Методическая статья

Беспроводной, двунаправленный интерфейс для записи в естественных условиях и стимуляции нейронной активности в свободно себя крысы

DOI:

10.3791/56299

⸱

7 ноября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Behavioral Neuroscience, Experimental and Biological Psychology, Philipps-Universität Marburg, 2Behavioral Neurosciences Institute (INeC), 3Thomas RECORDING GmbH, 4Department of Neurophysics, Philipps-Universität Marburg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вводится беспроводной, двунаправленная система для многоканальной записи и нейронных и стимуляции в свободно себя крыс. Система является легкий и компактный, таким образом оказывает минимальное влияние на поведенческие репертуар animal´s. Кроме того это двунаправленная система обеспечивает сложный инструмент для оценки причинно-следственных связей между моделями активации мозга и поведение.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В vivo электрофизиологии – это мощный метод для изучения взаимосвязи между мозговой деятельности и поведения в миллисекунду и микрометр масштабе. Однако текущие методы главным образом полагаться на привязи кабель записей или использовать только однонаправленный системы, позволяя запись или стимуляции нейронной активности, но не в то же время или же цель. Здесь описан новый беспроводной, двунаправленный устройство для одновременной многоканальной записи и стимуляции нейронной активности в свободно себя крыс. Система работает через одноступенчатый портативный головы, которая передает записанные деятельность и могут быть направлены в режиме реального времени для стимуляции мозга с помощью многоканального программного обеспечения на основе телеметрии. Главный этап оборудован предусилитель и аккумуляторная батарея, позволяя стабильной долгосрочной записи или стимуляции для до 1 ч. Главное, главный этап компактный, весит 12 g (включая батарея) и таким образом оказывает минимальное влияние на animal´s поведенческие репертуар, делая метод применимых к широкий набор поведенческих задач. Кроме того этот метод имеет главное преимущество, что эффект стимуляции мозга на нейронной активности и поведение могут быть измерены одновременно, обеспечивая инструмент для оценки причинно-следственных связей между конкретными мозга активации структуры и поведения. Эта особенность делает метод особенно ценными для поля глубокая стимуляция мозга, позволяя точной оценки, мониторинга и корректировки параметров стимуляции во время долгосрочного поведенческих экспериментов. Применимость системы были проверены с использованием нижнего colliculus как модель структуры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фундаментальный вопрос в неврологии, как электрической активности в определенных нейронных цепей создает определенные формы поведения. В vivo электрофизиологии – это мощный метод для решения этого вопроса, обеспечивая инструмент для записи или стимулировать электрической активности в головном мозге, в то время как животные выполняют определенные поведенческие задачи. Однако нынешние системы часто полагаются на привязанный кабель записи1,2, скорее всего ограничивает мобильность и предотвращения полное выражение поведенческого репертуара animal´s. Кроме того используются главным образом однонаправленный системы, позволяя либо записи3,,45 или стимуляции6,7 нейронной активности, но не в то же время или же цель, что делает его трудно отделить причинно-следственной связи между конкретными мозга активации структуры и поведения. В настоящее время доступны только несколько беспроводных, двунаправленный систем для подготовки в естественных условиях . Однако, они обычно тяжелые (40-50 г) и состоят из двух отдельных портативных устройств, т.е. главный этап и подключенных рюкзак для энергии на основе батареи питания8,9,10, делая их менее гибкие и увеличивая риск отключения кабеля например во время самостоятельного ухода поведение. Ни один из вышеупомянутых беспроводных систем предлагают имплантируемых микроэлектродные единиц для приобретения полной комплексной концепции нейронной активности во время полной этологических допустимое поведение с высокой воспроизводимостью экспериментальных условий.

Здесь вводится новый беспроводной, двунаправленные устройства для записи в естественных условиях и стимуляции нейронной активности в свободно себя крыс. Томас беспроводные системы (TWS) работает через съемные головы одноступенчатые, могут передавать многоканальный активности с использованием до четырех независимых записи каналов и может быть направлена для стимуляции электрическими мозга в реальном времени. Кроме того хронически имплантируемых микроэлектродные блок совместим с TWS был разработан, позволяющий нейронной стимуляции и записи. TWS программного обеспечения графический интерфейс пользователя, для записи и стимуляции также представил. Это исследование описывает реализацию проверки и в естественных условиях всего устройства.

С целью проверки системы TWS уступает colliculus был выбран в качестве целевого невральной структуры потому что открытой поведенческие реакции может вызвали его электрическая стимуляция. Широко известно, что электрическая стимуляция уступает colliculus вызывает безусловный «страх как» поведенческих реакций в организме крыс, как настороженность, боком позы, выгибая спину, замораживания и побег (полет) поведение. Этот шаблон ответа имитирует реакции страха вызвала, экологические проблемы, например воспринимается вредных событие, нападение или угрозу для выживания11,12,13. Предполагалось, что в состоянии добиться такого ясного и недвусмысленного поведение обеспечит реальный вызов для TWS.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

все протоколы и экспериментов были в соответствии с нынешней Европы (2010/63/ЕС) и утверждены региональными властями (Regierungspräsidium Gießen, Мистер 20/35 Nr.25/2015).

1. Животные

  1. дом мужчины взрослых крыс Wistar (200-250 g) в группах по 3-4 стандартных лабораторных условиях для по крайней мере за одну неделю до операции, чтобы позволить акклиматизации.
  2. Через два дня после операции, дом крысы в парах. Обложка одной клетки с высоким акриловые крышками. Избежать обычных крышки изготовлены из металлической сетки, поскольку имплантаты могут застрять, увеличивая риск, что они становятся поврежден и/или нестабильным над время.

2. Стереотаксической хирургии

  1. перед началом операции, организовать и подготовить следующие оборудование и материалы:
    1. получить стерильные хирургические оборудование, состоящее из стерильные ножницы, пинцет туп конца, шпатели, хирургические ножницы, стоматологическая дрель и бутоны хлопка.
    2. получения препаратов и химических веществ, включая изофлюрановая, xylocaine, трамадола гидрохлорид, декспантенол глаз Бальзам, 3% перекиси водорода, повидон йод и 70% этанол.
    3. Получить фиксацию материала, включая винты из нержавеющей стали, акриловые смолы, ультрафиолетовый клей и крышка протектор.
    4. Получить микроэлектродные группы, состоящей из (i) запись одного электрода (кварцевого стекла изолированные Платиновый Вольфрам микроэлектродные, с конической оконечности форму, наружный диаметр: 80 мкм, конический наконечник, сопротивление на 1 кГц: 500 ком) или тетрод (кварцевого стекла изолированные платины/Вольфрам 4 ядер микроэлектродные, внешний диаметр: 100 мкм, конический наконечник, сопротивление на 1 кГц: 500-800 ком); (ii электрод стимуляции (провод платины/Иридиум (90% платины, 10% иридия), основной диаметр 125 мкм, скорость, внешний диаметр 150 мкм, сопротивление < 10 ком) подключен к контактные пластины и (iii) электрод сравнения провода платины (диаметр вала, 100 мкм; Рисунок 1A).
    5. Получить Электрододержатель склеены с Водорастворимый клей к группе микроэлектродные и испытания на функциональность по крайней мере 2 h заранее ( рис. 1B).
    6. Получить обычные привязной системы, состоящей из дифференциального усилителя, основной усилитель и полосовой фильтр усилитель для записей.
    7. Получения дополнительных материалов, таких как перчатки, Отопление pad, шприцы и физиологического раствора.
    8. Получить дома клетки (L x W x H: 42 см x 26 x 38 см).
  2. Процедура
    Примечание: Имплантация электродов производится во время обычных стереотаксической хирургии под изофлюрановая наркозом.
    1. Убедитесь, что экспериментатор носить перчатки, хирургические маски и халате.
    2. Начать размещение животного в камеру индукции анестезии (изофлюрановая 4-5%, поток кислорода 1 Л/мин, продолжительность ~ 5 мин).
    3. Тест для потери рефлексов (хвост и мыс рефлексы) с щипцами для подтверждения глубокий наркоз.
    4. Голова животного в маску анестезии, фиксированной вокруг панели верхних резца стереотаксической рамы и отрегулировать анестезии (изофлюрановая 2-3%, кислорода поток 0,7-0,8 Л/мин).
    5. Исправить и горизонтального выравнивания животное ' s голову в стереотаксической аппарат, с помощью уха баров и верхних резца бара
    6. Бритья операционного поля, используя хирургические ножницы или ножниц и стерилизовать с повидон йод.
    7. Место животное на грелку для профилактики гипотермии и лечения глаз с декспантенол глаз Бальзам для предотвращения их от пересыхания.
    8. Придать xylocaine (0,3-0,4 мл, подкожно, s.c.) в центре хирургического поля.
    9. Тест для потери снова рефлексов.
    10. Сделать небольшой надрез (1,5 см) с помощью скальпеля в середине хирургического поля подвергать черепа. Аккуратно отделить кожи и удаления остаточной ткани, используя щипцы, ножницы и шпатель.
    11. Тщательно очистить с помощью перекиси водорода покрытием ватные палочки черепа.
    12. Отверстия 4-5 небольших (4,7 мм) в черепе для фиксации винтов из нержавеющей стали.
    13. Микроэлектродные блок/Электрододержатель соединиться предусилитель и прикрепить к стереотаксической микроманипулятор ( рис. 1B и 1 C).
    14. Просверлить отверстие (около 7 мм) в череп выше целевой области, с помощью координат от мозга Атлас согласно животное используется. В настоящем исследовании, положение электрода советы, направленных на нижней colliculus, используя следующие координаты, с bregma, выступающей в качестве ссылка: передняя/задняя, − 8,8 мм; Медиальная/боковое, 1,5 мм; и спинной/вентральный, 3,5 мм 14.
    15. Поглощать любые крови с ватные палочки.
    16. Вертикально ввести блок микроэлектродные советы электрода до целевой области.
    17. Позиция кабель заземления вдоль винты из нержавеющей стали и под кожу.
    18. Монитор всплеск активности и тщательно Отрегулируйте положение электрода с микроманипулятор до достижения зоны активных нейронов в целевой структуре и обнаруживать нейронной активности с соотношением сигнал шум, подходит для сортировки Спайк.
    19. Исправить микроэлектродные блок к черепу УФ клеем и контактные пластины и винты с акриловой смолы.
    20. Придать физиологического раствора (1 мл и.п.) и трамадола (25 мг/кг, s.c.) для предотвращения обезвоживания и соответственно обеспечить послеоперационное обезболивание,.
    21. Отключение блока микроэлектродные от держателя электрода с помощью щетки, смоченной в воде.
    22. Остановка анестезии, тщательно удалить крысы из стереотаксической рамы. Отсоедините усилитель от микроэлектродные исполнимых
    23. Кап защиты на микроэлектродные единицу имплантированных и отсоединяют только во время экспериментальной процедуры.
    24. Держать животных в парах в дома клетке на второй день после операции.
    25. Монитор животных ежедневно для возможного раневой инфекции, вес тела, состояния здоровья и общего поведения в течение 7 дней после операции. После этого периода восстановления, выполняют в vivo электрофизиологии и поведенческих экспериментов.
      Примечание: Хирургическая процедура длится от 60-90 мин. Во время операции, хвост Флик рефлексы должны постоянно контролируется и анестезии, при необходимости корректируются.

3. В естественных условиях Электрофизиологии

  1. оборудование и процедура
    Примечание: электрофизиологических записей и стимуляции выполняются с использованием TWS.
    1. Получить голову сцену с интегрированной предусилитель и подключенного аккумулятора (четыре записи каналов; аналоговые записи входной диапазон: 0-12 мВ pk-pk; стимуляции вывода: ±625 МКА; L x W x H: 24 x 22 x 12 мм; Вес: 6 г без батареи, 12 г с батареей; аккумулятор работает время до 1 ч). Это главный этап подходит быть подключены непосредственно к блоку имплантированных микроэлектродные через миниатюрные Многоконтактный разъем ( рис. 2).
    2. Получить батарея (литий ионный аккумулятор, 3,7-4,2 V DC, 230 мА, 27 мм x 20 мм x 6 мм, 1 ч время работы) монтируется поверх головы стадии ( рис. 2 c). При необходимости использовать замены аккумулятора емкостью 450 мА для примерно 2,5 ч время работы. Убедитесь, что зеленый свет приходит на головы стадии, пока аккумулятор подключен к ней
    3. Получить приемопередатчик (приемопередатчик) подключены к персональному компьютеру через стандартный порт USB и позволяет беспроводное операции для до 5 м ( Рисунок 2E).
    4. Получить персональный компьютер с программным обеспечением TWS для записи нейронной активности и электрической стимуляции ( рис. 3 и Рисунок 4 < / сильные>).
    5. Получить привязал предусилитель и система сбора данных, используемые во время операции (см. пункт 2.1.5) для записи и генератор стимул для стимуляции, чтобы сравнить efficaciousness TWS в бодрствовать крыс через одну неделю после операции.
      Примечание: Электрическая стимуляция предоставляется и внеклеточной активности от одного нейронов записывается из той же имплантированных микроэлектродные единицы с использованием обеих систем. Параметров стимуляции (интенсивность тока, пульса и частоты) должна быть скорректирована для каждого животного согласно мозга регионе целевых. В настоящем исследовании, 150-250 мкА, 2500 Гц тока используется для стимулирования уступают colliculus.
  2. Assays поведенческая
    Примечание: после металла барьер не вводится между трансивером и животных главный этап, TWS применима к широкий набор поведенческих задач. Как образцовое поведенческие тесты он был использован в открытом поле для измерения общей поведенческой активности и на повышенные плюс лабиринт, Стандартный тест для оценки тревоги подобное поведение у грызунов 15. Видео камеры помещенного в центре над открытом поле и повышенные плюс лабиринт для поведенческой записей.
    1. До поведенческое тестирование, обрабатывать каждое животное на три дня подряд (5 мин каждый день). Перед каждой обработки периода Подключите главный этап с батареей микроэлектродные группе ранее имплантирован. Не выполнять каких-либо запись или стимуляции во время обработки.
    2. Открытое поле
      1. место крыса в центре открытого поля (40 cm х 40 cm х 40 cm; красный свет ~ 30 Lux) и позволить ему исследовать аппарат для по крайней мере 5 минут под нейронных записи.
      2. Определить порог побег - минимальная интенсивность тока производства бег или прыжки. В настоящем исследовании, доставить высокой частоты стимуляции 2500 Гц (импульса: 100 МКС; интервал пульса: 100 МКС) до нижнего colliculus с интервалом 1 мин, увеличивая интенсивность тока на 20-50 мкА шаги до тех пор, пока у крыс отмечались побег поведение.
      3. Вернуть его домой клетке крыса, очистить поле Открыть (0,1% раствора уксусной кислоты) и сухой it.
        Примечание: Для того, чтобы сравнить эффективность стимуляции TWS с системой традиционных привязанный, описанная выше процедура была выполнена с использованием обеих систем.
    3. Повышенные плюс лабиринт
      Примечание: состоял из двух открытых оружия и из серый акрил плюс лабиринт, используемые в этих экспериментах (50 см х 10 см) и 2 закрытые оружия (50 см х 10 см шириной, с высокими стенами 40 см), простиралась от центральной пла tform повышенный уровень 50 см выше пола 16.
      1. Место крыса в центр плюс лабиринт облицовки к открытой руки и позволить ей свободно исследовать аппарат под продолжение записи в течение 5 мин.
      2. Записать количество записей в, и время, проведенное в открытых и закрытых оружия в течение 5 мин.
      3. Возвращение крысы его домой клетку, чистый (0,1% раствора уксусной кислоты) и сухой лабиринт перед каждой test.
    4. Перфузии и гистологии
      1. анестезировать Крыса с Ксилазина/кетамин (150 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно; и.п.).
      2. Устройство имплантированных электродов стимуляции кабеля и применение электростимуляции (текущей интенсивности 50 мкА, ширина импульса: 100 МКС; интервал пульса: 100 МКС) в течение 90 s для того чтобы произвести небольшой поражения вокруг электрода.
      3. Отсоедините кабель стимуляции и perfuse животных через левого желудочка с следуют параформальдегида 4% в буфере фосфат натрия 0,1 М, рН 7.3 200 мл физиологического раствора (подробное описание см. в Справочник 17 ).
      4. Удаление мозга и погружать его за 4 ч в свежих фиксатором на 4 ° C.
      5. Убедитесь, что температура камеры криостата главной при -20 ° с.
      6. Заморозить мозг на сухой лед и порежьте их на 50 мкм серийный корональных секций с помощью криостата.
      7. Пятно секции с cresylviolet для того, чтобы найти позиции электрода советы, по словам атлас по Paxinos и Уотсон 14.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технические данные TWS

Беспроводная система предлагает 4 независимых записи каналов и канал 1 стимуляции. Внеклеточного деятельность была подхвачена электрода одноядерный записи и передается входной сигнал высокий импеданс беспроводной системы. Записанный сигнал был предварительно усиленный (x200) AC-сочетании, дифференциального входного предусилителя и полосовой фильтрации (фиксированная полоса пропускания, 500 Гц... 5 кГц) для записи только многоквартирных деятельности, потому что в настоящем исследовании основной интерес для записи деятельности и не местных потенциалов поля. Главная усилитель интегрированный программируемый усиления предлагает программное обеспечение регулируемый выгоды для четырех каналов записи (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). Полный сигнал цепи беспроводной системы предложил общий прирост значения x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 и x12800. После усиления и фильтрации аналоговый сигнал был оцифрованы, аналого-цифровой преобразователь, модулированные на высокой частоты несущей и передано радиопередатчик, используя 2,4-2,5 ГГц ISM полоса. Один и тот же тип трансивер был использован на другой стороне пути передачи. Этот второй трансивер был подключен к персональному компьютеру через USB-порт. Пути передачи был использован для передачи данных bi направленного для отправки записанных внеклеточных сигналов от животного на компьютер и наоборот параметры управления для усиления сигнала и стимуляции от компьютера к животным.

С помощью TWS, можно было успешно записать активность мозга многоквартирных и изменить поведение животных, стимулируя уступает colliculus, в то время как крыса свободно перемещаться в открытом поле. Трансивер был сделан до 5 м от животного и был подключен к компьютеру через USB порт (см. Рисунок 2). Сравнение качества записываемого сигнала принесли с привязи и беспроводная система показана на рисунке 5. TWS записей многоквартирных деятельности с аналогичными качество сигнала как проводной запись системы. Микро стимулятор-что верно беспроводной стимулятором для обновления параметров стимуляции в режиме реального времени, т.е. сигнал стимуляции, чьи параметры определяются с помощью программного обеспечения TWS передается электрод стимуляции, подключенных к стадии головы в некоторых миллисекунд после нажатия на кнопку стимуляции. Таким образом это было можно изменить параметры стимуляции не принимая животное из клетки. Эта функция имеет то преимущество, что один можно свести к минимуму время для стимуляции экспериментов.

TWS программного обеспечения был специально разработан для управления все функции беспроводной системы (например, запись и стимуляции) через один графический пользовательский интерфейс (рис. 3 и рис. 4). Для стимуляции сигнал микро стимуляции, который был разработан с использованием графического интерфейса пользователя TWS программного обеспечения. Стимулятор TWS был использован в режиме сбалансированное стимуляцию постоянного тока заряда. Стимуляция шаблон был направлен беспроволочно стимулятор постоянного тока, интегрированных в беспроводной блок головы стадии. Стимуляция текущего был применен между рабочей микроэлектродные, помещены в целевом интерес (как for instance уступает colliculus в настоящем исследовании) и больше далеких счетчика электрод, который служил земли или ссылка электрод TWS. В зависимости от импеданса электрод стимуляции и соответствие напряжения постоянного тока стимулятора можно использовать текущий диапазон максимальной стимуляции ±625 МКА, хотя в настоящее время экспериментов требуется гораздо ниже порог тока. Здесь, двухфазный заряд сбалансированных постоянного тока стимуляции был использован с пике токи до 300 МКА. В случае двухфазный стимуляции первого импульса используется для получения физиологический эффект и второй пульс обычно меняет электрохимических процессов, происходящих во время импульса стимуляции18. TWS главный этап предоставляет шаблоны стимуляции режиме реального времени через графический пользовательский интерфейс программного обеспечения TWS (см. Рисунок 4).

TWS программное обеспечение делится на три основных раздела: (i) главное окно с элементами управления для записи и стимуляции, (ii) стимул генератор окна со всех параметров для параметров сигнала стимуляции и (iii) воспроизведение окно для воспроизведения данные, записанные файлы. Главное окно позволяет пользователю для отображения зарегистрированных сигналов до 4 каналов записи, установить выгоды для всех каналов и начать/остановить запись отображается сигналов. Сигнал данных хранятся в файле на жестком диске компьютера. В меню конфигурации задан путь к файлу. Кроме того, параметры записи главное окно позволяет для запуска и остановки процесса стимуляции. Постоянной стимуляции текущего, которое передается через электрод стимуляции в мозге животных отображается в режиме реального времени на экране главного окна. Параметры сигнала стимуляции являются предварительно скорректированная в окне настройки параметров стимула. Это позволяет определить моно - или двухфазные поезда импульса стимуляции и установить все часто используемые стимуляции параметров импульса как например импульса, амплитуда импульса, время между импульсами и т.д. (подробнее см. Рисунок 4). Функция импульса стимуляции, результаты от значения предварительно выбранных параметров отображается в графическое отображение в окне генератора стимуляции.

TWS программного обеспечения был разработан согласно удобство аспекты. Удобство использования программного обеспечения является важным фактором для обеспечения плавности хода эксперимента беспроводной стимуляции/записи и безопасной и комфортной рабочей среды. Это также помогает улучшить воспроизводимость результатов эксперимента.

Единичного запись данных и электростимуляции

Внеклеточные многоквартирных деятельности последовательно был записан в нижней colliculus от же имплантированных электродов, используя TWS и обычных привязанный запись системы. Рисунок 5 показывает представитель необработанные данные, записанные с помощью обеих систем, в то время как животное было свободно движущихся в открытом поле. Прямое сравнение сигналов предлагает аналогичные всплеска волновых форм и уровней шума (Рисунок 5А и 5B). Демонстрация Спайк формы изображен в A «и B».

Так как крысы не пытались удалить TWS главный этап, после операции и в течение последующих дней, предполагалось, что он не существенно мешать их движений и не вызывают дискомфорта. Таким образом используя TWS, широко распространенной проблемой в привязанный записи крыс было избегать как удаление и жевательные разъемов и кабелей. Действительно, крыс с головы стадии TWS смогли исследовать открытом поле и плюс лабиринт (see фильм 1) выставке нормальной переходы, воспитание и уход поведение.

Кроме того параметры стимуляции, используемые с TWS или обычных привязной системы вызывали же поведенческие итоги, здесь побег поведение. Начиная с 100 мкА, амплитуда тока стимуляции было увеличено шаг за шагом до тех пор, пока побег - минимальная интенсивность тока производства бег или прыжки - порогового и вызвал побега поведение. Пороговые значения отдельных побег 4 крыс были похожи, при использовании обеих систем (рис. 5 c).

figure-results-1
Рисунок 1: Микроэлектродные TWS исполнимых (1) записи одного электрода/тетрод, электрод стимуляции (2), Совет подключения волокна (3) электрод, (4) Гибкие соединительные кабели, (5) заземляющий провод, Совет (6) разъем, (7) мужчина или женщина разъем для системы TWS (A); TWS микроэлектродные ИБП подключен к предусилитель (8) и держатель (9); (B) готовы придавать Стереотаксическая рама (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 : Вид сверху головы этапа TWS установлен модуль (A) без питания аккумулятора. Всего габаритные размеры: высота 12,5 м, глубина 24 мм (19.3 мм + 4,7 мм), ширина 22.1 мм, вес: 5.96 g. вид снизу (B) показаны разъем блока электрод; аккумулятор питания, высота 9 мм, Глубина 26 мм, ширина 20 мм, вес 6 г (C); Обзор компонентов TWS, используемых для этого теста: (1) Глава этап блок с аккумулятором, установленный на animal´s череп, (2) трансивер подразделение, подключенные к компьютеру USB-порт, программное обеспечение (3) TWS (D); Фото крыса свободно двигаться и показаны стадии головы TWS подключен к микроэлектродные единицы ранее имплантирован (E) и программного обеспечения TWS, показаны образцовую записанных сигналов (F). TWS главный этап предоставляет шаблоны стимуляции режиме реального времени через графический интерфейс пользователя программного обеспечения TWS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: TWS программного обеспечения графического интерфейса пользователя, запись экрана. Производительность записи TWS один биполярного записи электродом, имплантированных в нижней colliculus, изображен на экране. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: TWS программного обеспечения графического интерфейса пользователя. стимуляция экран (A) и спецификации параметров стимуляции (B). Стимуляция параметров сигнала (C) как ширина импульса (PxW), амплитуда импульса (PxA), Интер задержка импульса (IPD), время между импульсами (TBP), пульс на поезд (PPT) и время между поездами (ТБТ) регулируемые через TWS программного обеспечения графического интерфейса пользователя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5 : Качественное сравнение между многоквартирных сигнал записан внеклеточно TWS (A) и проводной записи установки (B). Обе записи были получены из той же TWS микроэлектродные единицы (импеданс 0.5MOhm) в нижней colliculus. Осевое расстояние между двумя контактами записи электрод был приблизительно 400 мкм. Пропускная способность записи проводной системы и TWS были идентичными (500 Гц... 5 кГц), сигналы были взяты пробы с 40 (проводной системы) и 32 кГц (TWS). Обе системы записал многоквартирных деятельности с аналогичными качество сигнала. Существует нет четкое различие в стрельбы между TWS и проводной записей. Потенциал действия сигнала нейрона с обеих записей отображаются в A «и B». Аналогичные параметры стимуляции необходимы для 4 крыс достичь порога побег, используя привязной системы (TS) или TWS (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6
Фильм 1: Образцовое крыса, экспонируется нормальной произвольное поведение во время плюс test. лабиринт TWS позволяет животное, чтобы ввести открытые и закрытые оружия без проводов получать запутанную вверх в тестирование аппарат, пока он мал и света достаточно, так что это только минимально вмешивается в самой задачи. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь была представлена широко доступной беспроводной системы записи и стимуляции для электрофизиологических и поведенческих исследований в свободно перемещающихся животных. TWS протестирована в поведенческих анализов с использованием нижнего colliculus как модель структуры. TWS подход имеет несколько преимуществ по сравнению с существующими. Во-первых система использует портативный TWS головы одноступенчатые с предусилитель и аккумуляторная батарея, позволяя стабильные долгосрочные записей до 1 ч с ту же батарею и расстояние беспроводной операций для до 5 м. Во-вторых, главный этап TWS свет и компактный, весом 12 g, включая батарею и был разработан для предотвращения крысы от удаления головы стадии и жевать провода. Он был хорошо переносится животными с никакого воздействия на поведенческие репертуар animal´s с и без TWS было отмечено главный этап, делая систему применимых к широкий набор поведенческих задач. В-третьих система передает в режиме реального времени. В-четвертых путем записи одновременных двунаправленных и стимуляции нервной деятельности, система обеспечивает сложный инструмент для оценки причинно-следственных связей между конкретными мозга активации модели и поведения, таким образом, преодоление недостатков однонаправленный систем. Эта особенность делает метод особенно ценными для поля глубокая стимуляция мозга, которая обычно требует точной оценки, мониторинга и корректировки параметров стимуляции во время долгосрочного поведенческих экспериментов. Наконец блок хронически имплантируемых микроэлектродные был разработан с интегрированной записи, стимуляции и электрод сравнения, которая может быть легко имплантированы во время обычных стереотаксической хирургии. С этой точки зрения TWS является комплексной Беспроводная система, которая увеличивает воспроизводимость экспериментов стимуляции и записи. Качество записи TWS было показано, быть похожими на качество записи, принесли с коммерчески доступных проводной запись системы (см. Рисунок 5).

Широко известно, что электрическая стимуляция уступает colliculus крыс вызывает ясно побега поведение характеризуется бег или прыжки, который имитирует реакции страха вызвало экологических проблем11,12, 13. Это поведение было вызвано в настоящем исследовании уступает colliculus, используя TWS или традиционной привязной системы стимулирования. Для того чтобы проверить эффективность стимуляции TWS, пороги побег – минимальная интенсивность тока производства бег или прыжки-сравнивали с использованием обеих систем. Крысы с головы стадии TWS способны быстро, прыжки и восхождение из открытом поле, т.е. дисплей типичные побега поведение, с большей свободы передвижения. Важно отметить, что побег пороги были похожи по сравнению с традиционной системой привязи. Вместе довольно сложной парадигме был использован для тестирования устойчивости TWS, который он освоил в беспроблемный путь.

TWS также подходит для хронических электрической стимуляции экспериментов с блоком микроэлектродные имплантированных позволяет хроническое использование. TWS позволяет корректировки текущих параметров стимуляции очень точно в способ точно определить частоту и количество текущих стимуляции, который является эффективным выяснить поведенческие реакции. Кроме того то же самое животное была простимулирована с же порог тока через 3 дня и вызвали тот же ответ желаемого поведения. Это свидетельствует о том, что ткани вокруг кончика электрод стимуляции не пострадал от текущего стимуляции, что обычно требует повышенной стимуляции текущего амплитуд с повторных стимуляцию для того, чтобы добиться такой же поведенческие реакции.

Кроме того это позволяет значительно сократить время экспериментальных, потому что микро стимулятор TWS обновления параметров стимуляции в режиме реального времени, когда экспериментатор изменения их в графическом интерфейсе пользователя. Другие электрические стимуляторы19 применяется для доклинических исследований необходимо перепрограммировать для обновления параметров стимула. В тех случаях прибор запрограммирован, привязывая животных через кабель для программирования блока. Это не требуется при использовании TWS.

Наконец аккумулятор крепится к верхней части головы стадии TWS и электрически подключен к стадии голову через разъем магнит двух булавки для легкого обмена батареи. Преимущество заключается в том, что в ходе эксперимента можно изменить батарею без отключения TWS главный этап от блока имплантированных электродов, который является гораздо более удобной для животного. В настоящем исследовании мы использовали батарея, время которого операция является только 1 час. В случае, если эксперимент занимает более 1 h, рекомендуется иметь дополнительные заряженную аккумуляторную батарею. TWS может подключаться к замене аккумуляторов с мощностью (i) 230 мА на 1 ч время работы или (ii) 450 мА для примерно 2,5 ч время работы. Оба типа аккумуляторов можно полностью зарядить в 15 мин.

Таким образом настоящее исследование описывает операцию TWS предназначен для нейронной стимуляции и запись с свободно себя мелких животных. Также представлен полностью интегрированный набор имплантируемых микроэлектродные подразделение, главный этап, приемник и программное обеспечение. Качество записи беспроводной и стимуляции похож на что из привязанный записи системы с преимуществом является более комфортной, легкой и безопасной для животного. Таким образом TWS может использоваться для замены привязной системы, поскольку она не ограничивает мобильность животного и предоставляет гибкий способ для контроля стимуляции и нейронных записи при обстоятельствах где другие подходы, будет трудно или невозможно. Таким образом TWS может быть важным инструментом для изучения как электрической активности в определенных нейронных цепей создает определенные формы поведения, фундаментальный вопрос в неврологии.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Соавторы Uwe Томас и Саша Томас являются владельцами «Томас записи GmbH», которая занимается разработкой продуктов используемых в этом исследовании и связанных с этой темой общих исследований, описанных в данном документе. Кроме того соавтор Дирк Hoehl получает доход от «Томас записи GmbH». Они финансово могут воспользоваться это обстоятельство, если компания является успешным в маркетинге своей продукции, которые связаны с этого исследования. «Томас записи» оборудование, используемое в настоящем исследовании была посвящена Департамента поведенческой нейробиологии, экспериментальные и Биологическая психология - Universität Marburg Philipps без каких-либо обвинений.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана исследовательский грант от немецкой Федерации ассоциаций промышленных исследований (AiF; номер гранта: KF2780403JL3).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Thomas Wireless System (TWS) версии 2.0Thomas RECORDING GmbHAN001165Thomas Wireless System (TWS) версии 2.0 – это портативная многоканальная телеметрическая система с портативным компьютером, предустановленной операционной системой Microsoft Windows и управляющим программным обеспечением TWS. В состав TWS входят: малошумящий 4-канальный предисловие; и программируемый основной усилитель с фиксированной полосой пропускания, одноканальной постоянной– Стимулятор тока для подачи двухфазных импульсов тока, программируемый микростимулятор, имплантируемая система разъемов и базовый блок головного каскада для установки на животное. Система поставляется с приемопередатчиком с USB-портом для подключения ноутбуков или настольных персональных компьютеров, управляющее программное обеспечение работает под управлением операционной системы Microsoft Windows. Система TWS может быть использована для внеклеточной нейронной стимуляции и регистрации у свободно ведущих себя мелких животных (например, крыс, морских свинок). Эта система может быть адаптирована для использования и на более крупных животных (например, приматах).
Программное обеспечение для беспроводной системы Thomas Wireless System (TWS)Thomas RECORDING GmbHвключено в AN001165Программное обеспечение для беспроводной системы Thomas работает под управлением операционной системы Microsoft Windows и предоставляет графический пользовательский интерфейс (GUI) для беспроводной системы Thomas Wireless System (TWS). Графический интерфейс TWS обеспечивает полный контроль над функциями TWS: 4-канальная запись и 1-канальная стимуляция.
Имплантируемый тетрод для записи (4 канала) и стимуляции (один канал)Thomas RECORDING GmbHAN001132Имплантируемый тетрод для записи (4 канала) и стимуляции (один канал) для использования с Thomas Wireless Systems (TWS).
Характеристики записывающего тетрода: материал волокна тетрода: кварцевое стекло изолированное платиновое вольфрамовое волокно, внешний диаметр волокна тетрода: 100&микро; m, форма наконечника D, импеданс 0,5-0,8MOHm; Электрод сравнения: форма наконечника: D; Импеданс: 300-500 кОм; Материал: кварцевая изоляция платина/вольфрам; Спецификация электрода для стимуляции: материал волокна: платина/иридий, диаметр: 125&микро; m, утеплен лаком, форма наконечника: D, импеданс: < 10 кОм, размеры электрода могут быть указаны конечным пользователем
Имплантируемый микроэлектрод для записи (одноканальный) и стимуляции (одноканальный)Thomas RECORDING GmbHAN001118Имплантируемый микроэлектрод для записи (одноканальный) и стимуляции (одноканальный) для использования с Thomas Wireless Systems (TWS).
Технические характеристики регистрирующего электрода: материал электродного волокна: платиновое вольфрамовое волокно с изоляцией из кварцевого стекла, внешний диаметр электродного волокна: 80&микро; m/250&микро; m (уточните), форма наконечника D, импеданс 0,5-0,8MOHm; Электрод сравнения: форма наконечника: D; Импеданс. 300-500 кОм; Материал: кварцевая изоляция платина/вольфрам; Спецификация электрода для стимуляции: материал волокна: платина/иридий, диаметр: 125&микро; m, утеплен лаком, форма наконечника: D, импеданс: < Держатель 10 кОм
для имплантации электродовThomas RECORDING GmbHAN000838Специальный изогнутый металлический стержень для имплантации микроэлектродов для стандартных держателей электродов. Стержень используется для удержания имплантируемого электрода. Имплантируемый электрод крепится к стержню с помощью специального водорастворимого клея Thomas RECORDING (AN001080). (Держатель электрода в комплект не входит)
Запасной аккумулятор питания для беспроводной системы Thomas (3,7 В/230 мАч)Thomas RECORDING GmbHAN001208Запасной аккумулятор (аккумулятор) для беспроводной системы Thomas емкостью 230 мА на время работы примерно 1 час. (размер: 27 мм x 20 мм x 6 мм, вес около 6 г)
Сменный аккумуляторный блок питания для беспроводной системы Thomas (3,7 В/450 мАч)Thomas RECORDING GmbHAN001209Запасная аккумуляторная батарея (аккумулятор) для беспроводной системы Thomas емкостью 450 мА на время работы более 1 часа. (размер: 48 мм x 30 мм x 4 мм, вес около 11 г)
Зарядное устройство для аккумулятора Thomas Wireless System (TWS) АккумуляторThomas RECORDING GmbHAN001207Зарядное устройство с питанием от сети для аккумуляторов Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 и AN001209)
Водорастворимый клейThomas RECORDING GmbHAN001080Водорастворимый электродный клей Thomas RECORDING является специально подобранным продуктом для использования с имплантируемыми микроэлектродами в нейронаучных исследованиях. Его уникальные свойства обеспечивают жесткое соединение между электродом и монтажным устройством, хотя он легко снимается теплой водой. Водорастворимый электродный клей Thomas RECORDING можно использовать в готовом виде, без какой-либо трудоемкой подготовки. Водорастворимый электродный клей Thomas RECORDING не вреден для человека, животных и окружающей среды. Количество: 1 коробка по 10 грамм
Миниатюрный дифференциальный предусилительThomas RECORDING GmbHAN000329Миниатюрный дифференциальный предусилитель, модель MDPA-2 - это 2-канальный дифференциальный предусилитель, предназначенный для записи с низким уровнем шума из возбудимых тканей. Он предназначен для внеклеточной регистрации в сочетании с имплантацией имплантируемых микроэлектродов для свободно движущихся животных приложений с помощью беспроводной системы Томаса (TWS). 2-канальный миниатюрный дифференциальный предусилитель (MDPA-2) подключается к имплантируемым микроэлектродам для обеспечения начального десятикратного каскада усиления. В идеале для получения оптимальных результатов записи с высокой амплитудой сигнала и низким уровнем шума используются платиновые/вольфрамовые электроды Thomas RECORDING с изоляцией из кварцевого стекла. MDPA-2 имеет дополнительные входы для заземляющих электродов и электродов сравнения.
Соединительный кабельThomas RECORDING GmbHAN000330Соединительный кабель для подключения миниатюрного дифференциального предусилителя Thomas (MDPA-2) к основному усилителю и аккумуляторному блоку питания.
Аккумуляторный блок питания для миниатюрного предусилителяThomas RECORDING GmbHAN000328Аккумуляторный блок питания для миниатюрного дифференциального предусилителя (MDPA-2).
Аккумуляторное зарядное устройство (США)Thomas RECORDING GmbHAN000167Аккумуляторное зарядное устройство для AN000328 электропитания (сетевой сетевой конектор США)
Аккумуляторное зарядное устройство (ЕС)Thomas RECORDING GmbHAN000168Аккумуляторное зарядное устройство для AN000328 электропитания (разъем сетевой розетки ЕС)
Дифференциальный предусилитель/основной усилитель/полосовой фильтрThomas RECORDING GmbHAN000677Основной усилитель переменного тока TREC (LabAmp-03) — это одноканальный дифференциальный главный усилитель для нейрофизиологических применений (например, для внеклеточной записи с помощью микроэлектродов). Этот прибор предназначен для работы с миниатюрным дифференциальным предусилителем модели MDPA-2. Один канал LabAmp-03 содержит каскад дифференциального усилителя с высоким коэффициентом усиления и низким уровнем шума, за которым следуют фильтры низких частот и высокочастотных фильтров. Усилитель имеет два разных фильтра-усилителя, фильтр с одной единицей активности (SUA) – усилитель и фильтрующий усилитель с локальным потенциалом поля (LFP), оба соединены параллельно в сигнальном тракте. Режим записи предлагает два уровня усиления сигнала (x10, x100) в первом каскаде и 4 дополнительных уровня (x5, x10, x25 и x50) в конечном каскаде усилителя. Каждый усилитель имеет различные характеристики полосы пропускания для одиночной единицы активности (SUA) 500 Гц; 20 кГц и потенциалы локального поля (LFP) 0,1 Гц; 140 Гц. В устройство встроен аудиомонитор и оконный дискриминатор. LabAmp-03 имеет встроенный аудиомонитор с громкоговорителем. Данное устройство обеспечивает воспроизведение звука электрофизиологических сигналов. Устройство сочетает в себе усилитель звука в компактном, прочном корпусе. Это особенно подходит для мониторинга нейронных импульсов и мышечных сокращений. Вход аудиомонитора внутренне подключен к выходу усилителя SUA-Filter. LabAmp-03 поставляется с внешним источником питания для диапазона рабочего напряжения сети 100-240 В переменного тока/50-60 Гц.
USB-осциллографThomas RECORDING GmbHAN001096USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Этот 2-канальный осциллограф для ПК идеально подходит для мобильного использования на ноутбуке и стационарной установки в шкафах управления, промышленном оборудовании и многих других приложениях, где требуется небольшой, легкий и мощный осциллограф. Этот осциллограф подключается к сигнальному выходу основного усилителя для отображения регистрируемой внеклеточной активности во время планирования имплантируемых микроэлектродов для беспроводной системы Томаса (TWS). Пользователь может получать данные измерений по нескольким информационным интерфейсам непосредственно на ПК с помощью прилагаемого программного обеспечения для ПК.
Генератор стимуловМногоканальные системыSTG3008-FAГенератор стимулов для тока (STG) и стимуляции напряжением выполняют три функции: стимуляция током, стимуляция напряжением, управление и синхронизация. STG доступен с 2, 4 или 8 независимыми выходными каналами. Благодаря встроенным блокам изоляции для каждого выходного канала STG может выдавать сигналы произвольной формы.
Защитный колпачок для электродаThomas RECORDING GmbHAN001193Защитный колпачок для имплантируемого электродного блока для беспроводной системы Thomas Хирургическое
оборудованиеНожницы, тупые щипцы, шпатели, хирургические кусачки, бормашины и ватные палочки
Лекарства и химикатыизофлуран, ксилокаин, трамадола гидрохлорид (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ульм, Германия), декспантеноловая глазная мазь (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Германия), 3% перекись водорода, повидон-йод (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Германия) и 70% этанол;
креплениявинты из нержавеющей стали (BN650 M1.2x5; 4,7 мм), акриловая смола (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Ханау, Германия), ультрафиолетовый клей (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Германия) и протектор колпачка (Thomas Recording GmbH, Гиссен, Германия);
Дополнительный материалПерчатки, грелка, шприцы и физиологический раствор.
Стереотаксический инструмент для мелких животных (SASI)Thomas RECORDING GmbHAN000287Модель следует выбирать в соответствии с животным (крыса, морская свинка, обезьяны и т.д.), используемым в исследовании
ВидеокамераEverFocusEverFocus, модель: EQ150
Открытое полеИзготовлена из прозрачного или серого акрила, имеет круглую форму размером 40x40x40 см
Приподнятый плюс лабиринтИзготовлен из серого акрила и состоял из двух открытых рукавов (50 см в длину и 10 см в ширину) и двух закрытых рукавов (50 см в длину и 10 см в ширину, со стенками высотой 40 см), которые простирались от центральной платформы, приподнятой на 50 см над полом.
Материал :

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, R. P., Mielke, F., Bobrov, E., Brecht, M. Vocalization-whisking coordination and multisensory integration of social signals in rat auditory cortex. Elife. 3, e03185(2014).
  2. Tseng, W. T., Yen, C. T., Tsai, M. L. A bundled microwire array for long-term chronic single-unit recording in deep brain regions of behaving rats. J. Neurosci. Methods. 201 (2), 368-376 (2011).
  3. Ball, D., et al. Rodent scope: a user-configurable digital wireless telemetry system for freely behaving animals. PLoS One. 9 (2), e89949(2014).
  4. Chien, C. N., Jaw, F. S. Miniature telemetry system for the recording of action and field potentials. J. Neurosci. Methods. 147 (1), 68-73 (2005).
  5. Hawley, E. S., Hargreaves, E. L., Kubie, J. L., Rivard, B., Muller, R. U. Telemetry system for reliable recording of action potentials from freely moving rats. Hippocampus. 12 (4), 505-513 (2002).
  6. Alam, M., Chen, X., Fernandez, E. A low-cost multichannel wireless neural stimulation system for freely roaming animals. J. Neural. Eng. 10 (6), 066010(2013).
  7. Xu, S., Talwar, S. K., Hawley, E. S., Li, L., Chapin, J. K. A multi-channel telemetry system for brain microstimulation in freely roaming animals. J. Neurosci Methods. 133 (1-2), 57-63 (2004).
  8. Angotzi, G. N., Boi, F., Zordan, S., Bonfanti, A., Vato, A. A programmable closed-loop recording and stimulating wireless system for behaving small laboratory animals. Sci. Rep. 4, 5963(2014).
  9. Ativanichayaphong, T., He, J. W., Hagains, C. E., Peng, Y. B., Chiao, J. C. A combined wireless neural stimulating and recording system for study of pain processing. J. Neurosci. Methods. 170 (1), 25-34 (2007).
  10. Ye, X., et al. A portable telemetry system for brain stimulation and neuronal activity recording in freely behaving small animals. J. Neurosci. Methods. 174 (2), 186-193 (2008).
  11. Brandão, M. L., Tomaz, C., Leão-Borges, P. C., Coimbra, N. C., Bagri, A. Defense reaction induced by microinjections of bicuculline into the inferior colliculus. Physiol Behav. 44, 361-365 (1988).
  12. Brandão, M. L., Melo, L. L., Cardoso, S. H. Mechanisms of defense in the inferior colliculus. Behav Brain Res. 58, 49-55 (1993).
  13. Melo, L. L., Cardoso, S. H., Brandão, M. L. Antiaversive action of benzodiazepines on escape behavior induced by electrical stimulation of the inferior colliculus. Physiol Behav. 51, 557-562 (1992).
  14. Paxinos, G., Watson, P. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 3rd ed, Academic Press. San Diego, CA. (2007).
  15. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
  16. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods. 14, 149-167 (1985).
  17. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  18. Merrill, D. R., Bikson, M., Jefferys, J. G. Electrical stimulation of excitable tissue: design of efficacious and safe protocols. J Neurosci Methods. 141, 171-198 (2005).
  19. Ewing, S. G., Porr, B., Riddell, J., Winter, C., Grace, A. A. SaBer DBS: A fully programmable, rechargeable, bilateral, charge-balanced preclinical microstimulator for long-term neural stimulation. J Neurosci Methods. 213, 228-235 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Wireless Neural InterfaceBidirectional RecordingNeural StimulationFreely Behaving RatsTelemetric SystemInferior ColliculusMultichannel RecordingHead Stage ImplantationStereotaxic SurgeryOpen Field Assay

Похожие статьи