Простой и эффективный микроинъекции протокол для гена редактирования в Канальный сомик эмбрионов, с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 представлен. В этом протоколе, руководство РНК и белка Cas9 были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Этот протокол был утвержден путем стучать вне двух Канальный сомик иммунной связанных генов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Полный геном канального сома, сомик punctatus, была последовательной, приводит к более широкие возможности для изучения функции гена канального сома. Нокаут гена был использован для изучения функции этих генов в естественных условиях. Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система представляет собой мощный инструмент, используемый для редактирования геномных последовательностей ДНК изменить функции гена. В то время как традиционный подход был ввести ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мРНК в одну ячейку эмбрионов путем микроинъекции, это может быть медленным и неэффективным процессом в Сома. Здесь описан подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов с ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка. Вкратце яйца и спермы были собраны и затем искусственное оплодотворение выполняется. Оплодотворенные яйца были переведены в чашку Петри, содержащие Holtfreter в раствор. Объем впрыска был откалиброван и затем руководство РНК/Cas9 ориентация которую платных/интерлейкина 1 рецептора домена содержащих адаптер молекулы (TICAM 1) гена и рамноза привязки Лектин (RBL) гена были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Нокаут гена был успешным, как indels были подтверждены секвенирования ДНК. Изменения последовательности предсказал белка из-за эти мутации включены фреймшифт и усечение белка из-за преждевременной остановки кодонов.
Введение
Микроинъекции является общей лаборатории метод, используемый для доставки небольшое количество вещества, такие как ДНК, РНК, белков и других макромолекул в клетки или эмбрионов через капиллярные стеклянные1. Микроинъекции осуществляется с помощью установки специального оборудования, включая microinjector, микроманипулятор и Микроскоп2. Этот метод был использован исследователями генетически изменить многих организмов через поколение мутация гена нокауты и генной терапии, с целью понимания динамики внутриклеточных компонентов3,4 , 5
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот эксперимент был проведен на рыбу генетики исследовательское подразделение, E. W. оболочки рыболовству научно-исследовательский центр, Университет Оберн, Алабама. Все экспериментальные протоколы, используемые в этом эксперименте были утверждены Auburn университета институциональных животное уход и использование Комитетом (AU-IACUC), прежде чем был начат эксперимент. Список оборудования и предметов снабжения, используемых в этом эксперименте можно найти в таблице материалы. Ниже приведены шаги и процедуры для подготовки и микроинъекции канального сома один клеток эмбрионов, как показано на рисунке 1.
1. размыш....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы продемонстрировать эффективность микроинъекции протокола, были microinjected оформления, предназначенных для целевой канал Сома платных/интерлейкина 1 домена содержащих адаптер молекулы (TICAM1) ген рецептора и рамноза привязки Лектин (RBL) ген.
TICAM 1
Секвенирование ДНК векторов из отдельных колоний от пула, клонированные продукты PCR показали indel мутации, индуцированной в TICAM 1 гена. Мутации сост.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Был представлен подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов для достижения Нокаут гена. Инъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в желток намного проще, экономит время и не требует обучения по сравнению с microinjecting blastodisc один клеток эмбриона, который является самым распространенным способом для большинства перенос генов и Джин редактирования с рыбой 30 , 42. текущий протокол оказался успешным в привлечении indels в канального сома TICAM 1 и RBL.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование финансировалось USDA-НИФА награду 2015-67015-23488 Роджер конуса. Авторы благодарят Доктор Рональд Phelps для описания критериев выводок фондовый отбора в видео. Ахмед Elaswad и Карима Халиля хотел бы поблагодарить египетские культурные и образовательные бюро в Вашингтон Округ Колумбия, для финансирования их кандидат исследований.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Репробуст имплантат | Центр морской биотехнологии | Аналог лютеинизирующего гормона рилизинг-гормона (LHRHa) для индукции овуляции у самок канального сома | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | Для седации маточного стада рыб во время инъекций гормонов и снятия яиц. | |
| Фенол красный | Sigma-Aldrich | P0290 | 0,5%, стерильный фильтрованный |
| Стереомикроскоп | Olympus | 213709 | Для визуализации яйцеклеток во время микроинъекции |
| Микроинъектор | ASI-Прикладное научное приборостроение | Модель МППИ-3 | Для доставки инъекционного материала в эмбрионы |
| с помощью микроманипулятора | АСИ-Прикладное научное приборостроение | Модель MM33 | Для удержания и управления движением инъекционной иглы. |
| Микрозагрузчик Eppendorf | Eppendorf | 5242956.003 | Для загрузки раствора для инъекций в иглы для микроинъекций. |
| Вертикальный иглосъемник | David Kopf Instruments | Model 720 | Для вытягивания микроинъекционных игл |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Рекомбинантный белок Cas9 из Streptococcus pyrogenes. |
| Расширьте возможности системы ПЦР High FidelityPLUS | Roche Diagnostics, США | Для ПЦР и амплификации матриц ДНК для использования в получении гРНК | |
| Капилляры из боросиликатного стекла | Fisher Scientific | 1 мм внешний диаметр (OD), для изготовления игл для микроинъекций. | |
| Чашка Петри | VWR | 25384-302 | Для удержания эмбрионов во время микроинъекции. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Овощной шортенинг для покрытия нерестовых чаш и чашек Петри. | |
| Домашний раствор Holtfreter's | Home Made | 59 мМ NaCl, 0,67 мМ KCl, 2,4 мМ NaHCO3, 0,76 мМ CaCl2, 1,67 мМ MgSO4 для инкубации микроинъекционных эмбрионов до вылупления. | |
| Доксициклина гиклат USP (моногидрат) | Letco Medical | 690904 | антибиотик, добавленный в раствор Holtfreter's до 10 ppm для предотвращения бактериальных инфекций. |
Ссылки
- Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
- Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
- Du, S. J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
