Методическая статья

Оценка дефекты обструкции мочевыводящих путей Junction Метиленовый синий краситель инъекции

DOI:

10.3791/56247

⸱

12 октября 2017 г.

1Cancer and Developmental Biology Laboratory, National Cancer Institute, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метиленовый синий краситель инъекции в почечной лоханки облегчает оценку дефекты обструкции мочевыводящих путей соединения во время мыши эмбриональные мочевыводящих путей развития. Здесь описывается протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дефекты обструкции мочевыводящих путей соединения являются врожденные аномалии, вызывая гидронефроз и hydroureter. Дефекты обструкции мышиных мочевыводящих путей перехода можно оценить по отслеживание потока красителя метиленового синего в мочевыделительной системы. Метиленового синего красителя инъецируется в почечной лоханки перинатальной эмбриональных почек и краска поток контролируется от почечной лоханки почки через Мочеточник и в просвете мочевого пузыря после применения гидростатического давления. Накопление краски будет видно в просвете мочевого пузыря нормальное перинатальной мочевыводящих путей, но будет ограничен между почечной лоханки и конечной точкой аномальные мочеточника, если встречаются препятствия мочевыводящих путей. Этот метод способствует подтверждение мочевыводящих путей перехода препятствий и визуализация гидронефроз и hydroureter. Эта рукопись описывает протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки для подтверждения мочевыводящих путей перехода препятствий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мочевая система состоит из пары почек и мочеточников и общей мочевого пузыря и мочеиспускательного канала. Основная функция мочевой системы является поддержание гомеостаза организма путем управления водно-электролитного баланса крови. Почки фильтрации крови для контроля концентрации электролитного и кислотно щелочной баланс и производят моча выводят лишнюю воду и отходы, включая растворенных веществ и метаболитов. Затем моча транспортируется через Мочеточник от почечной лоханки почки к bladderin однонаправленный манере, где она хранится и в конечном счете ликвидирована через мочеиспускательный канал1.

Прямые трубы, происходящих из нефрической протока мочеточников. После бутонизации из нефрической протока на эмбриональных день 10.5 (E10.5) в мышь, стебель мочеточника удлиняется и отличает в многослойной структуре, называемой Уротелий, который является непроницаемой между мыши, E12.5 и E16.5. Мезенхимальные клетки, окружающие стебель мочеточника также дифференцированы на три слоя, состоящий из внутреннего стромальных клеток, промежуточные толстые гладких мышечных клеток и наружной adventitial фибробластов. Уретеральные перистальтические волны в почечной лоханки, распространяются через слой гладких мышц стенки мочеточника в мочевой пузырь для транспортировки мочи2,3, которая производится начиная E16.5 в мышь1.

Врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей (CAKUT) относятся к числу наиболее частых генетических заболеваний, в около 1% человеческого плода1,4и состоит из целого ряда фенотипов, включая гидронефроз и hydroureter. Ненормальное накопление мочи в результатах почки и мочеточника в формирование почек и hydroureter hydronephrotic. Одной из причин формирования гидронефроз или hydroureter является обструкции мочевыводящих путей. Ureteropelvic перекрестка обструкции (UPJO) вызвано аномальным мочи потока из-за закупорки между проксимального отдела мочеточника и почечной лоханки, что привело к гидронефроз и проксимальный hydroureter сужение с углы или стойких складной5, 6. Кроме того внематочная вставки дистальной части мочеточника в стенке мочевого пузыря или репродуктивного тракта называется ureterovesical перекрестка обструкции (UVJO). UVJO можно также вызвать гидронефроз и hydromegaureter формирования7,,8. Дефект Джанкшен (UVJ) дополнительные ureterovesical-vesicoureteric рефлюкс (VUR). VUR характеризуется поток Ретроградная мочи из мочевого пузыря к почек на UVJ. По сравнению с UVJO, перинатальной эмбрионов с VUR не показывают отчетливо растянутый hydronephrotic почек или тяжелой hydroureter фенотип9.

Лабораторные мыши струя мочи может быть проверен инъекции красителя, например, метиленовый синий, в почечной лоханки9. Injectedmethylene синий решение будет проследить траекторию мочи от почечной лоханки через Мочеточник и в мочевой пузырь. Гидронефроз могут быть признаны расширение красителя в почках. UPJO могут быть обнаружены как блокирование потока красителя на проксимальной мочеточник с растянутый почечной лоханки5. Любое дилатация мочеточника, обозначается расширены диаметр демонстрирует пример hydroureter. Наконец накопление краски на стенку мочевого пузыря или на сайте репродуктивного тракта указывает UVJO с растянутый hydronephrotic почек и расширены hydromegaureter7,10. Чтобы обнаружить VUR, раствор красителя инъецируется в мочевого пузыря и последующих Ретроградная поток контролируется в почках9.

Здесь представлен протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки перинатальной эмбриона. Этот протокол позволяет трассировки потока мочи от почечной лоханки через Мочеточник и в мочевом пузыре и проверяет потенциальные мочевыводящих путей перехода препятствий, таких как UPJO или UVJO.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

мышей (Wnt5a flox / flox мышей (Wnt5a tm1.1Tpy) и Dll1Cre линии, UVJO модель мыши) 7 осуществлялось согласно NIH руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных и учился под протоколом, утвержденным NCI-Фредерик животное уход и использование Комитетом.

1. Подготовка раствор метиленового синего красителя

  1. измерения 0,1 г, метиленовый синий порошок.
  2. Растворения метиленового синего в 10 мл физиологическим или 1 x-фосфатный буфер (PBS), vortexing.
  3. Фильтр 10 мг/мл раствора метиленового синего с шприц фильтр (Размер поры мембраны 0.45µm), чтобы устранить засорение во время инъекции.
  4. Сборка стерильные головы вены набор (27GX3/4 ″) с одноразовой шприц 3 мл и заполните шприц 3 мл фильтруют раствора метиленового синего.
    Примечание: Чтобы предотвратить гидростатического давления и потока последующего окрашивания, поместите кончик иглы выше шприц, заполненные раствором метиленового синего.

2. Рассечение дородовой эмбрионов

  1. чистый рассекает ножницы и щипцы с 70% этанол.
  2. Для сбора перинатальной эмбрионов в E18.5 или E19.5, усыпить беременных мышей использованием CO 2 ингаляции сначала и затем выполнить шейки матки дислокации согласно рекомендациям NIH.
    Примечание: Беременных женщин мыши обычно рожает начиная с E18.5, однако, больше почек, легче манипулировать. Таким образом почками в E19.5 ближе к рождению проще выполнять этот анализ. Однако щенков с двусторонними мочевыводящих путей препятствия умирают после рождения. В зависимости от характеристики экспериментальной мышей, соответствующую коллекцию день/время должна определяться эпирически.
  3. Спрей 70% этанол на вентральной поверхности живота, а затем открыть брюшной полости вентрально использованием рассечения ножницы и щипцами.
  4. Поднять всю матку и отделить его от тела путем резки с рассечения ножницы на кончики рогов матки.
  5. Смыть всю матку с ПБС в чашке Петри.
  6. Матки сегментарно с рассечения ножницами вырезать и удалить плацентарной decidua с рассечения щипцы подвергать эмбрионов в желтке sacs.
  7. Сначала удалить желточного мешка и затем удалите амниотической мембраны с рассечения щипцы освободить перинатальной эмбрионов.
  8. Обезглавить эмбриона с рассечения ножницы. Вытрите избыток крови с стерильные марлевые подушечки. Придавить эмбриона с его вентральной поверхности вверх на рассечения микроскоп оснащен цифровой камерой для воображения. Собирать его хвост для генотипирования, в случае необходимости.
    Примечание: Выполнение инъекции одного эмбриона в то время,.
  9. Тщательно открыть брюшной полости эмбриона с щипцами, разрывая на кожу. Затем, тщательно удалить избыток органов и тканей, таких как печень, желудок и кишечник с щипцами, вырезая их или потянув их подвергать почек, мочеточников и мочевого пузыря, которые расположены дорзально ( рис. 1A). Поглощают избыток крови из расчлененных эмбриона с стерильные марлевые подушечки, в случае необходимости.
    Примечание: Избыток крови мешает идентификации почечной лоханки для инъекций краситель.

3. Инъекции красителя метиленового синего в почечной лоханки и мониторинг потока краска

  1. удалить пузыри на иглы и трубки, изгоняя раствор метиленового синего из кончик иглы на гидростатическое давление. Поднимите шприц, содержащие раствор красителя над уровнем кончик иглы для начала потока, а затем опустите шприца, чтобы остановить поток.
  2. Вставить иглу в почечной лоханки вблизи проксимального отдела мочеточника, стараясь не нарушить его однажды помещены. Выполнять инъекции красителя в почку для определения ее непроходимость мочевыводящих путей.
    : Примечание краска инъекции в любой ненормальной почек 7 первый, следуя так же определить его обструкции мочевыводящих путей.
  3. Поднимите шприц до около 20 см для обеспечения гидростатического давления и пусть 15 мкл - 60 мкл потока раствора красителя. Скорость потока будет около 3 мкл/s если шприц возникает на этой высоте над эмбриона.
  4. Мониторинг синий цвет красителя, начиная в почечной лоханки, затем в длину мочеточника и наконец в просвет пузыря.
    Примечание: Занимает около 5 s чтобы увидеть слабая краска цвета появляются в просвет пузыря, если мочеточника в мочевой пузырь правильно вставлен. Разрешить краситель накопить на заблокированный сайт около 15 s если не краска цвет появляется в просвет пузыря.
  5. Место шприца до остановки потока краски и удалите иглу из почки.
  6. Принимать изображения и почек, мочеточника, мочевого пузыря с раствор красителя с помощью камеры и изображений программы подключены к стереомикроскопом.
  7. Сделать запись гидронефроз почки, hydroureter и окончательной позиции раствор красителя в лаборатории ноутбука.
  8. Выполнения инъекций контралатеральной почки как описано в разделах 3.1) до 3.5) и позволяют краска поток около 20 s в целом.
    Примечание: В просвет пузыря будет наполнен раствор красителя, обозначается сильным синим цветом, если мочеточника правильно вставлена в просвет пузыря. После оценки Джанкшен обструкции мочевыводящих путей, мочевого пузыря и мочеточников может устанавливаться для разрезания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почек и нижних мочевых расположены спинной большинства других внутренних органов, как печень и кишечника. После удаления этих других внутренних органов, пару почек и мочеточников и один мочевого пузыря являются видимыми (рис. 1A). После успешного рассечение краситель вводят в почечной лоханки будет вытекать из почек в мочевой пузырь через Мочеточник. Почечной лоханки это воронка как расширенные проксимального отдела мочеточника в почках. Таким образом краска ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мыши почки начинают в E16.5 функциональных и тестирования внедрения краситель теоретически возможно с этого момента времени. Однако почки слишком малы, чтобы быть вводили раствор красителя и фенотипы гидронефроз и hydroureter не наблюдаются четко поскольку эти фенотипы вторичный эффект мочи, построен из-за ненормального мочи. Эти фенотипы, от препятствий, таких как UPJO или UVJO, очевидны в E18.5 растянутый почек и мочеточников. Большие почки эмбрионов в E19.5 или новорожденных щенков, легче манипулировать, чем те из эмб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Я благодарю д-р Алан O. Perantoni (CDBL/NCI/низ) для поддержки представления этой рукописи. Я также благодарю д-р Майкл Холл (CDBL/NCI/низ) и Nirmala Шарма (CDBL/NCI/низ) для редактирования этой рукописи. Я благодарен к Лай Тханг (SAIC) за его отличную мыши животноводства. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения, Национальный институт рака и центр для исследований рака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Метиленовый синийSigma-AldrichM9140
Quality Biological Inc. НОРМАЛЬНЫЙ ФИЗРАСТВОР - 500млFisherscientific50-983-204
3 мл одноразовый шприц с наконечником BD Luer-LokBD309657
Acrodisc Шприцевые фильтры с мембраной SuporPall Corporation4614
Exel Наборы вен для кожи головы (бабочка); 27G x 3/4" 12" EXELINT26709
Деликатные операционные ножницыRoboz Surgical Instrument Co.RS-6702
Микрорассекающие щипцыRoboz Surgical Instrument Co.RS-5135
Пинцет Дюмона; Шаблон #5Roboz Surgical Instrument Co.RS-5045
BD Иглы PrecisionGlide 30 G x 1/2"BD305106

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
  2. Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
  3. Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
  4. Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
  5. Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
  6. Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
  7. Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
  8. Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
  9. Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
  10. Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи