Методическая статья

Строительство и оценке модели мышиных подвздошную остеолиза под воздействием CoCrMo частиц в асептических рыхления

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56276

⸱

17 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эта рукопись описывает модель мышиных подвздошную остеолиза под воздействием CoCrMo частицы, которая является идеальной животной модели для оценки взаимодействия частиц износа и различные клетки в асептических рыхления.

Аннотация

Износ частиц индуцированной остеолиза является основной причиной асептического рыхления артропластика провалом, но основной механизм остается неясным. Из-за давно прослеживаний необходимую для обнаружения и спорадических случаев это сложно оценить ofparticle индуцированной остеолиза патогенеза в клинических случаях. Таким образом оптимальная Животные модели необходимы для дальнейших исследований. Мышиных модель черепа остеолиза, создана под воздействием частиц CoCrMo является эффективным и действительным инструментом для оценки взаимодействия между частицами и различные клетки в асептических рыхления. В этой модели CoCrMo частицы были впервые получены высокого вакуума тремя электродами постоянного тока и высокомобильна в фосфат амортизированное saline в концентрации 50 мг/мл. Затем 50 мкл в результате приостановления был применен к середине мышиных Кальвария после разделения черепной надкостницы, острый рассечение. После двух недель мышей были принесены в жертву, и Кальвария образцы были собраны; качественные и количественные оценки были исполнены гематоксилином и эозином и Микро Компьютерная томография. Преимущества этой модели включают в себя простоту процедуры, количественная оценка потери костной массы, быстрота развития остеолиза, потенциального использования трансгенных или нокаут моделей, и относительно низкой стоимости. Однако эта модель не может использоваться для оценки механических сил и хронические эффекты частиц в асептических рыхления. Мышиных подвздошную остеолиза модель, созданная под воздействием частиц CoCrMo является идеальным инструментом для оценки взаимодействия между износ частиц и различные клетки, например, макрофаги, фибробласты, остеобластов и остеокласты, в асептических рыхления.

Введение

Разрыхление асептическое является наиболее распространенной причиной всего тазобедренного сустава (THA) и всего коленного сустава (ТКА) провал, который требует пересмотра хирургии1. Однако основной механизм остается неясным2. Длинные последующей деятельности требуется для обнаружения частиц индуцированной остеолиза, чье появление редко; Таким образом это сложно для изучения патогенеза в клинических случаях. Таким образом дальнейшие исследования, посвященные сложные механизмы клеточной и тканевой требуют как в естественных условиях экспериментов в носить модели частиц индуцированной остеолиза и в пробирке анализов в клетках, относящиеся к кости гомеостаза3. Действительный животных модель имеет важное значение в раскрытии эффекты частиц износа на потери костной массы, предоставления доказательств для дальнейшего сотовой анализов.

Мышиных подвздошную остеолиза модель построена под воздействием частиц CoCrMo это эффективный и действительный метод для оценки взаимодействия между частицами и различные клетки в асептических рыхления. В этой модели CoCrMo частицы вызывают подвздошную остеолиза, вызывая воспалительные cytokines в макрофагах, активация остеокластов, остеобластов распространения и поощрения остеобластов апоптоз.

Это займет всего две недели для создания этой модели. Остеолиза могут быть визуализированы и количественно гематоксилином и эозином (H & E) и Микро Компьютерная томография (микро CT)2. Кроме того эта модель имеет сравнительно низкой стоимости и трансгенных и нокаут мыши, что модели могут использоваться для экран большое количество соединений в различных дозах3.

Процедура создания и оценивать эту модель очень проста. Во-первых CoCrMo частицы были получены высокого вакуума тремя электродами постоянного тока и высокомобильна в фосфат амортизированное saline (PBS) в концентрации 50 мг/мл. Затем 50 мкл в результате приостановления был применен к середине мышиных Кальвария после разделения черепной надкостницы, острый рассечение. Мышей были принесены в жертву после двух недель, и Кальвария образцы были собраны; качественный и количественный анализы на H & E пятнать andmicro-CT.

Мышиных подвздошную остеолиза модель построена под воздействием частиц CoCrMo является идеальным инструментом для оценки взаимодействия между CoCrMo частиц и различные клетки, макрофаги, фибробласты, остеобластов и остеокласты, в асептических ослабление.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Нанкин.

1. CoCrMo частиц подготовка

  1. Получите CoCrMo частицы, используя сфабрикованные высокого вакуума тремя электродами постоянного тока4. Место CoCrMo сплава в обсуждаемый документ 10-3 ПА вакуум, 0,04 МПа аргона и водорода 3:2 (v/v) и 650 A катод текущей.
  2. Измерьте диаметры CoCrMo частиц.
    1. Добавьте 1 мг CoCrMo частиц в 1,5 мл безводного этилового спирта.
    2. Ресуспензируйте CoCrMo частиц в безводном этаноле ультразвуковой встряхивания на 28 кГц и 600 Вт на 5 мин.
    3. Нанесите одну каплю (около 20 мкл) результирующий подвески на объективную таблицу просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА). Захват серии фотографий ТЕА на 200 кв ускорение напряжения и 0.24 резолюции Нм.
    4. Используйте предоставленное программное обеспечение для расчета среднего диаметра и размер распределение частиц в ТЕА микроскопии.
  3. Обеззараживанию эндотоксины
    1. Автоклав 50 g частиц для 15 мин при температуре 121 ° C и 15 psi.
    2. Обнаружения эндотоксинов, количественного анализа Limulus Lysate амебоцит (Лал) (< 0,25%, чтобы указать отсутствие эндотоксинов считался ЕС/мл)5.
  4. Ресуспензируйте частицы в фосфат амортизированное saline (PBS) в концентрации 50 мг/мл как Стоковый раствор6.

2. Построение модели подвздошную остеолиза

  1. Анестезировать 6 неделя старый C57BL/J6 мышей (шесть мышей на группу) withpentobarbital (50 мг/кг). Используйте Пинч тест для оценки уровня анестезии. Предотвращения высыхания глаз с нормальное saline.
  2. Место мыши в лежачем положении. Удаление мех на череп с бритвы и дезинфекции кожи с помощью медицинских ватные шарики, содержащего 75% этанола.
  3. Для локализации точки определите две точки, включая среднее положение между двумя глазами и ушами, соответственно. Затем определите линии между двумя выше пунктов и надрезать кожу вдоль линии выше с ножницами (рис. 1A).
  4. Удалите головы надкостницы из Кальвария с скальпель (рис. 1B)6.
  5. Шовный материал кожи на обоих концах с простой Прерванный швом.
  6. Сделать линию шва через середины разреза без завязывать. Держите два концы линии швов.
  7. Внедрить 50 мкл CoCrMo частиц суспензии (50 мг/мл, в PBS) в середине глядя (рис. 1 c)2.
  8. Узел последний стежок в простой Прерванный шов (рис. 1 d).
  9. Сохранить мыши еще 2 недели.

3. Оценка модели подвздошную остеолиза микро КТ сканирование

  1. Пожертвуйте мышей с двуокиси углерода. Обезглавить мышей в горизонтальной плоскости. Удаление ткани мозга внутри и кожу и мех снаружи. Урожай глядя для дальнейших экспериментов.
  2. Аккуратно очистите всех мягких тканей на Кальвария с помощью пинцета. Исправьте очищается глядя в параформальдегида 4% при температуре 4 ° C для 24 h. погрузиться глядя в PBS 24 h до микро КТ.
  3. Анализировать глядя мышей с высоким разрешением микро CT в изометрии резолюции 18 мкм и параметры энергии рентгеновского 45 кв и 550 мА.
  4. Проведения трехмерной реконструкции микро КТ данных с программным обеспечением.
  5. Качественный и количественный анализ.
    1. Во-первых выберите квадратный регион вокруг средней линии шва как области интереса.
    2. Во-вторых, измерить минеральной плотности костной ткани (BMD), кость объем/общий объем (BV/TV), Трабекулярная номер (Tb.N), Трабекулярная толщина (Tb.Th), Трабекулярная разделения в интервал (Tb.Sp) и процент общей пористости с помощью предоставленного программного обеспечения для микро CT.
    3. В-третьих Сравните три группы для различных измерений, односторонний дисперсионный анализ. Для post hoc дисперсионный анализ применять метод Бонферрони2.

4. Оценка подвздошную остеолиза модели на H & E пятнать

  1. Известь Кальвария образцов в 15% этилена диамин tetraacetic кислоты (ЭДТА)-PBS при 4 ° C. Измените решение декальцинации каждый день в течение 3 недель.
  2. Внедрить decalcified образцы в парафин для 2 см x 1 см x 1 см куб и нарезать их на 2 мкм секции в области осаждения частиц.
  3. Пятно секции с гематоксилином и эозином как описано7.
  4. Захватить микроскопии общего pathomorphism, световой микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Собственного производства наноразмерных частиц CoCrMo были около 50 Нм (стандартная ошибка 3.56) в диаметре, как количественно ТЕА (рис. 2). После заражения мыши глядя CoCrMo частиц, животных (n = 6 для каждой группы) были сохранены еще две недели. В течение двух недель полностью исцелился подвздошную разрез, и шов может упасть. Любые местные инфекции или исправления может повлиять на оценку потери кости. После мыши жертвы были собраны образцы Кальвария. Зате...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует два основных метода для износа частиц индуцированной остеолиза у мышей: воздух мешочек модель и модель черепа остеолиза. В модели воздуха мешочек сначала устанавливается подкожно сгенерированный воздуха мешочек, следуют введение частиц износа и имплантации в костной ткани8. Мешочек стены имитирует надкостницы в асептических рыхления. Однако костной имплантация nonvascular с не биологической активностью, что делает его трудно оценить прямое взаимодействие между частицами и костной ткани....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Фонд национального естественных наук Китая (81572111), клинические науки и технологии проекта Фонд провинции Цзянсу (BL2012002), проект научных исследований Нанкин (201402007), естественные науки Фонд провинции Цзянсу (BK20161385) и Специальный фонд китайский врач ассоциации (2015COS0810).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сплав CoCrMo из протезаWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIСырье для получения наночастиц CoCrMo
Изготовленный высоковакуумный трехэлектродный постоянный токКолледж материаловедения и материаловедения Инженерия , Нанкинский технологическийСамостоятельная машина
6-недельный самец мышей C57BL/6JМодель животного исследовательского центра Нанкинского университета N000013
100% этанолНанкинский реагентC0691514023растворитель наночастиц CoCrMo для просвечивающего электронного микроскопа сканирование
1,5 мл Микроцентрифужные пробиркиTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW603
Микроаналитические весыШэньчжэнь Цюнь Лонг Контрольно-измерительное оборудование Ко,. LTDEX125DZH
Ультразвуковой шейкерShanghai Yuhao scientific instrument co., LTDYH-200DHДля суспензии наночастиц CoCrMo
Transmission Электронный микроскопFEITecnai G20
SimplePCI программное обеспечениеCompix Inc.6.6 Версия Длярасчета среднего диаметра и распределения частиц по размерам.
Стерилизационная сковорода с высокой рукойQIULONGYQIKYQL-100DSДля обеззараживания эндотоксина
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) АнализCharles RiverR13025Для обнаружения эндотоксина 
15 мл Микроцентрифужные пробиркиTaizhou Suyi MedicalB122
Фосфатно-солевой буферBoster Биологическая технологияAR0030Растворитель наночастиц CoCrMo стоковый раствор
Пентобарбитал НатрийSigmaP3761Для обезболивания мышей
Обычный физиологический растворSACKLERSR8572EP-15Для предотвращения высыхания глаз мышей
75% ЭтанолНанкин РеагентC0691560275Дезинфекция
Медицинский ватный тампонShuitao1278298933Дезинфекция
БритваKemeiKM-3018Для бритья шерсти
НожницыRWD LIFE SCIENCES12005-10Для разреза кожи
ШовRWD LIFE SCIENCEF34001-01Для наложения швов на кожу
ИглодержательRWD LIFE SCIENCEF33001-01Для наложения швов на кожу
ИглаRWD LIFE SCIENCER14003-12Для наложения швов на кожу
Сосуды щипцыRWD LIFE SCIENCEF22003-09Для наложения швов на кожу
СкальпельRWD LIFE SCIENCES31010-01Для сбора кальварии
ПинцетRWD LIFESCIENCE F12006-10Для сбора кальварии
100 & микро; L пипеткиEppendorf3120000240Для встраивания суспензии частиц в кальватии
100&микро; L наконечники для пипетокAXYGENT-200-YДля встраивания суспензии частиц в кальватии
5 мл МикропробиркиTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% параформальдегидServicebioG1101Фиксация
Микрокомпьютерная томография SkyScanSkyScan1176
Этилендиамин тетрауксусная кислотаServicebioG1105Декальцинация
парафинаServicebio#0001
Машина для нарезки парафинаLeicaRM2125RTS
Предметное стеклоServicebioG6004
Защитное стеклоServicebio200
Набор для окрашивания HEServicebio#1-5Микроскоп для окрашивания HE
LightE200
университет Nikon

Ссылки

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи