Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In Vitro и In Vivo обнаружения Mitophagy в клетки человека и C. Elegans, мышей

17.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56301

⸱

22 ноября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

Mitophagy, процесс очистки повреждения митохондрий, необходимых для митохондриального гомеостаза и медицинского обслуживания. В статье представлены некоторые из последних mitophagy методы обнаружения в клетки человека и Caenorhabditis elegans, мышей.

Аннотация

Митохондрии тяжеловесы клеток и клеточной энергии в виде АТФ. Митохондриальной дисфункции способствует биологическое старение и широкий спектр расстройств, включая метаболических заболеваний, синдромы преждевременного старения и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD). Поддержание митохондриального здоровья зависит митохондриальной биогенеза и эффективное разминирование неблагополучных митохондрий через mitophagy. Экспериментальные методы для точного обнаружения autophagy/mitophagy, особенно в животных моделях, была сложной для разработки. Недавний прогресс в направлении понимание молекулярных механизмов mitophagy дало возможность разработки методов обнаружения Роман mitophagy. Здесь мы представляем несколько универсальных методов для мониторинга mitophagy в клетках человека, Caenorhabditis elegans (например, Розелла и DCT-1 / LGG 1 штаммы) и мышей (mt-Keima). Сочетание этих методов обнаружения mitophagy, включая кросс видов оценки, повысить точность измерений mitophagy и привести к глубокому пониманию роли mitophagy в здоровье и болезни.

Введение

Mitophagy имеет важное значение для митохондриального обслуживания. Митохондрии пересекаются несколько клеток, сигнальные пути и являются универсальные субклеточном органеллы, ответственных за производство клеточной энергии, клеточный метаболизм и кальция гомеостаза1,2,3, 4. митохондрии постоянно испытывают проблемы от эндогенных и экзогенных источников, таких как реактивнооксигенных видов (ров) и митохондриальной токсикантов, соответственно, которые приводят к генерации «возрасте» и неблагополучных митохондрий. Накопление повреждения митохондрий снижает эффективность производства АТФ, увеличивая количество вредных рос и был связан с возрастных заболеваний, таких как метаболические заболевания, AD и PD1,5,6 . Чтобы предотвратить митохондрии индуцированных клеточных дисфункции, клетки необходимость конкретно признать повреждение митохондрий и эффективно удалить их через сотовый процесс называют митохондриальной autophagy (mitophagy). Это продемонстрировало важность mitophagy в области здравоохранения и болезни иллюстрирует необходимость точных и эффективных методов для обнаружения mitophagy в пробирке и в естественных условиях.

Mitophagy является многоступенчатого процесса с участием многих белков и белковых комплексов5,,78. Короче говоря повреждения митохондрий впервые признается и обхватил двойной membraned phagophore, которое может быть взято из плазматической мембраны, эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, ядро или митохондрий, сам9,10. Сферический phagophore удлиняется и в конечном итоге уплотнения митохондрии внутри, составляющие митохондриальной autophagosome (mitophagosome). Mitophagosome затем предохранители с Лизосома деградации, образуя autolysosome, в котором повреждения митохондрий это деградированных и переработанных в7,8. Основные autophagic белки, также участвующих в mitophagy включают в себя: Autophagy связанных 7 (ATG7) и Beclin1 (начало), белок Microtubule-Associated 1A/1B-свет цепь 3 (LC3-II) (LGG-1 C. Элs) и p62 (компонент phagophore), и связанные лизосомальных мембран гликопротеина 2 (LAMP2)6,7. Кроме того есть несколько основных белков, уникальные для mitophagy, включая PTEN-индуцированной Putative киназы 1 (PINK-1), Parkin1, ядерных белков Dot 52 кДа (NDP52), optineurin, BCL2 взаимодействия протеина 3 как (NIX/BNIP3L) (DCT-1 в C. elegans), среди других5,6,11.

Распространенным методом для выявления изменений в уровнях autophagy является соотношение LC3-II/LC3-я или LC3-II/актина. Однако этот метод является неспецифической, как увеличение этого показателя может отражать увеличение посвящения или нарушением синтеза mitophagosome Лизосома12. Другой метод заключается в оценке colocalization между autophagy маркера (например, LC3) и митохондриальных белок (например, ацилкарнитин из внешних митохондриальной мембраны 20 (TOMM20, который может снизиться протеосомы)). Однако, это может только указать изменения в уровнях общего mitophagy и не может отличить шаги в которых блокировка происходит. Это можно уточнить с помощью лизосомальных ингибиторы (например, A E64d + Pepstatin, называется EP) параллельно вызывают накопление mitophagosomes. Разница между количество mitophagosomes на базовом и количество mitophagosomes, после лечения с EP можно указать mitophagy. Эти ограничения побудили разработка методов обнаружения Роман mitophagy. С учетом растущей актуальности mitophagy в широком спектре заболеваний человека мы представляем несколько методов обнаружения надежные mitophagy, которые могут быть полезны для исследователей. Мы охватывают как in vitro и in vivo методы и рекомендуем совместить несколько методов для проверки изменений mitophagy.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животные (мужские и женские мышей) были родился и вырос в аккредитованных животных фонда, в соответствии и утверждения использования Комитета и низ животное уход. Методы эвтаназии должны согласовываться со всеми правилами национальных и институциональных.

1. Определение Mitophagy в клетках человека

  1. Обнаружение mitophagy с помощью плазмида mt-Keima
    Примечание: Keima белка, сливается в митохондриях целевой сигнал, упрощенный как МТ Keima, оказался полезным в естественных условиях обнаружения mitophagy. MT-Keima является ratiometric рН чувствительных флуоресцентный белок, которая exhibits Зеленая флуоресценция (возбуждения 458 Нм) в основной или нейтральных условий и красной флуоресценцией (возбуждения 561 Нм) в кислых условиях. Здоровые митохондрий процветать в условиях основных или нейтральной (рН 7-8) и обозначены зеленой флуоресценцией когда transfected с МТ Keima. Когда митохондрий проходят mitophagy и слиться с кислой лизосомы, pH опускается до 4.5 и митохондрии, содержащие МТ Keima выставка красной флуоресценции6,,1314. Главное mt-Keima устойчив к лизосомальных протеаз, позволяя оценки mitophagy в течение длительных периодов времени. Ниже протокол предназначен для 6-ну пластин.
    1. День 1: Используйте первичных клеток человека (например, фибробластов) или увековечен клетки человека (например, клетки НеЬа клетки или U2OS). Семя примерно 0,3-1 × 106 клеток/хорошо (в зависимости от темпы роста клеток, позволяют клеткам достичь 70% confluency на следующий день) в пластине 6-хорошо. Сохранить клетки в полной клетки культуры среднего (Дульбекко среднего изменения среднего орла (DMEM) с 10% FBS и 1% смешанного раствора пенициллина и стрептомицина) и инкубировать в инкубатор культуры клеток при 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Добавьте 1 мл полное клеток культуры среднего/колодец в пластине 6-хорошо.
      Примечание: Джин гиперэкспрессия/нокдаун или наркотиков лечения может быть сделано на этом этапе6.
    2. День 2: Mix МТ Keima плазмида ДНК6 и ДНК трансфекции реагента (смесь для одной скважиной 6-ну плиты).
      1. Развести 15 мкл Реагента трансфекции ДНК с 150 мкл сыворотки свободной среды согласно протоколу производителя.
      2. Развести 2-5 мкг МТ Keima плазмидной ДНК с 150 мкл сыворотки бесплатно среды.
      3. Добавьте разбавленные МТ Keima плазмиды разреженных ДНК трансфекции реагент, вихревые для 10 s и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
        Примечание: Оптимизация условий трансфекции ДНК могут быть необходимым в зависимости от размер плиты (см. протоколы производителей для подробной информации).
      4. Каплям добавить смеси реагентов ДНК/transfection клетки, а затем встряхнуть пластины мягко в течение 5-10 s до тех пор, пока решение полностью смешивается.
    3. День 3: Измените СМИ, заменив ДНК трансфекции реагент содержащих среднего свежий полный клетки культуры среднего (1 мл/хорошо).
    4. День 4: Изображения с помощью конфокальной микроскопии6клеток. Использование двух изображений каналы: зеленый канал (возбуждения 458 Нм, выбросов 570-695 нм) для визуализации нормальные митохондрии и красный канал (возбуждения 561 Нм, выбросов 570-695 нм) для визуализации митохондрий, которые проходят mitophagy. Случайно изображение 20 районах под 40 кратном для покрытия в общей сложности 100-200 клеток в каждой скважине.
    5. Выполните анализ данных. Рассчитать индекс «mitophagy» (процент митохондрий, проходят mitophagy), с помощью программного обеспечения для анализа изображений для количественной оценки суммы флуоресценции в красный и зеленый каналы: взять соотношение красной флуоресценции красный + зеленый флуоресценции, и умножить на 1006.
      Примечание: Альтернативы трансфекции включают в себя использование МТ Keima стабильно выразил НеЬа клетки линии14. Поскольку клетки HeLa не выражают Паркин, учиться Паркин зависимой mitophagy в этой линии клетки Паркин должны выражаться стабильно.
  2. Обнаружение с помощью colocalization между цитохром С оксидазы Субблок II (COXII) и LAMP2 mitophagy
    Примечание: COXII является белок митохондриального генома кодировке внутреннюю мембрану. Индекс mitophagy равняется отношение COXII colocalized с LAMP2, выраженное в процентах от общего количества COXII.
    1. Семя НеЬа клетки (или другие клетки интереса, упомянутый в шаге 1.1.1) в 4-ну палата слайд (1-5 × 104 клеток в 1 мл полное клеток культуры среднего/хорошо) в ячейку культуры инкубатора при 37 ° C (20% O2, 5% CO2) на ночь.
    2. Добавление 3.0 мкл 10 мм карбонильных цианид - 4 - phenylhydrazone (trifluoromethoxy) (FCCP) и инкубировать в инкубатор культуры клеток (шаг 1.2.1) за 3 ч.
      Примечание: Может использоваться других препаратов, влияющих на mitophagy.
    3. Удалите носитель культуры, с помощью пипетки 1 мл, вымыть клетки дважды с 1 мл/хорошо холодной (0-4 ° C) 1 x PBS. Пусть сидят в течение 10-30 s до следующего мытья решение. Затем добавьте параформальдегида 3,7% 0,5 мл (PFA) в ПБС в каждой скважине и проинкубируйте втечение 10 мин на льду исправить клетки.
      Предупреждение: PFA-токсин. Работа в вытяжной шкаф при использовании PFA.
    4. Отменить решение PFA, с помощью пипетки 1 мл, вымыть клетки дважды с холодной 1 X PBS (1 мл/колодец; пусть сидят в течение 10 раствор s до следующего мытья) и разрушения клеток в 1 мл/хорошо 0,25% моющего средства (ПБС) для 10 мин на льду.
    5. Сбросить permeabilizing буфера, аккуратно помыть клетки дважды с холодной 1 x PBS и отменить (пусть сидят в течение 10 решение s между стирок). Заблокировать ячейки с 1 мл/хорошо 5% FBS в однократном ПБС на ночь при 4 ° C. Обложка камеры для предотвращения потери влаги.
    6. Подготовить 0,5 мл/хорошо смешанных антитела раствора с COXII антитела (мышь, разведение 1: 250) и LAMP2 антитела (кролик, разведение 1:20-1:50) в однократном ПБС с 5% FBS и магазин на льду по 0,5-1 ч.
    7. Возьмите камеру 4-ну слайд из холодной комнате и отбросить блокировки решение с 1 мл пипетки. Осторожно промыть клетки дважды с 1 мл/хорошо холодной 1 x PBS и отменить (пусть сидят в течение 10 решение s между моет), затем добавить 0,5 мл/хорошо смешанных антитела решения. Инкубируйте при 37 ° C для 1 h на шейкер на низкой скорости.
    8. Отменить первый раствор антител с помощью пипетки 1 мл и аккуратно вымыть клетки три раза с 1 мл/хорошо холодной ПБС и отбросить. Пусть решение сидит 10 s до следующего мытья. Добавьте 1 mL/хорошо флуоресцентные вторичных антител (например, коза анти кролик с волны 568 Нм Красного флуоресцирующего белка (RFP) для LAMP2; и коза анти мышь с волны 488 нм зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) для COXII) в разведении 1: 250 с 5% FBS в однократном ПБС. Обложка 4-ну палата слайд с алюминиевой фольгой и инкубировать при 37 ° C для 1 h на шейкер на низкой скорости.
    9. Выбросите второй раствор антител с Пипетка 1 мл. Осторожно промойте клетки шесть раз с 1 мл/хорошо холодной ПБС. Пусть решение сидеть за 1 мин до следующего мытья.
    10. Смонтировать клетки с 50 мкл/хорошо antifade монтажа среды с DAPI и добавить скользит крышка.
    11. Изображение клетки под конфокального микроскопа с 66 x увеличение и погружения нефти (плитка сканирует / мозаики могут быть использованы для увеличения количество клеток, образ программного обеспечения). Используйте те же параметры, как время воздействия канала, цифровое увеличение, цифровой офсетной, и т.д. на протяжении всех изображений процессов (см. программное обеспечение инструкции для деталей)15.
    12. Использование colocalization анализ программного обеспечения для количественного анализа по меньшей мере 20 случайных изображений из 100 клеток15. Используйте функцию «Закрытые Безье» для выбора отдельных ячеек целиком. Сравните colocalization коэффициент Пирсона GFP в ППП, взвешенный или невзвешенными, чтобы определить уровни mitophagy в анализируемом клеток. Сохранять значения для горизонтальных и вертикальных перекрестье программного обеспечения для анализа colocalization по всему анализ. Чтобы точно задать эти перекрестье, подготовить два дополнительных набора клеток и один COXII и другие LAMP2 label. Затем установите перекрестия прямо над распределение пикселей для каждого канала15 (см. программное обеспечение инструкции для подробной информации).
  3. Высокая пропускная способность воображения измерения для скрининга mitophagy
    Примечание: Выполнение экраны высокой пропускной способности индуцировать mitophagy или mitophagy ингибирующих соединений от крупных составных библиотек является технически сложным. Тепловизионная техника, основанный на colocalization митохондрий с autophagosomes является более упрощенным, но высокочувствительный альтернативой для mitophagy скрининг16.
    1. День 1: Семя клетки (например, первичной фибробластов в 5000 клеток/100 мл клетки культуры СМИ/хорошо) в 96-луночных плиты (см. шаг 1.1.1).
    2. День 2: Лечить клетки из второй день с FCCP или других соединений, представляющих интерес для назначенных инкубации время (см. шаг 1.2.2).
    3. Выполните шаги 1.2.2-1.2.9 с использованием первичных антител для COXII (мышь, разведение 1: 250 с 5% FBS в однократном ПБС) и LC3B (кролик, 1: 100-1: 200 разрежения с 5% FBS в однократном ПБС). В качестве альтернативы может использоваться первичного антитела для COXII и LAMP2.
    4. Изображение клетки с помощью флуоресцентных читателя16. Собирайте изображения в случайно помещены поля и с минимум 500 клеток/хорошо.
    5. Анализируйте данные с помощью протокол анализатор индивидуальные ячейки16.

2. Определение Mitophagy в C. elegans

Примечание: Нематоду C. elegans обеспечивает платформу для анализа mitophagy на Организменное уровне. Два штаммы могут использоваться для мониторинга mitophagy: (1) ориентированные на митохондрии Розелла (mtRosella) или (2) mitophagy рецептор DCT-1 сливается с GFP наряду с autophagosomal маркер LGG-1 сливается с Discosoma sp. Красного флуоресцирующего белка (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy мониторинг с помощью биосенсора розелла
    Примечание: Розелла является молекулярный биосенсор, который сочетает в себе рН регистра DsRed сливается с рН чувствительных GFP вариант. Розелла биосенсор использует рН различия между кислой Лизосома (рН ~ 4.5) и других клеточных отсеков. Для успешного мониторинга mitophagy в Saccharomyces cerevisiae и несколько линий клеток млекопитающих, таких как HeLa, HEK293 и HCT11618,19был использован Этот биодатчик. Мы адаптировать этот универсальный двойной люминесцентные репортер и создания трансгенных C. elegans нематод, выражая ориентированные на митохондрии Розелла (mtRosella) в клетках мышц стенки тела. Mitophagy индукции обозначается сокращением GFP/DsRed отношение mtRosella флуоресценции.
    1. День 1: Выберите L4 личинок червей, выражая ориентированные на митохондрии Розелла (mtRosella) в мышечных клетках тела стена на семенами с E. coli (ОР50) с помощью микроскопа рассечение5пластину нематода роста СМИ (НГМ). Поместите червей/плита 10-20 на по крайней мере три пластины 3,5 см. Инкубируйте нематоды при стандартной температуре 20 ° C5.
      Примечание: В справочнике для анатомии червь, включая выявление L4 личинки20и способ сделать выбор, который используется для передачи червей из одного места в другое21.
    2. День 5: Синхронизировать нематод, выбрав 15-20 L4 трансгенных личинок и передачи их на свежий ОР50 семенами NGM пластины. Используйте по крайней мере пяти плит на экспериментальной условие.
    3. День 7: Подготовьте автомобиль пластины для mitophagy затрагивающих наркотиков интерес или положительных элементов управления.
      1. Убивают бактерии E. coli (ОР50), семенами, подвергая NGM пластины для 15 мин с 222 мкВт/см2 (интенсивность) УФ света для обеспечения, чтобы заставить mitophagy соединений не метаболизируется бактериями. Плиты должны быть отображены с 2000 J/м2.
        Примечание: Секунды воздействия необходимо = 2000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Добавьте compound(s) интерес к верхней семенами NGM плит. Добавьте эквивалентную сумму составных транспортного средства (растворителя используется для растворения соединения, такие как диметилсульфоксида (ДМСО)) автомобиль пластины как отрицательный контроль. Положительный контроль mitophagy индукции, митохондриальных токсикант, был использован гербицида (8 mM концентрации выпускных экзаменов). Добавьте раствор, содержащий 10 мкл 8 М параквата акций с 190 мкл ddH2O верхней плиты агара для лечения группы. Для транспортного средства группы добавьте раствор, содержащий 10 мкл ДМСО с 190 мкл ddH2O верхней плиты агара.
        Примечание: Параквата рабочий раствор может храниться в течение 1 месяца при 4 ° C.
      3. Аккуратно водоворот пластины до наркотиков или автомобиля покрывает всю поверхность. Разрешить пластины для просушки с крышками, закрыт при комнатной температуре по крайней мере 1 час перед передачей червей.
        Примечание: Наркотиков пластины также может быть подготовлен путем добавления препараты в жидком NGM, прежде чем он твердеет.
    4. День 7: Передачи 10-20 2-дневных взрослых трансгенных животных, подготовленную на этапе 2.1.2 к пластинам содержащие параквата, compound(s) интерес, или транспортного средства (ДМСО). Инкубируйте трансгенных животных при 20 ° C в течение 2 дней.
    5. День 9: Подготовка 2% агарозном колодки (см. Дополнительные материалы). Затем добавьте один капли (10 мкл) 20 мм левамизол в M9 на площадку. Иммобилизации трансгенных животных для изображений, путем размещения их в раскрывающемся списке M9-Левамизол. Осторожно поместите coverslip на вершине.
    6. Захват один трансгенных животных, с помощью камеры, прикрепленной к помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Приобрести флуоресцентного изображения всего трансгенных нематод, выражая mtRosella в клетках мышц стенки тела на увеличение 10 X5. Сохраните собранные изображения.
    7. Обработка полученных изображений с ImageJ программного обеспечения. Анализируйте стенки тела мышечных клеток, расположенных в голову червя избежать аутофлюоресценция в тканях кишечника. Измерьте средняя интенсивность значение и общая площадь пикселя для каждого флуоресцентного изображения только области головы каждого животного. Для анализа конкретной области интересов:
      1. Выберите «разделить канал» в «образ» и «цвет» раскрывающемся меню для преобразования изображений.
      2. Используете инструмент «руки выбора», чтобы захватить люминесцентная область интересов.
      3. Выберите команду «измерения» под «анализа» раскрывающееся меню и выполнять анализ интенсивности пикселей.
      4. Интенсивность пикселя следует нормализовать путем деления интенсивности, Общая площадь проанализированы. После нормализации Вычислите GFP-DsRed соотношение22.
    8. Использование статистического анализа программного обеспечения либо провести студенческие t-тест (сравнение между двумя группами) или дисперсионного анализа (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с p < 0,05 как значительный5,17 .
  2. Оценки с использованием совместного локализации между DCT-1 и LGG-1 mitophagy
    Примечание: DCT-1 является внешней митохондриальной мембраны белок, который действует как mitophagy рецепторов в ответ на стресс условия, аналогичные его предполагаемого orthologues BNIP3 и NIX/BNIP3L в млекопитающих5. Таким образом посвящение mitophagy оценивается совместно локализации между DCT-1 mitophagy рецепторов и autophagosomal мембранный белок LGG-1 (гомолога млекопитающих LC3).
    1. День 1: Выбрать L4 личинки трансгенных животных, выражая DCT-1::GFP и DsRed::LGG-1 в стенки тела мышечных клеток5 на ОР50 семенами NGM пластины. Место 5-10 червей/3.5 см пластины и использовать по крайней мере три пластины. Инкубировать нематоды при 20 ° C.
      Примечание: Трансгенов расположены на отдельных плазмид, и они не интегрированы в геноме. Подберите нематод, проведение rol-6(su1006) и pmyo-2 GFP contransformation маркеров. Только трансгенных червей с обеих contransformation маркеры Экспресс DCT-1::GFP и DsRed::LGG-1 в стенки тела мышечных клеток.
    2. Следуйте инструкциям от 2.1.2-2.1.5.
    3. Изображения одной стенки тела мышечных клеток с помощью камеры, прикрепленной к конфокального микроскопа5,23. Определить границы всей стенки тела мышечных клеток и взять z стек изображений до 63 x увеличение. Увеличение может также использоваться.
    4. Открывать и обрабатывать изображения, полученные с помощью конфокальной программного обеспечения. Начало mitophagy обозначается Сопредседатель локализации mitophagy рецептора (DCT-1::GFP) autophagosomal маркер (DsRed::LGG-1). Вручную Измерьте Сопредседатель локализации события каждого стека стенки тела мышечных клеток5. Важно сохранить все параметры микроскоп и камеры (объектив и лупы, фильтры, выдержка, резолюции, лазерной интенсивности, прибыль, и т.д.) несогласованной экспериментов. Следует отметить все настройки.
    5. Использование статистического анализа программного обеспечения либо провести студенческие t-тест (сравнение между двумя группами) или дисперсионного анализа (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с p < 0,05 как значительный5,17 . Для двусторонней сравнения используют студента t-тест (p < 0,05 считается значительным). Для нескольких сравнений используют один фактор (ANOVA) дисперсионного анализа, исправить пост Специального теста Бонферрони. Мы рекомендуем, анализируя животных по крайней мере 50-70 или 30-50 стенки тела мышечных клеток для каждого экспериментальные условия. Повторите эксперимент по крайней мере три раза.

3. Обнаружение Mitophagy мышей

Примечание: Предыдущие методы для обнаружения mitophagy в мышах были громоздкие, нечувствительным и трудно подсчитать. Трансгенные мыши модели, выражая митохондриальной целевой форме флуоресцентные репортер Keima (mt-Keima) теперь могут быть использованы для оценки уровня mitophagy в широком диапазоне условий физиологических и патофизиологических.

  1. Усыпить мышей с использованием протокола, утвержденным институциональный уход животных и использование Комитета14.
  2. Закрепите мыши (вентральной стороне вверх) на рабочую платформу, с помощью булавки в конечностях. Сделайте надрез в нижней части живота, с использованием микрохирургии ножницы и щипцы для предоставления печени24. Вырезать кусок печени (например, кусок правой доли в 1 × 1 × 1 см) с использованием микрохирургии ножницы и пинцет.
    Примечание: Обнаружение mitophagy в мышах сложна и требует знаний о мыши анатомии и обработки весьма умелыми мыши и мыши хирургии. Этот протокол предоставляет базовые, основные шаги на этот метод, и более подробный метод доступны24.
  3. Место печени образца на металлической пластине на льду быстро охладить ткани. Держите ткани на металлической табличке, холодной и обработать как можно быстрее. Оптимально используйте в течение 1 ч диссекции.
  4. Поднимите печени образца с помощью Изогнутый пинцет и промыть с 5 мл ледяной ПБС.
  5. Передача печени в чашке Петри (Ø 100 мм) на льду, с помощью ложки конце шпателя.
  6. Нарежьте печень образца вручную 0,5-1 мм толщиной разделы, используя один край лезвия.
  7. Тщательно передать блюдо дно стекла с помощью щипцов микрохирургии в разделах ткани.
  8. Осторожно установите печени раздел с щипцы для укладки на дне.
  9. Обложка ломтики печени с 3-5 капель холодной ПБС.
    Примечание: DAPI окрашивания рекомендуется определить области интереса в некоторых тканях (например, мозг)24. Чтобы проверить совместное локализации красной МТ Keima сигнала с Лизосома, лизосомальных красителей, например синий Каскад декстрана и lysosensor, может быть использоваться24.
  10. Изображения в разделах ткани под confocal микроскопии через два последовательных возбуждений24. Два изображения каналов: «зеленые» МТ Keima канал (возбуждения 458 Нм, диапазон выбросов 570-695 нм) и «красных» МТ Keima (возбуждения 561 Нм, диапазон выбросов 570-695 нм). Сохранение изображений параметров между экспериментальных условиях. Для более эффективной обработки изображений, анализ двух животных сразу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обнаружение Mitophagy в клетках человека:

С помощью процедуры, представленные здесь, человеческие клетки НеЬа были transfected с МТ Keima плазмиды. Здоровые клетки продемонстрировали хорошо организованной сети митохондриальной (GFP, 488 нм) с несколько случаев mitophagy (ППП, 561 Нм). Однако, клетки предварительно обработанных с митохондриальных uncoupler FCCP (30 мкм для 3 h) выставлены глубокое увеличение заболеваемости mitophagy...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Точное измерение mitophagy является технически сложным. Здесь мы представили несколько надежных методов, которые позволяют для обоих качественного обнаружения mitophagy и количественной оценки уровня mitophagy в наиболее распространенных лабораторных экспериментальных моделей.

Для получения воспроизводимых данных, необходим экспериментальный дизайн с по крайней мере три биологических повторяется. Все исследователей, участвующих в эксперименты и анализ должны ослепил экспериментальной группы уд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Bohr Лаборатория имеет CRADA договоренностей с ChromaDex и GlaxoSmithKline.

Благодарности

Мы благодарим д-р Ацуши Miyawaki и д-р Ричард Дж. Юль для совместного использования МТ Keima плазмиды и МТ Keima интегрированы НеЬа клетки. Мы благодарим Елена а. Shamanna и д-р Дебора л Крото за критическое прочтение рукописи. Это исследование было поддержано очной программы исследований NIH (VAB), Национальный институт по проблемам старения, а также 2014-2015 и 2016-2017 Ниа интра Лаборатория Грант (EFF, VAB). EFF поддержал RHF SOR-Ост ХЕЛЬЗЕ (проект No: 2017056) и научно-исследовательский совет Норвегии (проект No: 262175).

АВТОР ВЗНОСЫ:

EFF предназначена рукописи и подготовила проект; КП, NS, EMF, RDS, ОАО, SAC, YH и Эд писал различные разделы документа; NT, JP, HN и VAB пересмотренный рукописи и опыта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
mt-Keima мышьJackson Laboratory
Lipofectamine 2000 реагент для трансфекции ДНКThermofisher#11668027
среда Opti-MEM (Gibco)Thermofisher#31985062бессывороточная среда
mtKemia плазмида: pCHAC-mt-mKeimaaddgene#72342
COXII антитело (мышь)abcam#ab110258
LAMP2 антитело (кролик)NOVUS
коза - анти-кролик с длиной волны 568 нм красного флуоресцентного белка (RFP)Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568 краситель
коза - анти-мышь с длиной волны 488 нм зеленого флуоресцентного белка (GFP)Thermofisher#Z25002Alexa Fluor 488 краситель
продлевает золото антифейд с DAPIInvitrogen#P36931
6-луночный планшетSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
4-луночный камерный слайдTHermofisher, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F 96-луночный планшетThermofisher#152038
LC3B антитело кроликаNOVUS#NB100-2220
ДНК-антителоProgen Biotechnik#anti-ДНК мышиный моноклональный, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306защитная от выцветания монтажная среда с DAPI
IN Анализатор клеток (флуоресцентный считыватель )GE Healthcare Life Sciences#IN Анализатор клеток 2200
Eclipse TE-2000e Конфокальный микроскопNikon#TE-2000e
Программное обеспечение для колокализацииVolocity#Volocity 6.3альтернативное программное обеспечение Zeiss ZEN 2012
IN Cell Investigator SoftwareGE Healthcare Life Sciences#28408974
среда для культивирования клетокThermofisher#DMEM– Модифицированный
(10,000 Ед/мл)Thermofisher#15140122
Сыворотка плода крупного рогатого скотаSigma-Aldrich#12003C-1000ML
Инкубатор для клеточных культурThermofisher#Thermo Forma 3110 CO2 Инкубатор с водяной рубашкой Эпифлуоресцентный
микроскопZeissZeiss Axio Imager Z2
фотоаппаратOlympusOlympus DP71
конфокальный микроскопZeissZeiss Axio Observer Z1
конфокальный софтZeissZEN 2012
софт для анализа изображенийImage Jколокализационный анализ и т.дhttps://imagej.nih.gov/ij/
статистического анализаGraphPad Software Inc., Сан-Диего, СШАМатериал пакета программного обеспечения GraphPad Prism
для изготовления червячной киркиSurepure Chemetals#4655Кирка изготовлена из проволоки 30 калибра 90% платины 10% иридия
IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]Material inquiry to Tavernarakis NektariosСодержание трансгенных животных в возрасте 20 ° C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]Запросматериала Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::RosellaЗапрос материала Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFPЗапрос материала Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed:: LGG-1Запрос материала к Tavernarakis Nektarios
Раствор паракватасм. дополнительные данные для приготовления
M9 буферсм. дополнительные данные для препарата
M9-левамизолбуфер см. дополнительные данные для получения
Стеклянный микроскоп Слайды и покровные стеклаFisher Scientific#B9992000
Хирургические щипцыSTERIS Animal Health19 шт. Собачья стерилизация Экономичные
хирургические ножницыSTERIS Animal Health19 шт. Собачья стерилизация Экономия
1x PBSThermofisher#AM962510x PBS необходимо разбавить до 1x PBS с помощью шейкера ddH2O
Fisher Scientific#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP Настольный орбитальный малый открытый платформенный шейкер Упаковка
% агарозной прокладкисм. дополнительные данные для подготовки
Вибросликовые лезвияМировые прецизионные инструменты#BLADES-2однолезвийное лезвие
металлическая пластинаMSC#788039880,012 дюйма в толщину x 6 в ширину x 12 в длину, 430 Лист из нержавеющей стали
Triton X-100моющее средство
Метилвиологина дихлорид гидратSigma-Aldrich#856177паракват
Инкубатор для нематодAQUALYTICИнкубатор для поддержания 20° C
Препарирующий стереомикроскопOlympusSMZ645
Конфокальный микроскопZeissAxioObserver Z1Для нематод (шаг 2)
Эпифлуоресцентный микроскопZeissAxioImager Z2Для нематод (шаг 2)
УФ-сшивательVilber LourmatBIO-LINK – BLX-E365источник ультрафиолетового излучения; 356 нм
#CD107b пенициллин-стрептомицин Dulbecco's Eagle Medium . софт 2

Ссылки

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397(2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Mito KeimaC elegansHeLaFCCPLAMP2 COXII
In Vitro и In Vivo обнаружения Mitophagy в клетки человека и C. Elegans, мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.