Данио рерио является популярной модели животных для изучения механизмов сетчатки дегенерации/регенерации в позвоночных. Этот протокол описывает метод побудить локализованных травмы, нарушая наружной сетчатки с минимальным ущербом для внутренней сетчатки. Впоследствии мы осуществляем мониторинг в vivo сетчатки морфология и Мюллер глии ответ всей регенерации сетчатки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Активации клеток глии Мюллер в лазерно индуцированным дегенерации сетчатки и регенерации модель в данио рерио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Увлекательный костистых млекопитающих отличается от непрерывного потенциал костистых сетчатки для сетчатки Нейрогенез и восстановление после серьезного ущерба. Исследование путей регенерации в zebrafish может принести новые идеи для разработки новаторских стратегий для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки в млекопитающих. Здесь мы сосредоточились на индукции фокуса поражения внешних сетчатки в взрослых рыбок данио посредством 532 нм Лазер диода. Локализованные травмы позволяет исследовать биологические процессы, которые происходят во время дегенерации сетчатки и регенерации непосредственно в зоне повреждения. С помощью неинвазивных оптическая когерентная томография (Окт), мы были в состоянии определить местоположение поврежденного монитора и области последующей регенерации в vivo. Действительно OCT изображений производит изображения с высоким разрешением, поперечного сечения данио рерио сетчатки, предоставляя информацию, которая была ранее доступна только с гистологическим анализом. Для подтверждения данных от реального времени октября, были исполнены Гистологические срезы и регенеративной ответ после индукции сетчатки травмы были исследованы иммуногистохимия.
Введение
Видение, вероятно, наиболее важным чувство человека и его обесценения имеет высокие социально экономические последствия. В промышленно развитых странах дегенеративных заболеваний сетчатки составляют большинство потери зрения и слепоты среди взрослого населения1. Пигментный ретинит (RP) является наиболее распространенной причиной унаследованные слепоты у людей в возрасте от 20 до 60, затрагивающих примерно 1,5 миллиона человек во всем мире2,3. Это семейство разнородных наследственных заболеваний сетчатки, характеризуются постепенной утратой фоторецепторов (PRs) следуют дегенерация сетчат....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
все эксперименты присоединилась к заявлению для использования животных в глазной и видение исследований ассоциации исследований зрения и офтальмологии (Арво) и соблюдать соответствующие правила правительственных властей.
1. Животные
- поддерживать TgBAC (gfap:gfap-GFP) данио рерио, 167 (AB) сорт в возрасте 6-9 месяцев в стандартных условиях в воде с температурой 26,5 ° C и свет/темно цикла 14/10 h 18.
- Следовать руководящим принципам ухода за животными участвующих учреждений для экспериментов на животных после утверждения государственными органами.
2. Реверсивные ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Реальном времени OCT: для того чтобы проанализировать роль МКН в сетчатки ремонт, мы использовали модель травмы лазер, вызывая четко разграничить зоны повреждения сетчатки у рыбок данио. На сайте ущерб был образы с помощью OCT в естественных условиях в первый раз (день 0) в течение 60 минут после травмы (рис. 3). Для компенсации оптики глаза рыбы, на заказ контактных линз был помещен на роговице. Сразу же после лазерного лечения дифф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Регенерации/дегенерация сетчатки в zebrafish были расследованы различных подходов, таких как cytotoxin опосредованной клеток смерти22, механическая травма23и термической травмы24. Мы использовали 532 нм Лазер диода повреждения сетчатки у рыбок данио. Таким образом наша модель предлагает несколько преимуществ. Например мы быстро созданы четко определенные области травмы, локализованных в наружной сетчатки, специально в слое PRs. Кроме того эта экспери.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим Martin Zinkernagel, MD, PhD и Мириам Reisenhofer, PhD за ее научного вклада в создание модели и Федерика Bisignani за ее превосходную техническую помощь.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Раствор кислотного гематоксилина | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | 2852 | |
| Альбумин | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | A07030 | |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Дания | S2002 | |
| DAPI монтажный средний Vector | Labs, Берлингейм, Калифорния, США | H-1200 | |
| Эозин G водный раствор 0,5% | Carl Roth, Arlesheim, Швейцария | X883.2 | |
| Этанол | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | 2860 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | 3989 | |
| Козий антикроличий IgG H& L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Цуг, Швейцария | A11008 | |
| Козий антимышиный IgG H& L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Цуг, Швейцария | A11020 | |
| Goat нормальная сыворотка | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Гидрогелевая контактная линза | Johnson & Johnson AG, Цуг, Швейцария | n.a.1-Day Acuvue Moist | |
| Hydroxypropylmethylцеллюлозa 2% | OmniVision, Neuhausen, Швейцария | n.a.Methocel | 2% |
| Этил3-аминобензоат метансульфонат | Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцария | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Германия | n.a.532 нм лазер | |
| Мышь анти-GS моноклональное антитело | Millipore, Billerica, MA, США | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Гейдельберг, Германия | n.a.Spectralis | |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Гейдельберг, Германия | n.a.Version | 1.9.10.0 |
| Параформальдегид (PFA) | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | P5368 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Кролик анти-GFAP поликлональное антитело | Invitrogen, Waltham, MA, США | 180063 | |
| Держатель силиконовой булавки | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Вырезано вручную из силиконового коврика стерилизационного лотка соответственно. |
| Щелевая лампа BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Швейцария | n.a.Адаптер | |
| для щелевой лампы | Iridex Corp., Mountain View, CA, США | n.a.Superfrost | |
| Plus glass lides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Германия | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) штамм | KIT, Karlsruhe, Германия | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Трис буферизированный физиологический раствор (TBS) | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | P1379 | |
| 78D объектив бесконтактная щелевая лампа | Volk Optical, Mentor, OH, США | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария | 534056 | |
| лазерная линза глазного дна | Ocular Instruments, Bellevue, WA, США | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Саутгемптон, Великобритания | R2100-EU | Отпариватель |
Ссылки
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retin....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
