Жить изображений миграции эпителиальных клеток молочной железы после переходных истощение TIP60

Краткое содержание

Здесь мы представляем, мониторинг в реальном времени миграции клеток в assay ранозаживляющее, с использованием обедненного TIP60 MCF10A эпителиальных клеток молочной железы. Осуществление методы визуализации живой клетки в нашем протокол позволяет нам анализировать и визуализировать одной ячейки движения в режиме реального времени и во времени.

Аннотация

Ранозаживляющее assay является эффективным и один из самых экономичных способов для изучения миграции клеток в пробирке. Условно изображения взяты в начале и в конце эксперимента с помощью микроскопа фазово контрастной и миграции способности клеток оцениваются путем закрытия раны. Однако движение клеток динамичное явление, и обычный метод не позволяет для отслеживания движения одной ячейки. Для улучшения текущих анализов, ранозаживляющее, мы используем методы визуализации клеток для мониторинга миграции клеток в режиме реального времени. Этот метод позволяет нам определить коэффициент миграции клеток, основанный на ячейке, системы слежения и обеспечивает более четкое различие между клеток миграции и пролиферации клеток. Здесь мы демонстрируем использования изображений живой клетки в ранозаживляющим анализов для изучения миграции различных способностей эпителиальных клеток молочной железы под влиянием присутствия TIP60. Как клетки моторики весьма динамичен, наш метод обеспечивает более понимание процессов заживления чем снимок закрытия РАН с традиционные методы визуализации используется для заживления ран анализов.

Введение

ВИЧ-ТАТ интерактивная белков 60 кДа (TIP60) является лизин Ацетилтрансфераза, который может acetylate гистона и -гистоны^1,2. Его функции находятся будет иметь последствия в нескольких сигнальных путей, включая транскрипции, ремонт повреждения ДНК и апоптоз^{1,3,4,5,6, 7 , 8}. Кроме того, TIP60 часто downregulated в рака и его Даунрегуляция коррелируется с метастазами рака и бедных выживание ставки^{,9,10,11,12 13,14}. Метастазы опухоли является основной причиной смерти, связанных с раком. Это многоэтапный процесс, и первый шаг метастазов включает миграции и вторжение опухолевых клеток в прилегающих тканей^15,16. Для того, чтобы сделать это, опухолевые клетки сначала необходимо отсоединить от массы первичной опухоли, либо в форме коллективно вторжение ячейку листа или как отдельный единичных клеток¹⁷. В ходе этого процесса опухолевые клетки часто проходят эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT), что привело к изменениям в морфологии и ячейки адгезии возможности^17,18.

Были разработаны несколько методы для изучения миграции и вторжения способность опухолевых клеток в пробирке. Среди них-заживление assay является наиболее эффективным и экономичным¹⁹. Во-первых этот метод предполагает создание искусственного разрыв на вырожденная монослое клеток, таким образом позволяя клетки мигрировать и разрыва. Во-вторых может быть захвачен изображения пробелы в начале и в конце эксперимента. Наконец сравнение разрыва используется для определения скорости миграции клеток. Микроскопом фазово контрастной обычно используется для захвата изображения для обычных анализов, ранозаживляющим. Еще одно преимущество-заживление пробирного является, что он частично напоминает в естественных условиях миграции опухолевых клеток. Аналогично в естественных условиях метастазов опухоли клеток миграции в заживление анализы показывает коллективного миграцию эпителия листов и миграции отдельностоящий одиночных клеток.

Однако миграции клеток, как известно, быть динамичным, и существует необходимость в документе движение клеток в режиме реального времени. Например обычные ранозаживляющим пробирного не позволяют исследователем для анализа движения одной ячейки. С другой стороны клетки культивировали для заживления ран анализов зачастую голодали сыворотки ингибировать пролиферацию клеток. Это делается для исключает возможность разрыва вследствие пролиферации клеток. Тем не менее будет по-прежнему существовать некоторые распространения и гибель клеток и фазово контрастной снимки, сделанные до и после эксперимента не в состоянии провести различие между ними.

Тепловизионная техника клеток устраняет это ограничение обычных анализов, ранозаживляющим. С помощью микроскопа жить изображений в сочетании с CO₂ инкубатора и контроля соответствующей температуры, исследователи могут измерять размер интервала и ее показатель закрытия с течением времени, в то время как отслеживание движения активно переход клеток расположен на советы инвазивные фронт. Следовательно осуществление-клеток imaging для мониторинга миграции клеток не только обеспечивают лучшую визуализацию миграции клеток, но будет также предусмотрена возможность различать клеток миграции и пролиферации клеток, обеспечивая тем самым более надежный анализ миграции клеток.

В этом исследовании MCF10A эпителиальных клеток молочной железы были использованы продемонстрировать сочетание ранозаживляющим пробирного и изображений для изучения роли TIP60 в ячейке миграции клеток. Истощение TIP60 приводит к способности рост миграции в MCF10A клетках.

Протокол

1. Подготовка

1. Подготовка MCF10A питательной среды: Дульбекко изменение средних орла (DMEM) / F12 (1:1) с 5% лошадь сыворотки, 20 нг/мл эпителиального фактора роста, гидрокортизон 0.5 мг/мл, 100 нг/мл холеры токсин и 10 мкг/мл инсулина.
2. Подготовить сыворотки бесплатно средний: DMEM/F12 (1:1) с 20 нг/мл эпителиального фактора роста, гидрокортизон 0.5 мг/мл, 100 нг/мл холеры токсин и 10 мкг/мл инсулина.
3. Используйте следующую последовательность siRNA:
   siControl:
   Вперед: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
   Реверс: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
   siTIP60:
   Вперед: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
   Реверс: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
4. Использование 10-см клетки культуры блюда и 24-ну плиты.

2. Переходное истощение TIP60 с использованием малых интерферирующих РНК

1. День 1 аликвота 15 мкл Реагента трансфекции (например, Lipofectamine RNAiMAX) и 2 мл сокращение сыворотке среднего (например, Opti-MEM) и смешайте их с 10 мкл каждого интерферирующей РНК (акции 10 мкм), соответственно.
2. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
3. Семена, 1 x 10-⁶ MCF10A клетки вместе с 3 мл питательной среды в 10 см блюдо. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
4. Добавьте смесь siRNA по капле на 10 см блюдо.
5. Встряхните блюдо, чтобы обеспечить, что клетки, равномерно распределенных до сдачи его в инкубаторе 37 ° C.
6. После 6 часов инкубации замените малых интерферирующих РНК содержащих среднего 8 мл свежей питательной среды.
7. На 2 день подготовить еще одну партию siRNA смесей и инкубировать их при комнатной температуре в течение 20 мин.
8. Аспирационная, 8 мл культуры среднего добавлен на 1 день и заменить его с 3 мл свежей питательной среды.
9. Добавьте вторую партию siRNA смесь блюд по капле. Встряхните блюда для обеспечения что реагенты смешиваются полностью до сдачи их в инкубаторе.
10. После 6 часов замените малых интерферирующих РНК содержащих среднего 8 мл свежей питательной среды.

3. Семена клетки для Assay заживление ран

1. На 3 день отказаться от среднего и вымыть клетки один раз с 2 мл фосфат амортизированное saline (PBS) буфера. Удалить в буфер PBS.
2. Trypsinize siControl и siTIP60-лечение клетки, добавив 1 мл 1 x трипсина ЭДТА буфера к пластине. Положил его обратно в инкубаторе для 20 мин.
3. Добавьте 4 мл полной питательной среды для каждой пластины, Ресуспензируйте клетки, закупорить и передавать их на 15 мл.
4. Центрифуга на 200 г на 5 мин и удалить супернатант.
5. Вновь приостановить клетки с 5 мл сыворотки свободной среды и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.
6. Готовят суспензию клеток 6 x 10⁵ клеток/мл для siControl и siTIP60; Убедитесь, что клетки перемешанных. Добавьте 500 мкл суспензии клеток одной скважиной 24-ну пластины для обеспечения 100% confluency. Семена 5-6 скважин для siControl и siTIP60.
7. Осторожно встряхните пластины взад и вперед, а затем стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение. Избегайте круговое движение. Оставьте пластину в инкубаторе для 24 h.
8. Урожай оставшиеся ячейки для проверки нокдаун эффективности TIP60. Чтобы сделать это, центрифуга оставшиеся суспензию клеток на 200 г на 5 мин и удалить супернатант.
9. Изолировать РНК с помощью коммерческих реагента, после производителя протокол и приступить к количественной ПЦР в реальном времени для оценки эффективности нокдаун.

4. Создайте раны

1. Проверить под микроскопом контраст этапа для обеспечения полностью прилагается клетки. Наблюдать за клетки под микроскопом (4 X, 10 X и 20 X увеличение) для обеспечения, что клетки полностью привязаны, что сформировалась вырожденная монослоя клеток.
   Примечание: siControl клетки обычно придают лучше чем siTIP60 клетки. Ожидается, что это потому, что истощение TIP60 делает клетки более мезенхимы как²⁰. Здесь используется обычный benchtop белый свет фазы контраста Микроскоп.
2. Для создания рану, аккуратно скретч прямую линию по центру скважины с кончиком пипетки 200 мкл; длина созданного раны же как диаметр скважины. Повторите этот шаг для всех оставшихся скважинах. Используйте новый наконечник пипетки для каждой скважины.
3. Осторожно промыть каждый хорошо 5 раз с использованием сыворотки свободный средних удалить отдельные клетки.
4. Добавить 1 мл сыворотки свободной среды в каждой скважины и провести клеток.

5. Установка клеток

1. Включите микроскопом и температурного контроля по крайней мере 1 час перед настройкой-клеточной воображения, чтобы гарантировать, что температура в камере достигает 37 ° C.
2. Включите подачу газа двуокиси углерода (CO₂) перед началом визуализации клеток. Задайте CO₂ концентрации 5%.
3. Место пластину 24-хорошо на сцене микроскопа и выберите объектив с 10 крат для воображения. Прямые испускаемого света для окуляров вместо камеры и настроить фокус, чтобы найти рану и клетки вокруг него.
   Примечание: В этом случае, белый свет с Фазовый контраст был использован.
4. Используйте систему клеток наблюдателя отметить позицию рану в каждой скважине.
   Примечание: Стадии автоматизированной системы клеток позволяет для захвата изображений в нескольких позициях. Изображения взяты на все отмеченные позиции один раз каждый интервал.
5. Настройка состояния времени: 1 h интервала и продолжительность 72 ч; Согласно этой настройки, система будет принимать фотографии на каждом помеченную позицию каждый час в течение 72 ч. Настройка любой желаемый временной интервал и период для мониторинга.
   Примечание: Здесь, в течение 72 ч лучше потому что эти клетки начинают умирает после 72 ч в среде, свободной от сыворотки.

6. отслеживать движение одной ячейки

1. Экспорт данных после 72 ч. экспортировать данные как изображения в формате JPEG, так и видео в формате AVI.
   Примечание: Это важно, потому что ImageJ программного обеспечения можно признать только видео в формате AVI. Скорости миграции различных клеток между siTIP60 и siControl клетки можно ясно наблюдать в видео.
2. Откройте видео AVI в ImageJ программного обеспечения.
3. Открыть MTrackJ плагин (плагин должны быть загружены и установлены отдельно): Плагины > MtrackJ.
4. Добавление дорожки для одиночных клеток, выбраны из видео, нажав на вкладку «Добавить» на панели инструментов MtrackJ. Выберите ячейку на кончике инвазивных фронта и ячейки, можно перенести на свой собственный (сингл клеточной миграции). Следовать за движением выбранной ячейки на видео и отслеживать их с помощью MtrackJ.
5. Измерьте расстояние движения, нажав на вкладку «измерения» на панели инструментов.
   Примечание: Здесь, почти не клетки в siControl переехал в качестве единичных клеток, что делает его трудным для измерения движения одной ячейки, в то время как многие из клеток siTIP60 переехал в качестве единичных клеток. Однако движение клеток на инвазивные передней еще можно проследить и рассчитывается в клетках siControl и siTIP60.
6. Сохраните видео с треков в формате AVI.

7. Количественная оценка способности миграции клеток

1. Для количественной оценки выберите изображения на 0 h и изображения h «n», где «n» относится к timepoint, когда siTIP60 или siControl клетки полностью закрыли рану.
   Примечание: Здесь, 48 h был выбран, как раны в siTIP60 клетках были почти полностью закрыт.
2. Количественно определить процент миграции с помощью ImageJ по следующей формуле: (область раны на 0 h - область раны на «n» h) / область раны на 0 h x 100.

Результаты

Генеральная схема Assay переноса жить-на основе визуализации ячеек
Рисунок 1A является схема настоящего Протокола. Transfected клеток MCF10A с siControl, показан типичный эпителиальных морфологии. После истощения TIP60 MCF10A клетки были более мезенхимальных по сравнению с контролем клеток (рис. 1B).

Изучение эффективности TIP60 нокдаун

Обсуждение

Известно, что в процессе миграции клеток, клеток можно либо переместить в виде адэрентных листов; свободные кластеры; или один, изолированных клеток. Режим и динамику клеток вторжения может варьироваться от одного состояния к другому, и фенотип можно изменить в пределах часов. Традиционные ранозаживляющим пробирного основана на снимок фотографии взяты из микроскопа с длительный промежуток времени, например, 12 или 24 часа. Это делает его трудно уловить динамику закрытия ран и шаблон ячейки движения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетка MCF10A	ATCC	CRL-10317TM	Эпителиальная клетка молочной железы
среда DMEM/F12 (1:1)	Gibco	11330-032	Культуральная среда MCF10A
Эпителиальный фактор роста (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Добавки для культуральных сред MCF10A
Холерный токсин	Sigma-Aldrich	C-8052	Добавки для культуральных сред
MCF10AГидрокортизон	Sigma-Aldrich	H-0888	Добавки для культуральных сред MCF10A
Инсулин	Sigma-Aldrich	I-1882	Добавки для культуральных сред MCF10A
Домашняя сыворотка	Gibco	16050-122	Добавки для культуральных сред MCF10A
Трипсин	Gibco	25200-056	Для MCF10A отсоединить от планшета
Гемацитометр	Fisher Scientific	267110	Для подсчета клеток
Opti-MEM восстановленные сывороточные среды	Gibco	31985-070	Для смеси миРНК
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies	56532	Реактив Transfect
Тризол	реактив Invitrogen/Life Technologies	15596-026	Для экстракции мРНК
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	170-8891	Для кДНК
поколение iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5125	Для анализа в реальном времени qPCR
7500 Fast Real Time PCR система	Biosystems		Real time qPCR mechine
10-см тарелка	Greiner bio-one	664160	Для эксперимента Knockdown
24-луночный планшет	Cellstar	662160	Для анализа заживления ран
siControl siRNA	Self разработан	Самостоятельно разработанный	CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNA	Самостоятельно	разработанный Самостоятельно разработанный	UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Наблюдатель за живыми клетками	Zeiss		Инвертированный наблюдатель за клетками для экспериментов с живыми клетками