Целеуказание тиолы цистеина в Vitro участкам гликозилирования рекомбинантных белков

Хранить оперированных кальция (Ca^{2 +}) вход (SOCE) является основным путь, по которому иммунные клетки take up Ca^{2 +} от внеклеточного пространства в цитозоль. В Т-лимфоцитов Т-клеток рецепторов, расположенных на мембране плазмы (PM) связывать антигены, которые активируют белка тирозин киназ (обзор в ^1,2,3). Фосфорилирование Каскад приводит к активации фосфолипазы γ (PLCγ), который впоследствии опосредует гидролиза мембраны фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (пункт₂) в диацилглицерол и инозитол 1,4,5-trisphosphate (IP₃ ). IP₃ является небольшой diffusible messenger, который привязывается к IP₃ рецепторов (IP₃R) в эндоплазматический ретикулум (ER) тем самым открыв этот рецептор канал и разрешительные Ca^{2 +} течь вниз градиент концентрации от ER просвет в цитозоле (обзор в ⁴). Рецептор сигнализации от G-белка в сочетании и тирозин киназы рецепторов в различных других типов свинца возбудимых и не возбудимых клеток же производства IP₃ и активации IP₃Rs.

Из-за ограниченных Ca^{2 +} емкость ER, IP₃-опосредованной выпуска и результирующая увеличение цитозольной Ca^{2 +} только является несохраняемым; Однако, это истощение ER Люминал Ca^{2 +} глубоко эффекты стромальные взаимодействия молекулы-1 (STIM1), тип-я трансмембранного (TM) белков чаще встречаются на ER мембраны ^5,6,7. STIM1 содержит люмен ориентированный Ca^{2 +} зондирования домен состоит из пары EF-рука и стерильные α-мотив (EFSAM). Три ориентированных на цитозольной биспиральных домены отделены от EFSAM одного домена ТМ (обзор в ⁸). После ER Люминал Ca^{2 +} истощение EFSAM подвергается дестабилизации в сочетании олигомеризации ^7,9 , который вызывает структурных перестроек ТМ и домены биспиральных ¹⁰. Эти структурные изменения кульминацией треппинга STIM1 ER-PM развязок ^11,12,13,14 через взаимодействие с вечера фосфоинозитидов ^{15, 16} и Orai1 субблоков ^17,18. Orai1 белки являются субблоков вечера, которые собираются форме Ca^{2 +} каналы ^19,20,21,22. STIM1-Orai1 взаимодействий на перекрестках ER-PM содействовать открытой Ca^{2 +} релиз активирован Ca^{2 +} (CRAC) канал конформации который позволяет движение Ca^{2 +} в цитозоль от высоких концентраций внеклеточного пространства. В иммунных клеток, устойчивый цитозольной Ca^{2 +} фасады каналам Крак побудить Ca^{2 +}- Кальмодулин/кальциневрина зависимых дефосфорилирование ядерного фактора активированные Т-клеток, который впоследствии проникает в ядро и начинает регуляцию генов, поощрение Т-клеток активации ^1,3. Процесс активации Крак канал STIM1 ^23,24 через агонист индуцированной ER Люминал Ca^{2 +} истощения и результате устойчивой цитозольной Ca^{2 +} высота собирательно именуются SOCE ²⁵. Жизненно важную роль SOCE в Т-клеток проявляется исследования демонстрируют, что наследственные мутации в STIM1 и Orai1 может вызвать тяжелый комбинированный иммунодефицит синдромы ^{3,19,26, 27}. EFSAM инициирует SOCE после зондирования ER-просветный Ca^{2 +} истощение через потери Ca^{2 +} координации на канонической EF-рука, в конечном счете приводит к дестабилизации в сочетании самостоятельной ассоциации ^{7, 28,29}.

Гликозилирование является ковалентной привязанность и обработка олигосахарида структур, также известный как гликаны, через различные биосинтетических шаги в ER и Гольджи (обзор в ^30,,32-³³). Существует два преобладающего типа гликозилирования у эукариот: N-связанные и O-связаны, в зависимости от конкретных amino acid и преодоление связь атома. В N- гликозилирования, гликанов прикрепляются к боковой цепи Амида в АСЦ, и в большинстве случаев, шаг возбуждение возникает в ER как полипептидной цепи перемещается в Люмене ³⁴. На первом шаге N- гликозилирования является передача четырнадцать сахара ядра структура, состоящая из глюкозы (КЗС), манноза (Man) и N- acetylglucosamine (GlcNAc) (т.е. Glc₃человек₉GlcNAc₂) от ER мембранных липидов, ^35,oligosaccharyltransferase³⁶. Дальнейшие шаги, такие, как расщепление или передаче остатков глюкозы, в ER катализируемые конкретную основу и гликозидазы. Некоторые белки, которые оставляют ER и переехать в Гольджи можно дополнительно обработанных ³⁷. O- гликозилирования относится с добавлением гликаны, обычно в боковой цепи гидроксильной группы Ser или чет остатков, и это изменение происходит полностью в комплекс Гольджи ^33,34. Существует несколько O- glycan структур, которые могут быть сделаны N- acetylglucosamine, Фукоза, галактоза, и сиаловая кислота с каждым моносахаридов последовательно добавлены ³³.

Хотя без конкретных последовательность была определена в качестве предпосылки для многих типов O- гликозилирования, общую последовательность консенсуса был связан с N-связанных изменений: Asn-X-Ser/Чет/КМС, где X может быть любой амино кислоты за исключением Pro ³³. STIM1 EFSAM содержит два из этих консенсуса N- гликозилирования сайтов: Asn131-Trp132-Thr133 и Asn171-Thr172-Thr173. Действительно предыдущие исследования показали, что EFSAM может быть N- гликозилированного в клетках млекопитающих в Asn131 и Asn171^{, 3839,40,41}. Однако, предыдущие исследования последствий N- гликозилирования на SOCE были несовместимы, предлагая подавлены, потенцированные или не влияет на этот столб-поступательные изменения на SOCE активации ^38,= «внешней» > 39^40,,41. Таким образом исследования на основные биофизические, биохимические и структурные последствия EFSAM N- гликозилирования жизненно важное значение для понимания нормативных последствий этой модификации. Из-за требования для высоких уровней однородных белков в этих экспериментах в пробирке сайт селективный подход к ковалентно придают глюкоза постановление EFSAM был применен. Интересно, что Asn131 и Asn171 гликозилирования вызвало структурные изменения, которые сходятся в пределах EFSAM ядро и усиливают биофизические свойства, способствующие STIM1-опосредованной SOCE ⁴².

Химическая приверженность glycosyl групп Cys тиолы был хорошо установленными плодотворную работу, которая впервые продемонстрировал полезность этого фермента свободный подход к пониманию участкам воздействия гликозилирования на функции белка ^{43 , 44}. совсем недавно и в отношении STIM1, остатки Asn131 и Asn171 были мутировал Cys и glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] была использована для ковалентно связать бесплатно тиолы ⁴²глюкозы. Здесь мы опишем этот подход, который не только использует для включения конкретных остатки Cys сайт для модификации мутагенеза, но также применяется решение ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопия быстро оценить изменения эффективности и структурной возмущений в результате гликозилирования. Особенно эта общая методология легко адаптируется для изучения последствий либо O- или N- гликозилирования любого recombinantly производства белка.

1. полимеразной цепной реакции (ПЦР)-при посредничестве сайта Направленный мутагенез для включения Cys в вектора выражения бактериальной ПЭТ 28a.

1. Определить концентрацию ПЭТ 28a вектора (то есть двойной мель ДНК) с помощью ультрафиолетового (УФ) Коэффициент вымирания 0,020 (мкг/мл) см ^-1 на 260 Нм.
2. Синтезировать пару дополнительных мутагенных Праймеры для каждого мутация Cys такие что я) в шаблон до первой базы несоответствия и 15 нуклеотидов дополняет шаблон после дополняют минимум 15 нуклеотидов окончательный базовый несоответствие, ii) общий праймер длина не превышает 45 нуклеотидов и iii) гуанин или цитозин расположен в первый и последний нуклеотидной позиции каждого праймера (таблица 1). Обеспечить синтез праймера осуществляется с помощью очистки масштаба и картридж 0,025 мкмоль.
3. С использованием высокоточных ДНК-полимеразы, настроить два 20 мкл ПЦР реакция смеси: один содержащие вперед грунтовка и второй содержащие обратный грунтовка. Подготовка каждого смеси содержат окончательной концентрации 1 x PCR буфера с 1,5 мм MgCl ₂, дНТФ 0,2 мм, 0,5 мкм грунт, 0.4 мкл ДМСО, 1,25 нг/мкл шаблон ДНК, 0,02 U/мкл высокой верности ДНК полимеразы.
4. Термически цикл отдельных смесей с использованием протокола три шага: 98 ° C за 30 s (денатурации), 53-56 ° C за 30 s (отжиг), 72 ° C для 30 s kilobase(kb) ^-1 (расширение) шаблона ДНК. Повторите температурная программа для 5 циклов и добавить шаг расширение окончательный 72 ° C для 7,5 мин
5. После первоначального ПЦР с прямого и обратного грунтовки в отдельных труб, сочетать продукты в одну трубу (т.е. всего 40 мкл) и продолжить реакции PCR для дополнительных 20 циклов, с использованием же Велоспорт параметров, как описано в шаге 1.4.
Гель
6. electrophorese 15 мкл реакционной смеси ПЦР на агарозы 1% (w/v), с помощью 0.5 x Tris, уксусная кислота, этилена диамин тетра уксусной кислоты (ЭДТА) работает буфер (ТЭ). Как элементы управления, electrophorese эквивалентное количество шаблона ДНК, которые не были усилены ПЦР и Алиготе лестница ДНК ссылку, которая содержит маркер полосы больше и меньше, чем ожидаемый размер продукта PCR.
7. После электрофореза на 120 V 40 мин, опускайте геля в воде, содержащей 0,5 мкг/мл ethidium бромид и трясти за 30 мин при комнатной температуре. Подтвердить полнометражного шаблон были усилены путем мутагенных грунтовки как увеличение в интенсивности флуоресценции бромид относительной ethidium усиливается группы, по сравнению с шаблон группы управления под УФ (302 Нм).
   1. Если не усилением очевидным, повторите ПЦР после корректировки отжига температуру с шагом 0,5 ° C между 53-56 ° C температура в.
8. После подтверждения амплификации шаблон мутагенных праймеры, рассматривать оставшиеся ~ 25 мкл реакционной смеси ПЦР с ДПНИ энзима ограничения переваривать метилированной шаблон ДНК. Используйте ДПНИ на 0.5 мкл (10 единиц) на ПЦР 25 мкл реакционной смеси и конечная концентрация 1 × ДПНИ реакции буфера. Инкубируйте 2,5 ч при 37 ° C.
9. После переваривания шаблон, добавьте ~ 5-10 мкл переваривается смеси до 100 мкл тепла шок сведущие клетки DH5α Esherichia coli в пробки microcentrifuge 1,75 мл. Инкубировать клетки ДНК смесь на льду на 60 мин
10. Теплового шока клетки ДНК смесь в пробки microcentrifuge при 42 ° C для 45 s на блок сухого тепла. После инкубации в смесь на льду на 3 мин, добавить 900 мкл комнатной температуре Лурия Бертани бульона (LB) в клетки и передачи ячейке подвеска в стерильных 14 мл круглым дном.
11. Инкубировать суспензию клеток при 37 ° C 90 мин с постоянной тряски на 190 об/мин.
12. Впоследствии, передача суспензию клеток обратно в пробки microcentrifuge 1,75 мл и центрифуги на 10000 x g 5 мин при комнатной температуре.
13. После центрифугирования удалите 900 мкл супернатант и Ресуспензируйте бактериальные клетки, нежный дозирование в оставшиеся 100 мкл фунта
14. Передавать полученный концентрированный клеток подвеска на плиту LB-агар, содержащие антибиотик, который является селективным для выражения вектора (то есть 60 мкг/mLKanamycin). Асептически распространение подвеска равномерно на пластину агар и проинкубируйте ~ 16 ч при 37 ° с.
15. Следующий день, прививать единую колонию от пластины в 5 мл жидкого LB, содержащие antiobiotic отбора давления (то есть 60 мкг/мл канамицин). Расти жидкого культуры на ночь при 37 ° C с постоянной тряски на 37 ° C.
16. Изоляции и очистить распространяемый плазмида из клеток кишечной палочки, использование коммерчески доступных комплект на основе процедуры щелочного литического ⁴⁵.
17. Подтверждают мутации интерес присутствующих и в рамках надлежащего чтения путем sequencing Сэнгер ДНК плазмиды ⁴⁶.

2. Равномерное ¹⁵ N-меченых белков в BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Примечание: различные рекомбинантных белков требуются различные выражения условий. Ниже приводится оптимизированная процедура выражение человеческого белка STIM1 EFSAM.

1. Преобразования вектора выражения, укрывательство Cys мутации (то есть питомец 28a-EFSAM) в BL21 ΔE3 кодон (+) теплового шока сведущие клетки и пластины на плиты LB-агара, содержащие антибиотик отбора давления, как описано в шагах 1.9-1.14) с После изменения: непосредственно пластина 150 мкл Алиготе из ~ 1000 мкл суспензии всего клеток на пластину LB-агар без необходимости концентрации клеток в пробки microcentrifuge центрифугированием.
2. Следующий день, асептически перенесите единую колонию в 200 мл колбу Эрленмейера, содержащие 20 мл LB дополнена соответствующим антибиотиком (то есть 60 мкг/мл канамицин для ПЭТ 28a-EFSAM). Расти этот жидкий закваски на ночь (т.е. ~ 16 h) при 37 ° C с постоянной тряски на ~ 190 об/мин.
3. В тот же день как шаг 2,2, подготовить M9 средних для ¹⁵ N-меченых белков путем автоклавирования 1 Л M9 буфера солей (т.е. 42 мм Na ₂ HPO ₄, 22 мм х ₂ PO ₄, 8,6 мм NaCl, рН 7,4) в колбу Эрленмейера 4 Л. После прохладной, фильтр смесь 20% (w/v) D-глюкоза, CaCl 1 M ₂, 1М тиамина, 1М MgSO ₄, биотин 1 мг/мл и 0,2 г/мл ¹⁵ N-NH ₄ Cl через фильтр 0.2 мкм стерильным шприцем в раствор стерильный M9 1 Л соли так что Окончательный концентрации этих компонентов, 0,2% (w/v) D-глюкоза, 100 мкм CaCl ₂, 50 мкм тиамина, 1 мм MgSO ₄, 1 мкг/мл биотина и 1 мг/мл ¹⁵ N-NH ₄ Cl.
4. Следующий день, асептически перевести 20 мл на ночь жидкого закваски в 50 мл стерильного Конические трубки и центрифуги на 2400 × g за 15 мин до Пелле клетки.
5. После декантирующие LB среднего, Ресуспензируйте результирующий Пелле клеток в 10 мл M9 минимальный средний и передача смеси ресуспензированы гранулы на 1 Л M9 минимальный средний с антибиотиками (то есть 60 мкг/мл канамицин).
6. Растут 1 Л M9 минимальные средства, содержащие бактериальной закваски при 37 ° C и константы ~ 190 об/мин, пожимая до оптической плотности на 600 Нм (OD600) достигает ~0.6 0,8.
7. При достижении specfified OD600 диапазон, добавить 200 мкм изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) чтобы побудить выражение протеина.
8. После добавления ИПТГ, продолжать инкубации клеток для выражения протеина при комнатной температуре с постоянной тряски на ~ 190 об/мин для ~ 16 h (то есть на ночь).
9. Следующий день, урожай бактерий центрифугированием на ~ 10 000 × g, 4 ° C на 30 мин.
10. Сцеживаться LB и передачи Пелле клеток в 50 мл Конические трубки. Хранить Пелле-80 ° c до очищения.

3. Очистки рекомбинантных белков от E. coli.

Примечание: различные рекомбинантных белков требуют различных очистительных процедур. Ниже приведен протокол для 6 & #215; Его меткой EFSAM очистки от включения органов выразили от конструкции ПЭТ 28a.

1. Вручную гомогенизировать Пелле замороженные бактериальных клеток в гуанидина 6 M-HCl, 20 мм трис-HCl (рН 8) и β-меркаптоэтанол 5 мм с помощью пипетки передачи моторизованных 10 мл. Добавить примерно 40 мл гуанидина HCl 5 мл сырой камере гранул для этого шага.
2. Следующие 90 мин инкубации при комнатной температуре с постоянным вращением в печь гибридизации, центрифуга смеси на ~ 15000 × g, 8 ° C в течение 40 мин для отделения нерастворимых ячейки мусор (то есть гранулы) от растворимого белка смесь (т.е. супернатант).
3. Добавить 750 мкл на 50% (v/v) Ni ^{2 +}-шарик навозной жижи осветленный lysate и инкубировать еще 90 мин при комнатной температуре с инверсии в печь гибридизации Нитрилотриуксусная кислота агарозы и.
4. Впоследствии, захватить его меткой белок 6 × привязан к Ni ^{2 +}, собирая агарозы бусины в столбце очистки белков потока гравитации. Разрешить lysate течь через колонку полностью до перехода к шагу 3.5.
5. Мыть собранных бусины три раза с 10 мл 6 M мочевины, 20 мм трис-HCl pH 8 и 5 мм β-меркаптоэтанол. Убедитесь, что весь 10 мл проходит через колонку перед каждой последующей 10 мл Вашингтон
6. Элюировать белков в серии 2 мл фракций с использованием 6 M мочевины, 20 мм трис-HCl рН 8, имидазола 300 мм и 5 мм β-меркаптоэтанол с 90 s время инкубации между фракциями. Убедитесь, что весь 2 мл проходит через колонку перед каждой последующей элюции шаг.
7. На данном этапе, подтвердить в eluted фракций по Кумасси синим окрашенных натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) с помощью метода Лэмли ⁴⁷ присутствует протеина интереса. Оценить размер протеина, количество и чистоты сравнения против стандартной молекулярный вес маркер полосы, которые оба меньше и больше чем ожидаемый молекулярный вес протеина интереса.
8. Бассейн eluted белковых фракций в диализе мембрана с 3500 да молекулярной массой отсечки и инкубировать в 1 Л складывая буфера (20 мм трис, 300 мм NaCl, 1 DTT, 5 мм ₂ CaCl, рН 8) при 4 ° C на ночь в то время как буфер перемешивают, magneti мешалка с.
9. После ~ 16 h складывая времени добавьте ~ 1 U тромбина на мг белка прямо в мешок диализа и Инкубируйте на 4 ° C для дополнительных ~ 24 h.
10. Проверить степень 6 × расщепление его тег, Окрашивание Кумасси синим ~ 15 мкл белка аликвоты взяты из мешка диализа, до и после инкубации с тромбин, electrophoresed на денатурации полиакриламидных гелей (SDS-PAGE) с помощью метод Лэмли ⁴⁷. ~ 2 кДа сдвиг в миграции наблюдается соответствующее молекулярная масса рассеченного 6 × его тег, перейдите к шагу 3.11; Если часть останков непереваренные белки, обнаруживаемых Окрашивание Кумасси синим, добавить ~0.2 U тромбина на мг белка прямо в мешок диализа и Инкубируйте на 4 ° C для дополнительных ~ 24 h.
11. Использование размер исключение или ионообменной хроматографии для дальнейшей очистки белков. Для анион обмен хроматографии EFSAM, удалить раствор белка из диализа мешок и концентрата ~ десятикратного с использованием ультрафильтрационных центробежные концентратор с 10000 да молекулярной массой отсечки. Впоследствии, повторно разбавить раствор ~ кратной NaCl свободного буфера (20 мм трис, 5 мм ₂ CaCl, 1 DTT, рН 8).
12. Сбалансировать кусочки анион обменной колонны с 10 столбцов томов бесплатно NaCl буфера, описанные в шаге 3.11. Сбалансировать с помощью буфера, загружается в шприц luer-lock, содержащие без воздушных пузырей, нажав решение через колонку прикапывают и избегая давления шприц, которые вызывают устойчивый потоки решения выхода из столбца. Используйте сильный анионит (например высокоструктурированные агарозы с функциональными группами четвертичного аммония).
13. Загрузить белка раствор разбавляют в NaCl бесплатная буфер (шаг 3.11) на столбце, как описано в шаге 3.12.
14. Элюировать белков в градиенте [т.е. 0 - 60% (v/v)] увеличения NaCl буфера (20 мм трис, 1 M NaCl, 5 мм ₂ CaCl, 1 DTT, рН 8) с использованием системы двух насос быстро белок жидкостной хроматографии (ПСОК). Установите систему ПСОК для сбора ~1-1.5 мл фракций и контролировать профиль элюции белка, с помощью поглощения УФ 280 Нм и расход 0,5 мл/мин
15. Идентифицировать элюции пики и фракций, содержащих протеин интереса а также чистоту белка путем Кумасси синим окрашенных SDS-PAGE гели, с помощью метода Лэмли ⁴⁷.
16. Бассейн дроби показаны > 95% (то есть берется как фракций, которые показывают только один белок группы на окрашенных гелей Кумасси синий) в мешок диализа и обмена в экспериментальной буфер интерес методом диализа, как описано в шаге 3.8.

4. Химическая привязанность к белков методом диализа Глюкоза-5-МТС.

1. подготовить в 55 мм N-(β-D-glucopyranosyl)-n '-[2-methanethiosulfonyl) этил] мочевины (Глюкоза-5-МТС), растворяя 10 мг комплекса в 500 мкл, 100% (v/v) ДМСО. Храните неиспользованные глюкозы-5-МТС солюбилизирован в ДМСО в -20 ° с.
Буфер
2. подготовить образец протеина для модификации dialyzing 1,5 мл ~ 60 мкм белка в 1 Л модификации состоят из MOPS 20 мм, 150 мм NaCl, 5 мм CaCl ₂ и 0,1 мм TCEP, рН 8.3. Используйте отсечки молекулярный вес мембраны диализа, который меньше, чем размер протеина вносятся изменения (например, использовать 3500 да отсечки для EFSAM да ~ 17500).
3. После 24 ч при температуре 4 ° C, передача образец из мешка диализа в пробки microcentrifuge. Добавить солюбилизирован ДМСО глюкозы-5-МТС в конечной концентрации 2 мм.
4. Инкубации образца в темноте за 1 ч при комнатной температуре. Период инкубации 1 h, mix решение нежные касания трубку каждые 10 мин
5. Впоследствии, повторно обмен белков в окончательной экспериментальной буфер, содержащий не восстанавливающего агента методом диализа при температуре 4 ° C, как описано в шаге 4.2 или центробежные ультрафильтрацией. Для ультрафильтрации процедуры, концентрат для образца протеина мл ~1.5 < 0,5 мл и впоследствии разбавляют в же концентратор с экспериментальной буфера. Повторите этот шаг концентрации разбавления еще два раза, так что общий обмен минимум 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. Для EFSAM, используйте 20 мм трис, 150 мм NaCl, 5 мм ₂ CaCl, pH 7.5 как экспериментальный буфера.
6. Подготовки образца для масс-спектрометрии электроспрей ионизации диализа или ультрафильтрации exchange, как описано в шагах, 4.2 и 4.5, соответственно, в бикарбонат аммония 25 мм или 25 мм аммония ацетат. Если с помощью диализа, убедитесь, что вы обмена по крайней мере три раза чтобы удалить любые остаточные соли NaCl и CaCl ₂.
7. Определения точной массы (т.е. ± 1 Да) протеина интереса, используя электроспрей ионизации массового спектрометрирования ^{48 , 49}. Ожидать каждый ковалентных глюкозы дополнение к Cys тиоловых через methanethiosulfonate химические для добавления белка 281.3 да массы (т.е. Добавить 360.4 Да глюкозы-5-МТС и 79.1 Да для CH ₃ поэтому оставляя ₂ группы во время ковалентных вложение).

5. Решение ЯМР оценки modifмышсы эффективности и структурной возмущений.

1. Обеспечить концентрацию измененный белок > 100 мкм после вложения глюкозы и окончательный буфера обмена. Для EFSAM, оценить концентрацию протеина используя коэффициент вымирания УФ на 280 Нм 1.54 ¹ cm ^– (мг мл ^{– 1}).
2. Добавка белка решение с 60 мкм 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic кислоты (DSS) для калибровки опору и пульс и 10% (v/v) D ₂ O сигнал блокировки. Для высокий сигнал шум 600 мкл выборок в трубы соответствуют частоте 5 мм ЯМР, вставляется в минимум 600 МГц спектрометр с тройной резонанс HCN криогенных зонда.
3. Собирать спектры N HSQC стандарт ¹ H - ¹⁵ как ⁵¹ ранее подробные ^{50 ,} при температуре, ¹ H и ¹⁵ N развертки ширины, переходных и приращения настройки подходят для конкретной выборки. Для EFSAM спектры, использование 20 ° C, 256 ¹ H транзиентов, 64 измерения с шагом ¹⁵ N и ¹ H и ¹⁵ N развертки ширины равным 8000 и 1800 Гц, соответственно.
4. После приобретения гликозилированного спектра белков, добавить Дитиотреитол (DTT) в образце ЯМР из запаса 1 М до конечной концентрации 15 мм. DTT удаляет части молекулы глюкозы из белка, сокращения дисульфида опосредованной вложения.
5. Приобрести второй ¹ H - ¹⁵ N HSQC в этих условиях сокращение/неизмененной, обеспечивая спектр ссылку оценить изменения эффективности и структурной возмущения, вызванные глюкозы вложение.
6. Процесс ЯМР данные с помощью NMRPipe как ранее подробно ⁵². Убедитесь, что обработка минимально включает преобразование данных, постепенное, растворителей подавления, Фурье и первоначальной визуализации спектров.
7. Оценки изменения эффективности путем измерения Амида пика интенсивности и химический сдвиг ценностей в изменен и снижение спектры, используя плагин NEASY на Кара- ⁵³. Обеспечить, чтобы оценить интенсивность пик Cys Амида глюкозы придает и снижение спектров. Если Cys Амида нельзя надежно расположен в обоих спектров, используйте интенсивности остатков рядом Cys как индикация.
8. Расчет эффективности как интенсивность Амида Cys изменение спектра деленное на интенсивность Амида Cys снижение (т.е. Лечение DTT) спектра, умноженное на 100:
   , где я _M интенсивность Амида в КМС изменение спектра и я _R является интенсивность Амида в спектре Cys снижение. Кроме того, оценки средней эффективности нескольких Амида вершины:
   , где эффективность _i-отдельно определяется эффективность рассчитывается для каждого остатков, i и n-общее количество отходов, используемых в расчетах.
9. Вычисления возмущений (CSP) химический сдвиг от химический сдвиг различия между двумя спектры в ¹⁵ N и ¹ H размеры каждого пика и нормализации для больших ¹⁵ N химический сдвиг диапазон с помощью следующим уравнением:
   , где ΔH — это изменение ppm в измерении Протон и ΔN ppm изменения в измерении азота.

Первый шаг этого подхода требует мутагенеза кандидат гликозилирования остатки Cys остатков, которые могут быть изменяемые с помощью EFSAM глюкозы-5-МТС в имеет не эндогенного остатки Cys, поэтому никакие специальные соображения должны быть сделаны до мутагенез. Однако родной остатки Cys должны быть мутировал немодифицируемые остатков перед выполнением описанных химии. Для минимально машинной структуре, мы предлагаем, выполняя выравнивание глобальной последовательности протеина интереса, и определения того, какие другие остатки найдены наиболее часто на эндогенных Cys условия. Мутация Cys в этих других остатков, которые происходят естественно в других организмов может иметь минимальное воздействие на структуры белков. Если эндогенного остатки Cys строго экономить, мы предлагаем, мутирует в Ser, который наиболее структурно подобен КМС. На рисунке 1 показана типичная гель PCR мутагенеза, оценки успеха реакции PCR, с усилителем образца ДНК, демонстрируя многократное большей интенсивностью, чем управления количество ДНК ПЭТ 28a unamplified шаблон, который был использован для ПЦР. Следующие шаги включают шаблон ДНК пищеварение и превращение в E. coli для ремонта плазмиды. После распространения плазмида в жидком культуре, плазмида изоляции и подтверждение mutation(s) путем sequencing мутировавших вектор может использоваться для выражения протеина. Рисунок 2A показывает типичный элюции профиль EFSAM из столбца обмен анион относительно увеличения концентрации NaCl. Рисунок 2B показывает чистоту EFSAM на Кумасси синий витражные Гели SDS-PAGE.

После приобретения чистый белок, ряд шагов диализа используется для присоединения части молекулы глюкозы через МТС реакции с бесплатным тиоловых. На рисунке 3A показывает изображение типичной установки небольшой белок громкости запечатаны в диализе мембраны, мембраны клипы и содержащихся в большой стакан емкостью 1 Л, содержащие буфер интерес. Первоначальная проверка успешной модификации могут выполняться по масс-спектрометрии. Рисунок 3B показывает представитель электроспрей массовых спектр EFSAM, изменения в одной тиоловых Cys. После создания протокола для определенного белка, изменения эффективности и структурной возмущения могут оцениваться из одного равномерно 15N-меченых образца. 1H -15N-HSQC спектра приобретается до и после добавления восстанавливающего агента DTT (рис. 4A). Расчеты эффективности изменений может производиться через сравнение интенсивностей пик Амида в модифицированных и снижение спектры как подробно указано в протокол шаг 5,8 (рис. 4В). Наконец, когда химический сдвиг назначений известны белок, ППО, которые коррелируют с структурные изменения может быть рассчитана как описано в шаге 5.9 (рис. 4 c).

Рисунок 1: Геля агарозы дна показаны усилители проверить шаблон вектора с мутагенными праймерами.
Изображение показывает геля агарозы 1,0% (w/v) с ДНК маркер (M), вектор управления (VC) и ПЦР усиливается шаблон (ПЦР). ДНК был отделены электрофорезом на 120 V 45 минут в 0,5 x TAE буфера. В общей сложности 0,5 нг VC была загружена, эквивалентное количество шаблон загружается в ПЦР Лейн. Гель был окрашенных с помощью бромид ethidium (~0.5 мкг/мл) за 20 мин до визуализации под УФ светом (302 Нм). Гель показывает высокий уровень амплифицированного ДНК недалеко от ожидаемого размера вектора (черная стрелка). Второй группы в полосу PCR, между 1000 и 1500 bp маркер полосы вероятно представляет собой специально усиленный продукт PCR. Уровень интенсивности амплифицированного ДНК должны быть выше, чем уровень интенсивности VC считаться успешными. Несколько других красителей ДНК может использоваться как менее мутагенным, безопаснее альтернативы ethidium бромид окрашивание (см., например, 57). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Типичный хроматографического очищения и чистоты Проверьте для EF-Сэм STIM1.
(A) анион обмен хроматографии элюции профиль EF-Сэм STIM1. После ручной привязки EF-Сэм в столбце обмен анион (Q FF) на базовых pH и низкой концентрации NaCl с помощью шприца и AKTA ПСОК (GE Healthcare) используется для элюировать белка с градиентом NaCl. Элюирующий контролируется AKTA с помощью УФ 280 Нм сигнала через 0-60% (v/v) градиента 1 M NaCl. (B) Кумасси синим окрашенных геля SDS-PAGE элюции фракций от (A). Денатурируя гель белка показывает, что EF-Сэм elutes в двух крупных вершин на ~ 250 мм и ~ 450 мм NaCl. Очистки протокол дает > 95% чистой EF-Сэм подтверждается отсутствие любых загрязнений ремешка, показывая вверх в Кумасси синим окрашенных гель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Установка диализа и подтверждение в vitro гликозилирования белков.
(A) типичный диализа установки используется для крепления в vitro глюкозы к Cys тиоловых через МТС реактивности. Изображение показывает ~1.5 мл белков, содержащихся в диализе трубки буфера против ~ 1 Л экспериментальной буфера. Важно, что буфер постоянно перемешивают до обеспечения полного обмена. На изображении показана microcentrifuge трубки, обрезается избыток диализа трубок для предотвращения погружения мешка диализа и повреждение вращающегося бара перемешать. (B) электроспрей ионизации массовых спектр модифицированных Asn171Cys EF-Сэм белка. Масс-спектрометрия является удобный и точный подход к оценке ли модификация процедура была успешной. Типичная массового Хроматограмма показано с теоретические и измеренной массы неизмененным и модифицированных Asn171Cys EF-Сэм указано. Большинство из образца массы соответствует макромолекул, который находится в пределах ~1.3 да ожидаемого теоретической массы Asn171Cys глюкозы конъюгированных EF-Сэм. Данные в (B) replotted и изменен из 42. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Решение ЯМР оценки изменения эффективности и структурной возмущений от одного образца ЯМР.
(A) 1 H -15N-HSQC спектрального наложения конъюгированных глюкозы Asn131Cys EFSAM перед (красный crosspeaks) и после (черный crosspeaks) дополнение 15 мм DTT. Оверлей ясно показывает некоторые специфичные для остатков Амида химический сдвиг изменения ориентировочных обе модификации белков и структурной возмущений. Красное поле показано расположение Амид Asn131Cys. (B) Zoomed вид 1H -15N-HSQC региона, содержащие Амид Asn131Cys. Интенсивность Asn131Cys Амид пик в изменение спектра (м) делится на интенсивность в сокращение (неизмененным) спектра (р) для расчета эффективности (как показано). Расчет средней эффективности нескольких осуществляется остатков обеспечивает более точную оценку эффективности, включая смету ошибка. Средняя эффективность показана для Asn131Cys EFSAM, основанный на 5 остатков (то есть 129-133). (C) нормированный химический сдвиг возмущения, вызванные спряжение глюкозы Asn131Cys EFSAM белка. Набор экспериментов HSQC собраны на одном образце до и после дополнения с восстанавливающего агента не только обеспечивает удобный оценку эффективности изменения пиковой интенсивности анализа [показано в пункте (B)], но также предоставляет данные для Оценка структурных изменений, связанных с изменением. Спряжение глюкозы вызывает крупнейший возмущений, локализовано вблизи позиции 131; Однако этот анализ показывает возмущений, которые неожиданные основаны исключительно на последовательность близости, указав значения в этом анализе. Данные (C) являются replotted и изменения от 42. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1. Пример последовательности олигонуклеотида (праймер) для Asn Cys мутагенеза в ПЭТ 28a STIM1 EFSAM построить.

Protein glycosylation is a post-translational modification where sugars are covalently attached to polypeptides primarily through linkages to amino acid side chains. As many as 50% of mammalian proteins are glycosylated ⁵⁴, where the glycosylated proteins can subsequently have a diverse range of effects from altering biomolecular binding affinity, influencing protein folding, altering channel activity, targeting molecules for degradation and cellular trafficking, to name a few (reviewed in³³). The important role of glycosylation in mammalian physiology is evident by the several hundreds of proteins evolved to build the full diversity of mammalian glycan structures ³³. Altered N- and O-glycosylation patterns have been associated with numerous disease states including prostate (increased and decreased), breast (increased and decreased), liver (increased), ovarian (increased), pancreatic (increased) and gastric cancers (increased) ⁵⁵. Furthermore, glycosylation of Tau, huntingtin, α-synuclein has been found to regulate toxicity of these proteins associated with Alzheimer's, Huntington's and Parkinson's diseases ⁵⁶, and a group of congenital disorders of glycosylation have been identified resulting from heritable defects in enzymes which mediate glycosylation ⁵⁴. Thus, understanding the precise biophysical, biochemical and structural effects of glycosylation has the potential to tremendously impact our understanding of protein regulation and function in health and disease.

The ten sugar building blocks which lead to the diversity of glycan structures found in the mammalian glycome include fucose, galactose, glucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucuronic acid, iduronic acid, mannose, sialic acid and xylose ³³. While N-glycosylation invariably links an N-acetylglucosamine sugar directly to the protein, O-glycosylation can result from any of N-acetylgalacotose, N-acetylglucosamine, xylose, fucose, glucose or galactose covalently linked to the polypeptide. To begin to understand how these sugars immediately adjacent to the protein surface affect the biophysical and structural properties, we describe herein an approach to site-selectively attach sugars to Cys residues via the thiols engineered into the protein sequence. Here, the residues that are endogenously glycosylated are replaced by Cys and modified in vitro via a simple chemical approach. In this manner, single and multiple glycosylation sites may be assessed to tease out the contribution of each specific site as well as the cumulative modifications to the folding and stability as well as the overall structure and function of the protein.

Recently, this approach was successfully used with EFSAM to individually and cumulatively assess the role of the Asn131 and Asn171 N-glycosylation sites ⁴². Mutation to Cys and covalent attachment of glucose to the Asn131 or Asn171 sites revealed a decreased Ca²⁺ binding affinity and suppressed stability. When the two sites were simultaneously modified with the glucose attachment, the decreases in binding affinity and stability were potentiated leading to enhanced oligomerization propensity in vitro. Structurally, the approach described herein showed that the Asn131 or Asn171 modifications mutually perturb the core α8 helix located on the SAM domain, immediately adjacent to the EF-hand pair. This structural analysis expounds how glucose modifications on the surface of the protein lead to a converging and potentiated structural change within the EF-hand:SAM interface which ultimately destabilizes the protein and enhances SOCE ⁴².

While the application of this site-selective approach helped shed light on how a monosaccharide close to the surface of EFSAM effects folding, stability and structure, this procedure can easily be modified to attach longer carbohydrates specific to ER, Golgi and PM localization (i.e. glycosylation states of different maturity), provided there is a reliable source for these carbohydrates containing functional groups which can link to thiols such as MTS. MTS is preferable since the thiol modification is reversible using a reducing agent and a reference spectrum can be easily acquired. This approach can also be adapted to link other post-translational moieties to the protein such as lipids. At the same time, there are several limitations to this approach which should be considered. First, the method relies on mutation of glycosylation sites to Cys which may affect structure, stability and folding even in the absence of any glucose modification. Similarly, native Cys residues in the protein must also be mutated to prevent glucose attachment at non-glycosylated sites. Additionally, the addition of Cys residues often promotes inclusion body formation in bacteria due to Cys crosslinking and misfolding, making purification more challenging. Nevertheless, this site-selective Cys-crosslinking approach described herein provides a controlled means to tease out the structural, biochemical and biophysical effects of specific glycosylation sites in experiments which require high levels of homogeneous protein. The effects of non-native Cys residues on the structure, stability and folding can be simply ascertained in the absence of any modifications by comparison to wild-type protein attributes ⁴². Taken together with functional data obtained in eukaryotic cells which express modification-blocking mutant versions of the protein (e.g. Asn-to-Ala), the presently described approach will yield new insights into the structural mechanisms of protein regulation by post-translational modifications.