Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена

14.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56275

⸱

20 января 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Простой и эффективный микроинъекции протокол для гена редактирования в Канальный сомик эмбрионов, с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 представлен. В этом протоколе, руководство РНК и белка Cas9 были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Этот протокол был утвержден путем стучать вне двух Канальный сомик иммунной связанных генов.

Аннотация

Полный геном канального сома, сомик punctatus, была последовательной, приводит к более широкие возможности для изучения функции гена канального сома. Нокаут гена был использован для изучения функции этих генов в естественных условиях. Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система представляет собой мощный инструмент, используемый для редактирования геномных последовательностей ДНК изменить функции гена. В то время как традиционный подход был ввести ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мРНК в одну ячейку эмбрионов путем микроинъекции, это может быть медленным и неэффективным процессом в Сома. Здесь описан подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов с ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка. Вкратце яйца и спермы были собраны и затем искусственное оплодотворение выполняется. Оплодотворенные яйца были переведены в чашку Петри, содержащие Holtfreter в раствор. Объем впрыска был откалиброван и затем руководство РНК/Cas9 ориентация которую платных/интерлейкина 1 рецептора домена содержащих адаптер молекулы (TICAM 1) гена и рамноза привязки Лектин (RBL) гена были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Нокаут гена был успешным, как indels были подтверждены секвенирования ДНК. Изменения последовательности предсказал белка из-за эти мутации включены фреймшифт и усечение белка из-за преждевременной остановки кодонов.

Введение

Микроинъекции является общей лаборатории метод, используемый для доставки небольшое количество вещества, такие как ДНК, РНК, белков и других макромолекул в клетки или эмбрионов через капиллярные стеклянные1. Микроинъекции осуществляется с помощью установки специального оборудования, включая microinjector, микроманипулятор и Микроскоп2. Этот метод был использован исследователями генетически изменить многих организмов через поколение мутация гена нокауты и генной терапии, с целью понимания динамики внутриклеточных компонентов3,4 , 5.

Канальный сомик (сомик punctatus) является наиболее популярных видов сома в аквакультуре и любительского рыболовства в Соединенных Штатах. Существует возрастает необходимость изучения функциональной геномики в канального сома, и секвенирования генома полный канал Сома повышает полезность последних достижений в геноме редактирования инструменты6,7. Понимание функции гена не только обогатит исследований, которые проводятся на сома, но также может привести к более эффективные программы улучшения генетических качеств для расширения индустрии сом. После выявления критических генов для данного признака интерес, они могут использоваться для генетически улучшения производства сом посредством изменения генома для создания полезных аллелей, выбор для этих аллелей, пресечению пагубных аллелей, передача благотворное аллели через трансгенез, или некоторая комбинация этих вариантов. Объединяя лучшие гены для различных коммерчески выгодные черты из различных видов в одной рыбы позволит значительно повысить производительность и рентабельность операций производства рыбы8.

Нокаут гена является прямой метод для изучения функций генов в естественных условиях. Мутации на уровне ДНК будет наследоваться будущих поколений, которые будут способствовать изучению их последствий в разных поколений. Инструменты редактирования разных генома были развитые включая цинковый палец nucleases (ZFNs), транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ) системы9,10,,1112.

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система является мощный и эффективный инструмент, используемый для редактирования геномных последовательностей ДНК, включая Нокаут гена в рыбы через РНК руководствуясь участкам ДНК расщепления5,13. Система состоит из руководство РНК (gRNA), который определяет целевой последовательности генома и ДНК эндонуклеазы фермента, Cas9. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система может быть сконструирована для любой последовательности генома с рядом преимуществ перед ZFNs и Таленс: (1) ниже стоимости (2) легче инженерных (3) более конкретной привязки руководство РНК последовательности целевых объектов и снижение пробить мутации (4) несколько последовательностей могут быть направлены с различными gRNA такими же темпами время (5) высокая мутагенеза в генах, которые могут не быть мутировал Таленс и (6) скорость передачи улучшение герминальных мутаций для до шестикратно по сравнению с ZFNs и Таленс14, 15,16,17,18.

Основные альтернативный метод для микроинъекции – электропорация, в котором применяются электрические импульсы эмбрионов или ячейки для увеличения проницаемости мембран и освоения биологических молекул19,20. Несколько трансгенных рыбы были созданы с помощью электропорации оризии (Oryzias latipes), данио рерио (Danio рерио), чавычи (Oncorhynchus tshawytscha), канального сома, морской лещ (Sparus Сарбой), и Общие Карп (Cyprinus Карпио)21,,2223,24,25,26.

Электропорация был использован для доставки плазмида ДНК, РНК и Cas9 белка для Нокаут гена. В mammalian клетках, Cas9/gRNA плазмидной ДНК, Cas9 мРНК/gRNA и Cas9 белка/gRNA комплексы были доставлены с помощью электропорации и мутагенез ставки были высокими, используя Cas9 белка/gRNA комплексы для большинства условий испытания электропорации27. В асцидии Хордовые (Ciona интестиналис) electroporated в оплодотворенных яиц побудить нокаут нескольких генов28. выражая конструкции Таленс ZFNs, выражая плазмидные конструкции были electroporated выбить лютеинизирующего гормона в Канальный сомик29. Однако, после того, как введены в ячейку, плазмидные конструкции нужно будет быть транскрибируется в РНК и переведено на функциональных белков, прежде чем они могут быть нацелены нужный последовательности ДНК, который вероятно задержит время мутагенеза, по сравнению с микроинъекции РНК / белка. Как развивается эмбрион, задержка мутагенеза увеличивает мозаичностью вводят учредителей. Кроме того трансгенных выражение маловероятно для достижения уровня выражения с микроинъекции, снижение эффективности мутагенеза.

Как средства для внедрения инструментов редактирования генома в клетки микроинъекции имеет ряд преимуществ над электропорации. Геном редактирования молекул можно надежно вводят в клетки или эмбрионов путем микроинъекции30. Требуется меньше материала инъекций. Это легко определить количество материала вводили. Выше мутации, ставки с низкой мозаичностью основатель рыб может быть достигнуто, который позволит улучшить передачу герминальных мутаций F1. Меньше основатель рыбы должны быть проанализированы для производства первого поколения, благодаря более высокой скорости мутации. В электропорация больше основатель рыбы должны быть проанализированы которые увеличат расходы. Однако выживаемости эмбрионов канального сома microinjected меньше чем electroporated, хотя это может быть преодолено путем инъекций больше эмбрионов31,32. Канальный сомик, выживаемости эмбрионов желток microinjected, варьировались от 16 до 55%, в зависимости от гены мишенью и дозировка gRNA/Cas9 белок32.

Регулярное микроинъекции Сома эмбрионов является технически сложным и много времени, однако, быстрое и эффективное ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка микроинъекции протокол представляется для канального сома эмбрионов. Этот протокол требует меньше времени и опыта, поскольку вводят раствор белка ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в желток одного клеток эмбрионов. Сотни оплодотворенных яиц может быть введен в 1 h (примерно время, необходимое для первого деления клеток происходят). Чтобы проверить протокол, два заболевания связанные с восприимчивость гены были выбиты в канального сома, платных/интерлейкина 1 домена содержащих адаптер молекулы (TICAM1) ген рецептора и рамноза привязки Лектин (RBL) ген. TICAM 1 участвует в сигнальный путь, начатый Толл подобный рецептор (TLR) 3. В канального сома TICAM 1 была резко upregulated после бактериальной вызов с Edwardsiella ictaluri, в то время как он был downregulated в blue сома, видов, устойчивых к э. ictaluri33. RBL играет важную роль в ранней инфекции с флавобактерии Колончатая, возбудителя болезни columnaris, где острые и надежные upregulation был записан в columnaris чувствительными канального сома штамма, по сравнению с 34columnaris резистентными штаммами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот эксперимент был проведен на рыбу генетики исследовательское подразделение, E. W. оболочки рыболовству научно-исследовательский центр, Университет Оберн, Алабама. Все экспериментальные протоколы, используемые в этом эксперименте были утверждены Auburn университета институциональных животное уход и использование Комитетом (AU-IACUC), прежде чем был начат эксперимент. Список оборудования и предметов снабжения, используемых в этом эксперименте можно найти в таблице материалы. Ниже приведены шаги и процедуры для подготовки и микроинъекции канального сома один клеток эмбрионов, как показано на рисунке 1.

1. размышлять выбор акций и нереста

  1. Выбор здорового канального сома выводок фондовой штамм или генетические линии интерес. Канальный сомик мужчины и женщины должны обладать хорошей вторичные половые характеристики.
  2. Выберите мужчины, которые имеют широкий мышечной голову, что шире, чем на остальной части их тела с развитой половых сосочка. Темный цвет, рубцов и раны от территориальной боевых действий являются также признаки сексуального готовности. Выберите самок, которые руководители, которые короче, чем на остальной части их тела и имеют мягкие, ощутима, хорошо округлены живота. Для точности и во избежание подчеркивая рыбы во время первоначальной обработки прекратить кормление самки, 2-3 дня до рассмотрения их готовности для нереста.
  3. Выполните рыбы, обработки быстро, но осторожно. Чтобы уменьшить стресс обработки, выполните все процедуры, которые требуют обработки самок удерживая рыбу в нереста сумки (32 мм размер сетки).
  4. Незадолго до инъекции гормона для стимулирования овуляции Измерьте вес тела самок.
  5. Повесьте нереста мешки с самками внутри потока через резервуар с непрерывной воды и надлежащей аэрации.
  6. Асептически Загрузите имплантатор, имеющий 14 G игла с 85 мкг/кг лютеинизирующего гормона, выпускает гормон-аналоговый имплантат (LHRHa). Промойте стерильным физиологическим раствором 0,9% до инъекции инъекции (спинной мускулатуры). Вставьте имплантатор под углом 45° и отпустите имплантата. Снять иглу и проведите укола ватным тампоном ранее пропитанной 70% этиловом спирте.
  7. Место нереста мешок в бачок так что рыба полностью погружен в воду 15-20 см ниже поверхности воды. Хорошее качество воды и надлежащей аэрации (выше 5 ppm растворенного кислорода) имеют важное значение для овуляции высокого качества яиц.
  8. Предсказать время овуляции, основанные на температуры воды, используя отношения степень час (h)35. Время отклика степени h = время между инъекции гормона и овуляции (h) * температура (° C) воды. Например время отклика степень h 900-1000, самка ожидается икру в 36-40 h от времени инъекции гормона при 25 ° C. Обычно первая проверка для яиц делается 36 ч после инъекции гормона, а затем интервалом 4 ч.
  9. Чтобы проверить наличие овуляции, осторожно поднимите нереста мешка над поверхностью воды в то время как вы ищете яйца, которые прикреплены внутри нереста мешка. Видя по крайней мере 10 яиц указывает, что это женщины овуляция и готова для ручной зачистки.

2. Подготовка сперматозоидов

Примечание: Сперматозоиды могут быть подготовлены несколько h перед ожидаемым овуляции.

  1. Усыпить мужчины ударных удар в голову без анестезии, так как анестезия может иметь негативное влияние на подвижность сперматозоидов.
  2. Собирать яички в маленькой кастрюле взвешивания, удалить любой ткани и мыть их в 50-мл 0,9% физиологического раствора для удаления крови, при необходимости. Развитая яичек, белые с много villiform прогнозы ( рис. 2).
  3. Определите вес семенников.
  4. Подготовить раствор спермы для оплодотворения яйцеклетки, передачи яичек в центр 100 см2 100 мкм сетки с помощью щипцов. Сложите сетки с яичек внутри, раздавить семенников и фильтровать спермы в трубку коллекция 50 мл. Это может быть сделано, применяя давление на яички внутри сетки против ОПРАВЫ коллекции трубки через большой палец. Используйте физиологический раствор 0,9% для стирки спермы из сетки в коллекции трубку. Солевой раствор могут быть добавлены до 10 мл/г яичек.
  5. Определения концентрации сперматозоидов, проверить подвижности и жизнеспособности.
    Примечание: Концентрация может быть определен путем подсчета сперматозоиды, в томе известных разреженных молоки, используя Горяева. Кроме того плотность сперматозоидов может быть оценена путем оценки оптической плотности молоки, используя спектрофотометр. В этом методе поглощение на длине волны 505 нм сравнивается с управления диаграммы, который был ранее подготовлен для поглощения различной концентрации сперматозоидов36. Сперматозоидов может быть проверена под микроскопом как время с момента активации спермы до прекращения спермы движения (продолжительность моторики)37. Жизнеспособность спермы может определяться путем пятнать спермы с выборочной красителей, например Трипановый синий, который будет пятно только жизнеспособные сперматозоиды, в то время как жизнеспособной спермы будет оставаться незапятнанной. Однако для выполнения этих процедур микроинъекции, это не необходимо, если яички хорошо развиты.
  6. Хранить сперму в 0,9% физиологического раствора с шагом 2,5 на 4 ° C и использовать в течение 24 ч после приготовления.

3. яичные сбора и оплодотворение

  1. Применение очень тонким слоем растительного масла до 20 см в диаметре, чистой, сухой, нереста Пан.
  2. Место женщины в анестезирующий раствор, содержащий 100 ppm буферизованное tricaine метан сульфонат с бикарбонатом натрия (рН окончательного решения должна быть 7.0) до тех пор, пока рыба является полностью наркотизированных38.
    Предупреждение: Tricaine метан сульфонат может раздражать при вдыхании, попадает или всасывается через кожу.
  3. Тщательно удалите рыбу из нереста Сумки и окунуть его в 0,9% физиологического раствора смыть анестезирующий раствор. Высушите рыба полностью с помощью чистое полотенце, избегая удаления слой слизи на поверхности тела рыбы.
  4. Обратиться в районе вокруг вентиляционных систем, включая брюшные плавники, чтобы предотвратить вложения яйца во время ручной зачистки растительного масла.
  5. Рука полосы яйца в смазанную сковороду нереста, применяя мягкое давление яичников. Хороший яйца необходимо свободно, золотисто-желтый цвет и имеют минимальный или нет сгустки или сгустки крови (рис. 2). Избегайте контакта между яйца и воды до оплодотворения, как вода может стимулировать микропиле закрытия.
  6. Чтобы оплодотворить яйца для микроинъекции, передачи 200 – 300 яиц на смазанный маслом противень нереста. Смазанный пластик завод метки могут использоваться как ложку для передачи яйца в смазанную сковороду нереста. Добавить 1-2 мл раствора спермы (с шагом 2.5) на яйца и осторожно перемешать. Соотношение спермы, чтобы яйцо должно быть примерно 11 000 спермы/яйцо.
  7. Добавьте пресной воды на яйца, чтобы активировать спермы и яйца. Добавьте достаточно воды, чтобы слегка покрыть яйца. Аккуратно водоворот яйца для 30 s. оплодотворение должно происходить в 1 – 2 мин. Важно оплодотворить яйца, которые расположены в один слой. Сом яйца придерживаться друг на друга, что затрудняет microinject несколько слоев эмбрионов.
  8. Добавить больше пресной воды на оплодотворенные яйца и разрешить яйца, чтобы затвердеть в течение 10-15 мин.
  9. Накройте нереста, содержащий оставшиеся неоплодотворенные яйца, влажное полотенце для предотвращения высыхания и удобрения в течение нескольких часов. Оплодотворение может быть сделано в шахматном порядке, например, одна партия 200 – 300 яиц может быть оплодотворена каждые 30-60 мин для обеспечения непрерывной поставки эмбрионы на стадии одной ячейки для микроинъекции и управления не вводили эмбрионов. Избегайте контакта между влажным полотенцем и яйца, как яйца могут придерживаться мокрое полотенце, что делает его трудно удалить их. В этом протоколе были эффективно microinjected яиц, оплодотворенных в течение 2-3 ч после зачистки и удобряла подобный успех как яйца сразу после зачистки.

4. игла потянув и загрузка

  1. Тяните 1,0 мм OD боросиликатного стекла капилляра 2 иглы (рис. 3). Храните иглы в бумажной коробке с кусок губки, в котором были сделаны несколько разрезов. Чтобы избежать нарушения иглы, диаметр губка должна быть меньше чем длина ствола иглы.
  2. Откройте кончик иглы, преодолев небольшой кусок иглы тонкий региона с помощью объекта острый. Кроме того откройте иглу, щипать от регионе тонкий кончик с щипцами под микроскопом.
  3. Подготовка инъекционного раствора путем смешивания gRNA(s) с Cas9 белками. Другие типы РНК и белков могут также вводиться с той же процедурой. В этом протоколе оформления были разработаны цели двух Канальный сомик иммунной связанных генов, платных/интерлейкина 1 рецептора домена содержащих адаптер молекулы (TICAM1) ген и рамноза привязки Лектин (RBL) гена и подготовлен согласно Шах и др. с использованием высокоточных полимеразы Taq32,39. Genomic цели для оформления были 5' GGA GGT ГАА ГЦА CGT CGA GGA 3' TICAM 1 гена (Рисунок 4) и 5' GGA CTT TGA GTC GGA ГАА GTG G 3' 1 экзона гена руб с protospacer рядом мотив (PAM) последовательности подчеркнул (рис. 6).
    1. ВЗРЫВ руководство РНК цели против канального сома геном последовательность и выбрать тех, кто не потенциальных мест пробить.
    2. Добавьте фенола красного цвета, gRNA/Cas9 белок смешать до одной трети от общего объема.
    3. Отрегулируйте конечная концентрация белка gRNA/Cas9 смеси с нуклеиназы свободной воды так, чтобы каждый эмбрион вводится с 50 nL, содержащие примерно 2,5 нг gRNA и 7,5 нг Cas9 белка. Инкубируйте смесь для 10 мин на льду перед использованием.
  4. С microloader Загрузите 5 – 10 мкл gRNA/Cas9 смеси в иглу, вставив microloader в стволе иглы и высылки смесь медленно при отзыве кончик microloader (рис. 3). Избегайте захвата воздушных пузырьков внутри.
  5. Придавать микропипеткой держателя иглы и обеспечения плотного соединения и затем прикрепите держатель к микроманипулятор. Обеспечить свободный стабильные движения. Приложите давление для микроинъекции, открыв азота цилиндра и регулировка регулятора давления.
    Примечание: Объем инъекции могут быть затронуты давление, диаметр отверстия иглой и продолжительность впрыска. Чтобы определить объем придать, внедрить в каплю минерального масла на Горяева. При необходимости, чтобы увеличить или уменьшить объем впрыска может регулироваться давление, продолжительность впрыска и диаметра иглы. Внедрить несколько раз в минеральное масло для обеспечения последовательного тома.

5. микроинъекции Сома эмбрионов

  1. Применение очень тонким слоем растительного масла в чистый Петри 100 мм.
  2. С помощью метки смазанную пластиковых завод, передача 50 – 100 яиц от оплодотворения Пан на Петри блюдо и покрыть их с Holtfreter в раствор (таблица материалов). Совместите яйца друг против друга в одном слое. Это выравнивание следует держать яйца в месте во время процесса микроинъекции.
  3. Место Петри с яйцами на сцене микроскопа и придерживайте его одной рукой. Опустите иглу с другой стороны (рис. 3), до тех пор, пока она пронзает хориона и желток в одном плавное движение. Кончик иглы должно быть как можно ближе к blastodisc перед доставкой материала инъекций.
    1. Отпустите педаль, чтобы доставить инъекционного материала в желтке. Если blastodisc не является отчетливо видимым, инъекции материал может распространяться в различных местах в желтке. Чтобы сделать это, игла вводится в дальний конец желток, а затем нажатия педали и снятия иглы выполняются одновременно для распространения инъекционного материала через различные области желток. До 50 нанолитров могут быть введены в желтке канального сома эмбрионов, однако, количество белка gRNA/Cas9 необходимо быть оптимизированы для каждого гена для достижения наилучших результатов для мутации курс и эмбриона выживания32.
  4. Плавно убрать иглы чтобы не повредить яйца. Переместите Петри придать еще яйцо с той же процедурой. Избегайте движения Петри блюдо во время процесса впрыска, как это может повредить яйцо или сломать иглу. Удалите яйца, которые являются разрыв или повреждены в результате микроинъекции. Инъекции может быть запущен в 15 – 20 мин после оплодотворения и продолжаться до тех пор, как эмбрионы находятся еще на стадии одной ячейки (до около 60-90 мин после оплодотворения).
  5. Место эмбрионы вводят обратно в Holtfreter и решение с 10 ppm доксициклин и непрерывной нежный аэрации для 6-7 дней до вылупления40. Изменить решение ежедневно и удаление мертвых зародышей.

6. мутация обнаружение

  1. Случайно собирать несколько эмбрионы вводят на 72 h пост оплодотворение, удалить желток и извлечь геномной ДНК. Включать эмбрионы не вводят 3-5 как элемент управления.
    Примечание: Геномной ДНК могут быть извлечены из эмбрионов после удаления яичную скорлупу и желток материала с использованием протеиназы K пищеварение и этанола осадков32.
  2. Усилить фланкируя genomic цели для gRNA каждого гена, где ожидается, что мутации происходят, с использованием высокоточных полимеразы Taq32сегмент ДНК. Для TICAM 1, праймеры 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (вперед) и 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (реверс) были использованы для усиления 750 bp для RBL, праймеры 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (вперед) и 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (реверс) были использованы для усилить 375 bp сегмент от гена руб.
    1. Используйте следующие реакции PCR: до 20 мкл ПЦР класс воды; 1 x высокой четкости буфер реакции Энзим Taq с MgCl2, dNTP 0,2 мм смесь, 0,4 мкм, для каждого из прямого и обратного грунтовка тот же набор, 100-300 нг геномной ДНК и 1,25 единиц смеси энзим Taq высокой верности. Выполнять условия PCR Велоспорт: первоначальный денатурации на 94 ° C 3 мин; 35 циклов денатурации на 94 ° C за 30 сек, отжиг при 60 ° C для 55 s для TICAM и 40 s для RBL, расширение на 72 ° C в течение 1 мин/КБ; и окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин.
  3. Обнаружить мутант эмбрионов, с помощью метода обнаружения мутации как последовательности очищенных продуктов ПЦР, обнаружения пробирного инспектора мутации, гетеродуплексного мобильности пробирного, потеря энзима ограничения распознавания сайта, или любой другой метод обнаружения мутаций подходит для целевого объекта. В этом протоколе обнаружить мутант эмбрионов, с помощью обнаружения пробирного инспектора мутации для TICAM 1 и потеря энзима ограничения SapI вырезать сайта, а также последовательности очищенных продуктов ПЦР для гена руб.
  4. Чтобы определить мутантные аллели, клонировать продуктов ПЦР и последовательности векторы из отдельных колоний. Мутантные аллели, представлены на рис. 4 и Рисунок 6 пришли из введенного эмбрионов. Продукты PCR от шести microinjected и 3 управления эмбрионов для каждого гена были объединены в два отдельных труб, один для microinjected эмбрионов и другой для управления эмбрионов, быстро клонировать и 86 векторов для TICAM 1 и 48 векторов RBL гена виртуализации, включая 8 последовательность реакций от 3 управления не вводили эмбрионов для каждого гена.
  5. Для выявления различных мутантные аллели, сравнения последовательностей от мутантов зародыши дикого типа последовательности с помощью любого инструмента Выравнивание последовательности ДНК, например, взрыв или T-COFFEE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы продемонстрировать эффективность микроинъекции протокола, были microinjected оформления, предназначенных для целевой канал Сома платных/интерлейкина 1 домена содержащих адаптер молекулы (TICAM1) ген рецептора и рамноза привязки Лектин (RBL) ген.

TICAM 1
Секвенирование ДНК векторов из отдельных колоний от пула, клонированные продукты PCR показали indel мутации, индуцированной в TICAM 1 гена. Мутации сост...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Был представлен подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов для достижения Нокаут гена. Инъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в желток намного проще, экономит время и не требует обучения по сравнению с microinjecting blastodisc один клеток эмбриона, который является самым распространенным способом для большинства перенос генов и Джин редактирования с рыбой 30 , 42. текущий протокол оказался успешным в привлечении indels в канального сома TICAM 1 и RBL...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось USDA-НИФА награду 2015-67015-23488 Роджер конуса. Авторы благодарят Доктор Рональд Phelps для описания критериев выводок фондовый отбора в видео. Ахмед Elaswad и Карима Халиля хотел бы поблагодарить египетские культурные и образовательные бюро в Вашингтон Округ Колумбия, для финансирования их кандидат исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Репробуст имплантатЦентр морской биотехнологииАналог лютеинизирующего гормона рилизинг-гормона (LHRHa) для индукции овуляции у самок канального сома
TRICAINE-SWestern Chemical. Inc.Для седации маточного стада рыб во время инъекций гормонов и снятия яиц.
Фенол красныйSigma-AldrichP02900,5%, стерильный фильтрованный
СтереомикроскопOlympus213709Для визуализации яйцеклеток во время микроинъекции
МикроинъекторASI-Прикладное научное приборостроение Модель МППИ-3Для доставки инъекционного материала в эмбрионы
с помощью микроманипулятораАСИ-Прикладное научное приборостроение Модель MM33 Для удержания и управления движением инъекционной иглы.
Микрозагрузчик EppendorfEppendorf5242956.003Для загрузки раствора для инъекций в иглы для микроинъекций.
Вертикальный иглосъемникDavid Kopf InstrumentsModel 720Для вытягивания микроинъекционных игл
Cas9 proteinPNA Bio Inc.CP01Рекомбинантный белок Cas9 из Streptococcus pyrogenes.
Расширьте возможности системы ПЦР High FidelityPLUS  Roche Diagnostics, СШАДля ПЦР и амплификации матриц ДНК для использования в получении гРНК
Капилляры из боросиликатного стеклаFisher Scientific1 мм внешний диаметр (OD), для изготовления игл для микроинъекций.
Чашка ПетриVWR25384-302Для удержания эмбрионов во время микроинъекции.
CriscoThe J.M. Smucker CompanyОвощной шортенинг для покрытия нерестовых чаш и чашек Петри.
Домашний раствор Holtfreter'sHome Made59 мМ NaCl, 0,67 мМ KCl, 2,4 мМ NaHCO3, 0,76 мМ CaCl2, 1,67 мМ MgSO4 для инкубации микроинъекционных эмбрионов до вылупления.
Доксициклина гиклат USP (моногидрат)Letco Medical690904антибиотик, добавленный в раствор Holtfreter's до 10 ppm для предотвращения бактериальных инфекций.

Ссылки

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191(2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841(1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055(2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622(2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TICAM1RBL
Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.