Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методы визуализации внутриклеточного рН линии фолликула стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56316

⸱

26 сентября 2017 г.

 ,  , 
1Departments of Anatomy and OB/GYN-RS, University of California, San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

Мы предоставляем протокол для визуализации внутриклеточного рН линии эпителиальных стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы . Мы описываем методы для создания трансгенных мух, выражая биосенсор рН, mCherry::pHluorin, изображение биосенсора с использованием количественных флуоресценции изображений, создания стандартных кривых и преобразовать значения интенсивности флуоресценции в значениях рН.

Аннотация

Изменения в внутриклеточного рН (фи) играют важную роль в регуляции многих клеточных функций, в том числе метаболизма, пролиферации и дифференцировки. Как правило фи динамика определяются в культивируемых клеток, которые поддаются измерения и экспериментально манипулирования фи. Однако недавнее развитие новых инструментов и методологий, стало возможным для изучения динамики фи в пределах нетронутыми, живой ткани. Для исследования дрозофилы , важным событием стало поколение трансгенные линии, перевозящих биосенсор фи, mCherry::pHluorin. Здесь мы описываем протокол, который мы обычно используют для визуализации живой Drosophila ovarioles для измерения фи в линии эпителия фолликула стволовых клеток (FSC) в mCherry::pHluorin трансгенных дикого типа линий; Однако описанные здесь методы могут быть легко адаптированы для других тканей, включая крыло диски и глаз эпителия. Мы описываем методы для выражения mCherry::pHluorin в линии FSC, поддержания тканей яичника во время живых изображений и приобретения и анализ изображений для получения значений фи.

Введение

Недавние исследования показали определенную роль для изменения в фи в клеточной дифференциации и Дисплазия в естественных условиях1,2. Эти исследования показали, что что фи удивительно последовательна в клетках того же типа на той же стадии дифференцировки, но что меняется как клетки переход от одной стадии к другой. В некоторых случаях блокировка изменения в фи частично разрушает дифференциации, предполагая, что изменения в фи является не только следствием изменения в ячейке судьба, но вместо этого помогает для содействия изменениям в судьбе ячейки, возможно, путем воздействия на рН чувствительных регулирования белки или химические реакции, необходимые для дифференциации. Будущие исследования имеют потенциал, чтобы выявить больше проницательность в много различных ролей фи динамика в естественных условиях. Однако одна из задач изучения pHi во время дифференциация в естественных условиях является получение точных измерений Пхи-Пхи. В отличие от других функций дифференциации, такие как изменения в клеточной морфологии и экспрессии генов фи является лабильным химические свойства ячейки, не сохраняется в клетках, которые были исправлены и permeabilized с стандартными методами. Кроме того фи не может быть стабильным в клетках, которые подчеркнули или умирают в результате экспериментальных манипуляций. Таким образом важно сохранить клетки жив и здоров, как возможно, когда измерения фи. Несколько жизненно важных красителей доступны, что работает хорошо для измерения фи клеток в культуре3, но во многих случаях они подходят не для в vivo исследований потому, что они не проникать в ткани, глубоко или равномерно достаточно, чтобы обеспечить точность измерений .

Чтобы обойти проблемы проникновения красителя бедных, мы и другие использовали генетически закодированный зонд, mCherry::pHluorin4,5,6,7, которое может быть выражено непосредственно в ячейке типы образов в живых тканей и интерес. pHluorin представляет собой вариант GFP с выше pKa (~ 7.0 против ~ 4.0), более легко складывается при более высоких значениях рН; Таким образом общая флуоресценции интенсивности испускаемого от населения pHluorin молекул в ячейке возрастает с увеличением фи8. Важно отметить, что флуоресценции линейной в нормальном цитозольной диапазоне значений фи. В отличие от флуоресценции mCherry (pKa ~ 4.5) является нечувствительным к изменениям рН в цитозольной диапазоне. Эти два Репортеры ковалентно связаны вместе, как единый химерных белков, кодируемых одной открытой чтении кадра, поэтому они всегда присутствуют в равных количествах. Таким образом соотношение pHluorin к интенсивности флуоресценции mCherry обеспечивает измерение фи, нормируется зонд концентрации в каждой ячейке. Коэффициенты затем может быть преобразован оценкам фи значений с помощью стандартной кривой, создаваемый путем получения pHluorin mCherry коэффициенты из тканей, которые были достижение равновесного уровня, к известным рН.

Здесь мы описываем методы для использования mCherry::pHluorin для измерения фи линии эпителиальных FSC в яичнике дрозофилы . Это хорошо изученных ткани был использован для моделирования много различных аспектов эпителиальных биологии, например стволовых клеток самообновления и дифференциации9,10,11, коллективные клетки миграции12 , развития и поддержания клеток полярности13,14. Эпителий фолликула производится двумя FSCs, находящиеся у переднего края ткани в структуре, называемой germarium15,16. Эти клетки делятся регулярно во взрослом возрасте самостоятельно обновить и производят потомство, называемые prefollicle клетки (ПФУ), которые можно заново ввести нишу и стать FSC или дифференцироваться в один из трех типов клеток различных фолликул: полярные клетки, клетки стебля, или основные клетки фолликула. Мы показали ранее в wildtype ткани, pHi увеличивает устойчиво на ранних стадиях дифференцировки от Пхи примерно 6,8 в FSCs 7.0 в ПФУ, 7.3 в фолликул клетки2. Блокирование это увеличение RNAi нокдаун повсеместно выраженной натрия/Протон теплообменника, DNhe2, серьезно ухудшает ПФК дифференциации, тогда как увеличивая Сверхэкспрессия DNhe2 фи вызывает мягкая избыток дифференциация фенотип. Эти результаты демонстрируют фи стабильно сохраняется в начале линии FSC и что это может быть экспериментально увеличивается или уменьшается в естественных условиях. Методы, описанные здесь может использоваться для измерения фи в wildtype ткани или различные виды мутантов тканей, включая RNAi нокдаун или гиперэкспрессия с помощью Gal4 интерес, и митотического клонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: измерения фи в линии FSC, мы рассчитать коэффициент интенсивности флуоресценции pHluorin к mCherry в FSCs и ПФУ, клетки фолликула в физиологических условиях и преобразовать соотношения в фи значения с стандартом калибровочные кривые для каждой ячейки введите 7. Во-первых, живые изображения являются эксперименты для измерения интенсивности флуоресценции pHluorin и mCherry в germaria, расчлененный в буфер, содержащий NaHCO 3, которая имитирует физиологических условиях 1 , 7. Далее, стандартные кривые формируются путем измерения интенсивности флуоресценции pHluorin и mCherry в Na +-бесплатно, K + буфер, содержащий ionophore nigericin с учетом двух различных рН, 6.5 и 7.5. При наличии nigericin фи уравновешивает с pH буфера через плазматическую мембрану, вызывая фи соответствовать внеклеточного pH. И наконец, стандартные кривые используются для преобразования pHluorin в mCherry соотношения значений оценкам фи.

1. предварительного: подготовка до измерения фи In Vivo

Примечание: измерения фи в естественных условиях, mCherry::pHluorin трансген должны быть выражены в тип ячейки интереса. Ниже приведены несколько распространенных способов создания трансгенных pHluorin летит в линии FSC. Создание клонов mCherry::pHluorin особенно полезен для выявления FSCs, которые расположены на передней кромке клон FSC. Ткани конкретных mCherry::pHluorin выражение полезен для измерения фи по всей ткани и также более удобен при объединении с выражением RNAi или трансген.

  1. Летит поколения трансгенных pHluorin
    1. mCherry::pHluorin меченых FSC клоны
      1. сделать mCherry::pHluorin FSC клоны, крест бла mCherry::pHluorin 1 акт-Gal4 flipout акций или других акций с Flp/FRT индуцибельной Gal4.
      2. Чтобы сделать heatshock индуцибильный клоны, heatshock взрослых F1s за 2 дня пост eclosion в пустые флаконы для 1 h в ванну воды 37 ° C, четыре раза примерно каждые 12 ч.
      3. Для обеспечения нормального роста и максимальных ставок женских в этот период, сохранять мух, предоставляя свежие дрожжи мокрой (примерно равных частей сухой Бейкер ' дрожжи и воду) ежедневно в течение по крайней мере 6 дней после индукции клон.
    2. Ткани конкретных mCherry::pHluorin выражение
    3. крест бла mCherry::pHluorin 1 к фолликул клеток конкретный драйвер, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Блумингтон ID: 7023).
    4. 3 дня после того, как мухи начать eclosing, собрать и поместить их во флаконах, содержащих мокрой дрожжи, по крайней мере за 24 часа до вскрытия.
  2. Принятия решений
    Примечание: важно подготовить следующие буферы в день эксперимента, потому что концентрации рН и массопереноса в буфере могут меняться со временем.
    1. Подготовить бикарбонат, nigericin и рассечение буферов. Добавьте компоненты в порядке перечисленных в том, чтобы избежать образования осадков (см. таблицу 1, в таблице 2 и таблице 3).

2. Триал: Измерения фи в FSC Lineage

Примечание: рассечение, монтаж и жить изображений шаги для буфера бикарбоната и два условия nigericin буфер может необходимо выполнить дважды: один раз, чтобы определить Микроскоп настройки и во второй раз для сбора экспериментальных данных. Смотрите раздел 2.2 ниже для получения дополнительной информации.

  1. Рассечение и монтажа
    Примечание: материалы, необходимые для выполнения этого шага обратитесь к рис. 1 и Таблица материалов. Для 3D печатного монтажа камер 3D принтер файлы предоставляются как дополнительный файл 1 и 2 дополнительных файлов.
    1. Рассечение:
      1. Подготовка монтажа камер, применяя тонким слоем смазки вакуумного на плоской стороне 3D печати монтажа камеры. Место этой стороны на coverslip 22 x 40 мм для уплотнения coverslip для монтажа камеры.
    2. Вскрыть яичников со женский взрослых мух в 500 мкл рассечение буферу (бикарбонат или nigericin, Таблица 3)
      1. анестезировать 3-4 мух с помощью газа CO 2 и передачи летит на лету площадку, увлажненную с CO 2 газ.
      2. Забрать наркотизированных летать с щипцами и место в СМИ диссекции.
      3. Щепотка грудной клетки летать с одной forcep, а дергая на кончике его живота до тех пор, пока ее яичники подвергаются.
      4. После отсоединения яичников от других органов, дразнить друг от друга с помощью иглы для шприцов 22 1/2 ovarioles. Тщательно отдельных мышц оболочка из яичников и отдельных индивидуальных ovarioles из кластера ovarioles. Эффективной техникой изолировать мышечной оболочки является использование одной иглой шприца для хранения кластера ovarioles на месте на своей передней конец и погладить вниз по длине одного ovarioles.
      5. Инкубировать расчлененных яичников в средствах массовой информации рассечение ровно 10 минут прежде чем приступить к этапу установки так, что есть достаточно времени для фи клеток в полной мере сбалансировать с pH nigericin рассечение СМИ.
        Примечание: Убедитесь, что мышечная оболочка удаляется из ovarioles. Мышечная оболочка может смягчить флуоресценции сигнал, что делает его трудно определить отдельные ячейки, используя Concanavilin-A и может вызвать ovarioles переместить спонтанно во время живых изображений.
    3. Установка
      1. место небольшое падение рассечение СМИ на стекло coverslip в камере монтажа.
      2. Передачи отделены с помощью щипцов ovarioles.
      3. Отдельные поздней стадии яйца камеры от germaria, связанные с более ранней стадии яйца камерами и попробуйте обеспечить что расчлененные germaria размещаются в центре падение СМИ рассечение.
      4. Добавить две небольшие капли Лак в противоположных сторонах раунд 12-мм coverslip и дайте ему высохнуть около 10 на воздухе s.
        5. Coverslip
      5. место раунд на падение рассечение сред, содержащих отделены germaria такие что ту сторону с лак обращена вниз и контакты СМИ рассечение. Нажмите вниз на частях края с Лак для выравнивания и защиты germaria в положении. Мы рекомендуем использовать старые лак, потому что она размазывает меньше, на поверхности coverslip, как оно закреплено на месте.
      6. Заполнить монтажной камере с дополнительные рассечение СМИ. Состояния конкретных буфера, не содержащий краситель конканавалина-A может использоваться для заполнения камеры.
        Примечание: Общее время, затраченное рассечения и крепления не должно превышать 15 мин. Это имеет важное значение для сведения к минимуму последствий повреждения тканей и клеточной смерти.
  2. Живых изображений:
    Примечание: В этот шаг, сначала собрать изображения от состояния бикарбоната и два nigericin условия для определения надлежащего Микроскоп параметры; настроить параметры микроскопа при необходимости, а затем собирать образы для экспериментальных данных. Используйте Конфокальный микроскоп способен изображений в 3 канала: GFP (475 возбуждения/509 выбросов), mCherry (575 выбросов возбуждения/610) и far-red (633 выбросов возбуждения/647).
    Примечание: Установить параметры микроскопа: интенсивности пикселей изображения, собранные будет количественно определить оценки фи, поэтому важно, что значения интенсивности сигнала в каждом наборе изображений является слишком низким, ни насыщенных. Спектр света, которые могут быть захвачены в изображении определяется битовую глубину изображения. Во многих случаях 8-битные изображения создаются по умолчанию, но мы рекомендуем приобретать данные как 16-битные изображения, которые имеют более широкий динамический диапазон. Важно, чтобы убедиться, что перекрестных помех между флуоресцентные каналы сводится к минимуму, поэтому параметры следует скорректировать таким образом, что спектр излучения собранные от каждого Флюорофор не перекрываются. Эти параметры тестирования, взять пример изображения с помощью спектр возбуждения, характерный для GFP и собирать в спектре излучения для mCherry и наоборот. Если параметры были скорректированы надлежащим образом, в любом случае должно быть не сигнал. Установите параметры микроскоп (то есть, параметры напряжения на лазерное сканирование конфокальный, лазерной энергии и точечным размер), так что пиксель интенсивности сигнала во всех наборах три изображения находятся в динамический диапазон файла изображения. Для всех наших экспериментов мы использовали белый свет лазерного сканирования Конфокальный микроскоп с 40 x цель приобрести 16-битные изображения в 1024 × 1024 формате, в то время как мы оптимизировали усиления напряжения для каждого эксперимента, при необходимости. Например, в одном эксперименте, мы устанавливаем усиление напряжения для GFP, mCherry и far-red как 37,8%, 72,9% и 260%, соответственно.
    1. Ovarioles в nigericin рассечение буфера при pH 6,5 изображение и настроить параметры таким образом, чтобы интенсивность пикселя изображений pHluorin и mCherry являются низкими, но не ниже пределов обнаружения камеры.
    2. Изображение другой набор из ovarioles в nigericin рассечение буфера при pH 7.5 и настроить параметры таким образом, чтобы интенсивность пикселя изображений pHluorin и mCherry высокий, но не насыщенными.
    3. Изображений яичников в бикарбонат рассечение буфер и убедитесь, что интенсивность пикселя изображений pHluorin и mCherry не насыщен выбранной настройки. Если точки насыщения, настроить параметры при необходимости.
      Примечание: Микроскоп, параметры могут различаться на основании точного Микроскоп установки используется и должны быть оптимизированы для каждого эксперимента. После того, как Микроскоп настройки, не изменяйте их на оставшуюся часть эксперимента. Параметры должны соответствовать управления и экспериментальных условиях. В наших экспериментах первоначальный фи мы созданы 2 и 3 точки nigericin калибровочных кривых и нашел никакого существенного различия между вычисляемые фи, с использованием либо метода. Однако в целом, добавление больше очков в калибровочной кривой будет ожидать для повышения точности. Поэтому, мы рекомендуем создание кривых с разным количеством точек, чтобы определить, сколько необходимо для данного набора экспериментальных условий.
  3. Сбора данных:
    1. выполнения диссекции, монтаж и изображений образцов в условиях буфера бикарбоната и nigericin. После рассечения и монтажа, максимальное время, затраченное изображений один комплект образцов не должно превышать 45 мин для обеспечения измерений интенсивности флуоресценции в живой, здоровой ткани.
    2. Для каждого условия, приобрести изображений для по крайней мере 5 germaria.

3. После суда: Анализ изображений

  1. мера интенсивности флуоресценции FSCs, ПФУ, и клетки фолликула
    1. фон вычитание:
      1. Открыть необработанных изображений в Фиджи с каждым каналом в отдельном окне ( Рисунок 4 c).
      2. Использовать инструмент прямоугольник для рисования региона интерес (ROI) в окне канала pHluorin в части изображения без сигнала.
      3. Необязательный шаг: установить нижний предел порога, так что пикселей с значения интенсивности ниже фон исключены и установить верхний предел порога максимума. Когда порог устанавливается таким образом, области изображения без сигнала в основном синий и сигнала отчетливо видна ( рис. 4A).
      4. Мера средней интенсивности флуоресценции в ROI. Если на шаге 3 был установлен порог, не забудьте проверить " предел порога " поле в диалоговом окне задать измерения.
      5. Вычесть измеренных фон интенсивности от каждого канала и фрагмент изображения, используя функцию вычитания, найденных в процессе → математике меню.
      6. 3.1.1.2-6 повторить шаги для окна канала mCherry Кроме того, в шаге 3.1.1.2, вместо рисования новый прямоугольник с инструмент прямоугольник, используйте функцию восстановления выбора, в Edit → выбора меню, чтобы добавить прямоугольник с тем же размеры и положение на изображении.
    2. Определить FSCs, ПФУ и клетки фолликула:
      1. определить FSCs, ПФУ и клетки фолликула, морфология и местоположение с помощью окрашивания конканавалина А найти границы ячейки ( рис. 2).
      2. FSCs являются тонкие треугольные клетки, расположенные на краю germarium на границе региона 2a/2b. Если mCherry::pHluorin выражается в клон FSC, FSC, также могут быть определены как передней большинстве ячейки клонов.
      3. ПФУ являются неправильной формы клетки в регионе 2b, непосредственно прилегающих к и вниз по течению от FSCs.
      4. Клетки фолликула являются квадратные или столбчатых клеток, которые окружают зародышевых клеток ганглия в регионе 3.
    3. Получения коэффициенты интенсивности флуоресценции
      1. выбрать один или несколько фрагментов, в которых клетки интерес имеет высокие интенсивности флуоресценции в mCherry канале и убедитесь, что окрашивание конканавалина-A, видели в far-red канале, в ФОЦ нас в пределах выделенного фрагмента.
      2. Нарисовать ROI вокруг каждого FSC и мера означает флуоресценции интенсивность pHluorin и mCherry во всех ломтиков выбранной для измерений.
      3. Разделите среднее флуоресценции интенсивность pHluorin канала, интенсивность средняя флуоресценции mCherry канала рассчитать коэффициент pHluorin mCherry флуоресцирования.
  2. Производные фи значения и генерировать pseudocolored образы
    1. производные фи значения
      1. во всех случаях, линейной регрессии кривая должны создаваться с использованием яичников от мух же генотипа для обеих экспериментальных и контроля условий. Создание кривой линейной регрессии для каждого типа клеток, используя данные из буфера условий двух nigericin ( рис. 3). В Excel это может быть сделано путем добавления линейного тренда и отображения данных на диаграмме. Поочередно, см:
      2. использования, наклон и y пересечение линейной регрессии кривая рассчитывается от условий nigericin и уравнения линии (y = mx + b) для преобразования pHluorin в mCherry соотношение значения рассчитываются от образцов в бикарбонат условие для значения рН. В этом уравнении, заменить форма склона (y пересечение) b, поставьте значение коэффициента в для x и решить для ю.
    2. Создания pseudocolored изображения, отражающие соотношение значения в Фиджи.
      1. Следуйте процедуре выше для вычитание фона (шаг 3.1.1 и рис. 4).
      2. Делят pHluorin канал из mCherry канала, используя функцию калькулятор изображение, в меню процесс. Будьте уверены, " создать новое окно " и " 32-бит (float) результат " флажки проверяются оба. Изменить таблицу подстановки (LUT), находится в меню изображения, для теплоизоляционной или LUT выбора. Смотрите Рисунок 4 для других подходящих вариантов.
      3. Диалогового окна Настройка яркости и контрастности (изображение → Настройка → яркость/контрастность), нажмите кнопку " набор " кнопку. Набор минимум отображается значение 0 и Максимальное отображаемое значение в пропорции, которая наилучшим образом захватывает данные, обычно 1.0-2.0 ( рис. 5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы описали процесс измерения фи в эпителий фолликула, который включает несколько этапов. Во-первых яичники разделяются от мух соответствующие генотипа, используя инструменты для рассечения и монтажа (рис. 1). Ovarioles затем отражаются с помощью количественных флуоресцентной микроскопии и образы анализируются, чтобы получить измерения фи. Для каждого изображения типы клеток интерес идентифицируются как описано в разделе 3.1 (рис. 2<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем метод измерения фи клеток в FSC линии в wildtype ткани. Этот протокол разработаны и усовершенствованы за последние пять лет, поскольку мы впервые начали учиться фи в дрозофилы тканей яичника. В это время протокол успешно используется несколько следователей в нашей лаборатории и по крайней мере четыре различных вращающийся диск и лазерные сканирующие микроскопы. Воспроизводимость нашего первоначального наблюдения, что фи увеличивается как клетки в линии FSC дифференцировать от стволовых клеток ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Bryne Ulmschneider за вклад в протокол и Диана Парикмахерская для предложения на рукопись. Эта работа финансировалась национального института здравоохранения грант GM116384 Nystul т.г. и парикмахерская Д.Л.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Fly Stocks
UAS-mCherry::p Hluorin[1]
y1 w*; P{GawB}10930/CyOBloomington Stock Center7023
Act-Gal4 откиднойсток Bloomington Stock Center4409
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
Химикаты для приготовления буфера
NaClSigma AldrichS5886
KClSigma AldrichP-3911
глюкозаMallinckrodt4912
HEPESThermo Fisher ScientificBP310
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63
CaCl2Sigma AldrichC-5080
HCO3Сигма ОлдричS-5761
MgCl2Сигма ОлдричM-9272
NMDG+Сигма ОлдричM-2004
K2HPO4Mallinckrodt7088Использование для получения KHPO4 pH 7,4
KH2PO4 ThermoFisher ScientificBP362Использование для получения KHPO4 pH 7,4
Конканавалин А, Alexa Fluor 647 КонъюгатThermo Fisher ScientificC214210,25 мг/мл разбавление
НигерицинThermo Fisher ScientificN1495
Название<strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
>Инструменты для вскрытия и монтажа
2 Dumont Щипцы из нержавеющей стали (размер 5)Thermo Fisher ScientificNC9473431
2 иглы для шприцев 23-го калибраSigma AldrichZ192457
9-луночная стеклянная анатомическая чашкаThermo Fisher Scientific13-748B
Вакуумная смазкаDow Corning1018817
22 X 40 мМ стеклянные покровные стеклаThermo Fisher Scientific12545C
Круглые стеклянные покровные стекла, диаметр 12 мм, толщина 0,13-0,16 ммTed Pella, Inc.26023
Файлы 3-D монтажной камерыcustom manufactured.stlи .ipt для 3-D принтера включены в качестве дополнительных файлов
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Другое оборудование
pH-метрThermo Fisher Scientific13-620-183AМодель: Accumet AB15
Диссекционный микроскопOlympus Corporation0H11436Модель: SZ2-ST
Конфокальный микроскопLeica BiosystemsSP5 или SP8 лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп с 40-кратным объективом с числовой апертурой 1,3

Ссылки

  1. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
  2. Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  5. Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).
  6. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  7. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
  8. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  9. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).
  10. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
  11. Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
  12. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
  13. St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141 (5), 757-774 (2010).
  14. Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
  15. Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).
  16. Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).
  17. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
  18. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

pHmCherry pHluorinpH
Методы визуализации внутриклеточного рН линии фолликула стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.