чэнь Чжан и X. солнца написал бумагу.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантов Грант Грант от NSFC (81371226) и выдающийся ученый Шаньдун (JQ201421).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Номер | ATCC: CRL-2266 | ||
| Кальций зеленый-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-связывающий зеленый флуоресцентный краситель |
| полные ингибиторы протеазы | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| гомогенизатор стекла | Kimble Chase | 9885303002 | |
| глутамат | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| малат | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| ротенон | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan флэш-приборы | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| атрактилозид | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| Дульбекко с высоким содержанием глюкозы s модифицированная среда Eagle | Hyclone | SH30022 | 4,5 г/л глюкозы, L-глутамина, без пирувата натрия |
| фетальная бычья сыворотка | Hyclone | SV30087 | |
| пенициллином | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| стрептомицин | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA набор для анализа | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Чашка для клеточных культур 10 см | NEST | 704001 |
Ссылки
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
