G2-seq: Высокая пропускная способность на основе последовательности техника для выявления поздно репликации областей генома

Summary

Мы опишем технику для объединения проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности для определения конца репликации областей генома.

Abstract

Были разработаны многочисленные методы следить за ходом репликации ДНК через S-фазе клеточного цикла. Большинство из этих методов были направлены на выяснение местоположения и времени начала генома дублирования, вместо того, чтобы его завершения. Однако важно, что мы понимаем областей генома, которые последний для завершения репликации, потому что эти регионы страдают повышенные уровни хромосомных обрыва и мутации, и они были связаны с болезнью и старения. Здесь мы описываем, как мы расширили технику, которая была использована для мониторинга инициации репликации вместо определить те регионы генома последний для полной репликации. Этот подход основан на комбинации проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности. Хотя настоящий доклад сосредоточен на применение этого метода для дрожжей, этот подход может использоваться с любой клетки, которые могут быть отсортированы в проточный цитометр согласно содержание ДНК.

Introduction

Эукариотический геном репликация инициируется в нескольких дискретных сайтов, называется происхождение репликации, от которых репликации вилки действовать в обоих направлениях (обзор в Fragkos et al., 2015-¹). Истоки различаются в их сроках и эффективности стрельбы, и были разработаны несколько методы для отслеживания репликации происхождения деятельности и выяснения причин этого изменения. Деятельность отдельных происхождение может быть выведено из уровней одноцепочечной ДНК², какие формы вокруг активной происхождение, или с помощью электрофореза геля 2D для мониторинга репликации конкретных промежуточных

Protocol

1. Подготовка клеток для потока цитометрии сортировки

1. Прививать 15 мл пробирки, содержащие 8 мл бульона, YEPD, таким образом, что культуры достичь плотности тарелок 5 x 10-⁶ до 1,5 x 10-⁷ клеток / мл после ночи роста (см. Примечание 1 обсуждения).
2. Спин вниз дрожжевых клеток (1400 x g, при комнатной температуре или 4 ° C) в колпачок пластиковых пробирок 15мл за 5 мин, Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл 70% этанол и передачи 1.6 mL отцентрифугировать трубки, давая это сидеть в течение 1 ч при комнатной температуре или по крайней мере 3 h на льду ( можно бесконечно храниться при температуре 4 ° C) (см. обсуждение пункта (2)).
....

Results

Мы использовали процедуру, описанную выше для определения конца репликации сайтов в многообещающий дрожжей. Опробовать этот подход с использованием известных конце репликации региона на искусственных хромосом доказали технику для точной и надежной. Наши результаты также продемонстрировали биологической важности своевременного завершения репликации, показывая, что поздно тиражирование региона на хромосоме 7, которые мы определили как конце репликации на основе результатов наших G2-seq, был.......

Discussion

Хотя этот метод является надежной и довольно прямо вперед, особое внимание следует обратить на следующее:

(1) мы рекомендуем, что культур расти по крайней мере 12 часов прежде чем они достигнут этапа журнала, поскольку различия проявляются в клеточный цикл распределения, если культур собирают после достижения желаемой плотности просто 4 h после прививки. Мы исходим из того, что клеточного цикла распределения, которая достигла относительно стабильное равновесие лучше представляет распределение .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Набор геномных ДНК YeaStar	Genesee Scientific	11-323
1 &микро; M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	ресуспендировать в 50 мМ цитрат натрия, pH
7,2 50 mM цитрат натрия, pH 7,2
раствор РНКазы (0,25 мг/мл)	Sigma	R6513	0,25 мг/мл РНКазыA ресуспендировать в 50 мМ цитрат натрия, pH 7,2, кипятить раствор РНКазы в течение 10 минут только перед первым использованием, и в дальнейшем хранить при -20°С;
протеиназа К раствор (20 мг/мл)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	ресуспендировать в 10 мМ Трис, рН 7,5, 2 мМ CaCl2, 50% глицерин, хранить при -20°С; C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III колонки	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Флуориметр	ThermoFisher	Q33216
Covaris Модель LE220 Фокусно-ультразвуковой аппарат	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Набор для подготовки образцов	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 Прибор	Illumina	SY– 401– Программное обеспечение для выравнивания 2501
gsnap	с открытым исходным кодом / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap