Методическая статья

Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

DOI:

10.3791/56319

⸱

23 октября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем легким, быстрым и относительно недорогой метод для генерации ген нарушена Streptococcus mutans штаммов; Эта техника может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичные методы для разяснения функции определенного гена включать сравнительный анализ фенотипических одичал тип деформации и напряжения, в котором было нарушено гена интереса. Конструкцию ДНК гена нарушение, содержащие маркер подходит к антибиотикам ген полезен для поколения ген нарушена штаммов бактерий. Однако обычных строительных методов, которые требуют генов клонирования шаги, включать протоколы сложным и трудоемким. Здесь описан относительно легким, быстрое и эффективное метод срыв целевых генов в Streptococcus mutans . Этот метод использует слияние 2-х ступенчатый полимеразной цепной реакции (ПЦР) для создания разрушение конструкции и электропорации для генетической трансформации. Этот метод не требует ферментативные реакции, за исключением PCR и дополнительно предлагает большую гибкость с точки зрения дизайна разрушение конструкции. Занятость электропорации облегчает подготовку компетентных клеток и улучшает эффективность преобразования. Нынешний метод может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ функции гена обычно включает фенотипические сравнение между одичал тип деформации и напряжения, в котором было нарушено определенного гена интереса. Этот ген нарушение техника была использована для анализа функции гена в широком диапазоне таксонов, от бактерий до млекопитающих. Ген нарушение конструкция необходима для поколения штамма ген нарушена; Эта конструкция дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) состоит из гена маркер антибиотикорезистентности, сливается в верхнем и нижнем течении, окаймляющие регионов целевого гена и включена в геноме через гомологичная рекомбинация. Джин нарушена деформации могут быть изолированы с помощью селективного носителей, содержащих антибиотик. Обычные метод, используемый для строительства ген нарушена штамм требует сложных шагов, таких как амплификация гена целевой полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигирование гена в подходящей плазмиду, пищеварение с ограничением ферменты и religation чтобы вставить маркер антибиотик сопротивление гена. Этот процесс является длительным, принимая несколько дней до нескольких недель, в зависимости от успеха каждого шага. Кроме того дизайн разрушение конструкции зависит энзима ограничения сайтов целевого гена. Для решения этих вопросов, были зарегистрированы на основе ПЦР ДНК сплайсинга методы1,2 для проектирования ген нарушена мутантов сапротрофные discoideum3 и Synechocystis sp. PCC68034 . В настоящем исследовании был разработан метод для создания Джин нарушена стрептококков штамм относительно быстрое, легким и недорогим способом, используя измененный метод на основе ПЦР (обозначено сплавливание 2-шаг ПЦР) для строительства нарушения Конструкция и электропорации для генетической трансформации.

2-шаг-фьюжн, PCR требует геномной ДНК, маркер генов антибиотикорезистентности как шаблон ПЦР и четыре пары надлежащим образом разработаны праймеры олигонуклеотида. На первом шаге (1st ПЦР), 1-КБ вверх по течению фланкируя региона целевого гена, 1-КБ течению фланкируя область целевого гена и Джин антибиотик сопротивление маркер усиливаются методом ПЦР. 5' регионов обратный грунт и вперед грунтовка для усиления вверх и вниз по течению фланговые регионов, соответственно, включают в себя 15 баз дополняет концы гена маркер. 5' регионов прямого и обратного Праймеры для амплификации генов маркер аналогичным образом включают 15 баз в дополнение к нижней части вверх по течению фланкируя региона целевого гена и верхний конец области течению фланкируя целевого гена, соответственно. Таким образом три усиливается фрагменты содержат перекрывающиеся области 30-пар на сайте фьюжн. На втором этапе (2nd ПЦР) ПЦР проводится с вложенными праймеры PCR, с использованием трех фрагментов, усиливается 1st PCR как шаблоны. Дополнительно взаимодополняющих регионах шаблоны связаны друг с другом через 2nd ПЦР. Наконец конструкции для гомологичная рекомбинация вводится одичал тип деформации электропорации. Успешное гена нарушения могут быть проверены с помощью конкретных праймеры PCR. Хотя нарушение конструкция усиливается с помощью высокоточных ДНК-полимеразы, дополнительные ферментативных реакций, таких как перешнуровка дна или ДНК пищеварение, не являются необходимыми для создания конструкции. Кроме того удаленные или консервированные региона на геном может гибко выбираться по конструкции праймера.

В настоящей работе удаление всего кодирвоания gtfC ген, который кодирует glucosyltransferase в Streptococcus mutans, была исполнена продемонстрировать метод срыв быстрое, легко гена в стрептококков видов. Кроме того, gtfB-нарушена штамм был создан в том же порядке. Glucosyltransferases, кодируются как gtfC , так и gtfB способствуют кариесогенных Стоматологическая биопленки развития5,6. Биопленки формирование способности одичал тип деформации (S. mutans WT), gtfC-нарушена штамм (S. mutans ΔgtfC) и gtfB-были оценены нарушается штамм (S. mutans ΔgtfB) для сравнительного анализа фенотипические. Этот протокол расширяет применение двухэтапный метод срыв гена для дополнительных видов и могут быть изменены для исследования функции гена в более широкий спектр таксонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. конструкции праймера

  1. подготовить грунтовки для 2-шаг fusion ПЦР и проверки нарушения ген.
    Примечание: В таблице 1 показаны последовательностей праймера, используемые в настоящем Протоколе. Рисунок 1 показывает схематическое изображение метод ПЦР сплавливание 2-шаг, используемый для создания Streptococcus mutans Δ gtfC.
    1. Дизайн праймеров для замены целевого региона в геноме с спектиномицин сопротивление гена (spc r) 7. Этот протокол заменяет весь регион кодирования gtfC гена с НПЦ р.
    2. Включают в себя 15 баз дополняет верхние и нижние концы spc r на 5 ' регионы вверх назад и вниз вперед грунтовки, соответственно. Аналогичным образом, включают 15 баз в дополнение к нижней части вверх по течению фланкируя регионов gtfC и верхний конец течению фланкируя регионов gtfC на 5 ' регионах НПЦ r-вперед и НПЦ r -обратный грунтовки, соответственно ( рис. 1A).
      Примечание: Последовательности вверх назад, вниз вперед, spc r - вперед и spc r - обратный грунтовки автоматически определяются в зависимости от места инкорпорации разрушение конструкции.
    3. Дизайн вверх вперед и вниз обратный праймеры составляют > 1-КБ, вверх и вниз по течению фланговых районах гена gtfC, соответственно. Установите температуру плавления (m T) вверх-вперед и вниз обратный грунтовки в соответствии с температурой плавления праймеров вверх назад и вниз вперед, соответственно ( рис. 1A).
      Примечание: Обратитесь к следующей формуле для определения T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * нг) - 5, где * N представляет количество грунтовки нуклеотидов с указанным удостоверением (A, T, C или G).
    4. Дизайн вложенные грунтовки (N_up вперед и N_up реверс) для 2-й ПЦР ( рис. 1B).
      Примечание: Хотя внешняя грунтовка пара (вверх вперед и вниз обратный) могут использоваться в качестве грунтовки для 2 nd ПЦР, вложенные грунтовки (N_up вперед и N_up реверс) были разработаны в настоящем Протоколе. Вложенные Праймеры для 2 nd ПЦР, как подробно указано в Представитель результаты часто требуются.
    5. Дизайн праймеров для НПФ r. Праймеры используются для колонии PCR экран для срыва gtfC.
      6. Нарушение
    6. Дизайн праймеров для проверки gtfC.
      Примечание: Продукты PCR, усиленный, используя эти грунты стрэдл границы между gtfC или spc r и вверх или вниз по течению фланговые регионов gtfC. Грунтовка наборы ' gtfC вверх вперед и вверх реверс gtfC ' и ' gtfC вниз вперед и gtfC вниз обратный ' являются специфическими для gtfC, и ' gtfC вверх вперед и spc r 2 -Обратный ' и ' НПЦ r 2-вперед и gtfC вниз обратный ' являются специфическими для НПФ р.

2. Геномная ДНК извлечение из Streptococcus mutans

s UA159
  1. полоска фондовой S. mutan на мозг сердца инфузии (BHI) агар пластину. Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
  2. Подобрать единую колонию с использованием стерилизованные зубочистку и инокуляции в 5 мл бульона BHI. Инкубировать S. mutan s культуры на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
  3. Центрифуг бактериальной клетки культуры 15 мин на 2000 × g. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
  4. Центрифуги для 15 мин на 2000 × g. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл PBS.
  5. Экстракт геномной ДНК из подвески с использованием комплекта извлечения геномной ДНК шарик избиение base согласно инструкции, предоставляемые производителем.
    1. Подвеска передать образец 2.0-мл пробирку, содержащую стеклянные бусины (входит в комплект). 750 мкл раствора лизис (входит в комплект) к суспензии клеток.
    2. Крышка плотно и трубы симметрично в Трубодержатель шарик избиение срыв аппарата. Процесс на максимальной скорости на 5 мин. Центрифуги, избили из бисера образцов за 1 мин в 10 000 × g. передачи супернатант в спин фильтр (входит в комплект) в коллекции 2.0 мл трубки и центрифуги за 1 мин на 7000 × g .
    3. Добавить 1200 мкл ДНК привязки буфер (входит в комплект) для фильтрата. Передавать коллекции 2.0 мл трубки и центрифуги за 1 мин в 10 000 × g. 800 мкл смеси в столбце спин (входит в комплект)
    4. Отменить проточный, добавить 200 мкл предварительно вымыть буфера (входит в комплект) в столбец спин мыть столбца матрицы и центрифуги за 1 мин в 10 000 × g. отклонения потока через, 500 мкл буфера мытья (входит в комплект) к спин столбец для мыть столбца матрицы и центрифуги за 1 мин на 10 000 × г.
    5. Место столбце спина в новой трубки microcentrifuge 1,5 мл и 100 мкл буфера (входит в комплект) к матрице столбца.
    6. Центрифуги для 30 s на 10 000 × g элюировать геномной ДНК. Оценка концентрации ДНК и чистоты путем измерения оптической плотности на 260 Нм и 280 nmusing спектрофотометром и подтвердите, что соотношение 280 /A 260 A больше, чем 1.8.

3. Амплификации PCR

  1. выполнять 1 st ПЦР с помощью геном S. mutan s WT и синтетических spc r ген как шаблоны ПЦР (см. таблицу 1). Усилить регионе вверх по течению фланкируя gtfC гена, регионе течению фланкируя gtfC гена, и spc r гена, с помощью трех наборов грунты, описанные выше ( Рисунок 1A), согласно В таблице 2 и таблице 3.
    Примечание: Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно.
  2. Фракционировать каждый продукт PCR на геле агарозы 1% и акцизных соответствующие полосы, используя резец группы гель.
  3. Очистить каждый усиливается продукт ДНК из гелей с помощью спин столбец - и кремния гель на основе мембранных добыча комплект.
    1. Передачи фрагментов геля для чистой microcentrifuge трубки и смешать с 500 мкл привязки буфера (входит в комплект). Инкубировать смеси при температуре 55 ° C за 15 мин до тех пор, пока полностью растворены ломтиков геля.
    2. Место столбце спин (входит в комплект) в коллекции трубку (входит в комплект), загрузите образец на столбце спин и центрифуги для 30 s на 11 000 × g. Отбросить проточный, добавить 600 мкл буфера мытья (входит в комплект) в столбце спина мыть кремнезема мембраны, и центрифуги для 30 s на 11 000 × г.
    3. Отбросить проточных и центрифуги для 2 мин на 11 000 × г сухой кварцевый мембраны.
    4. Место столбце спина в новой пробки microcentrifuge 1,5 мл, 50 мкл Элюирующий буфер (входит в комплект) и инкубации при комнатной температуре на 2 мин
    5. Центрифуги для 2 мин на 11 000 × g элюировать амплифицированного ДНК. Оценка концентрации ДНК и чистоты путем измерения оптической плотности на 260 Нм и 280 nmusing спектрофотометром и подтвердите, что соотношение 280 /A 260 A больше, чем 1.8.
  4. Выполнять 2 nd ПЦР сплавливания 2-шаг ПЦР, используя три приблизительно эквимолярных фрагменты как шаблоны ПЦР, согласно Таблица 2 < / STЖун > и таблице 3.
    Примечание: Эти фрагменты были усилены и сращивания с помощью вложенных праймеры ' N_up вперед и N_down обратный ' или внешний праймеры ' вверх вперед и вниз обратный ' ( рис. 1B). Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно.
  5. Загрузить одну десятую от реакционной смеси ПЦР (5 мкл) на 0,8% агарозном геле и сравнить размер усиливается группы с размером ожидаемого диапазона для подтверждения поколения соответствующие ампликон ( рис. 1 c).
  6. Сконцентрировать оставшиеся конечный продукт PCR высыпанием этанола без очистки.
    1. Добавить 55 мкл ультра-чистой воды остальные смесь ПЦР для регулировки объема до 100 µL.Add объем одной десятой ацетат натрия 3 М (10 мкл), рН 5.2, следуют 2,5 томов 100% этанола (250 мкл). Смешать и заморозить на 30 мин в -80 ° C.
    2. Центрифуги для 20 минут, 15 000 × g при 4 ° C, проверьте Пелле в нижней части трубки и удалить супернатант. Помыть лепешка с 1 мл 70% этанола, центрифуги для 5 мин на 15000 × g при 4 ° C и отбросить супернатант. Просушите гранулы для приблизительно 30 мин и растворить с 10 мкл ультра-чистой воды.

4. Компетентные подготовка клетки и клетки трансформации

s UA159
  1. полоска фондовой S. mutan на тарелку агар BHI. Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
  2. Подобрать единую колонию с использованием стерилизованные зубочистку и инокуляции в 5 мл бульона BHI. Инкубировать S. mutan s культуры на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
  3. Передача 2 мл культуры S. mutan s 50 мл бульона BHI и проинкубируйте 6-8 ч при 37 ° C для оптической плотности на 600 Нм (600 OD) 0,2-0,4 в анаэробных условиях.
  4. Центрифуга для ячейки 15 мин на 2000 × g при 4 ° C, удалить супернатант и вымыть клетки дважды с 40 мл ледяной воды, после чего 40 мл 10% глицерина.
    Примечание: Остаточные вещества влияют на последующие электропорации.
  5. Аспирационная супернатант тщательно с пипетка Пастера, как присоединение Пелле клеток в 10% глицерина уменьшается. Ресуспензируйте клеток в 1 мл свежего 10% глицерина, обойтись 50 мкл суспензии в каждую пробирку microcentrifuge 1,5 мл и хранить при температуре-80 ° C до использования.
    6. Конструкция
  6. Mix 50 мкл Алиготе ледяной компетентных клеток с 5 мкл нарушения, описанные выше в разделе 3. Добавьте смесь для электропорации кюветы (с 0,2 см расстояние между электродами). Использовать режим золотистого стафилококка (1,8 кв, 600 Ω, 10 МКФ, 1 импульса) электропорации аппарата для electroporate.
  7. Приостановить клетки в 500 мкл BHI бульон сразу же после электропорации и добавьте 50 мкл суспензии спектиномицин содержащих плиты BHI-агара.
    Примечание: Загородный инкубации время после электропорации не требуется. Однако, инкубаторов для 1-2 ч после электропорации может повысить эффективность преобразования.
  8. Инкубировать пластину для 2-6 дней при 37 ° C в анаэробных условиях.
    Примечание: S. mutans Δ gtfB построен как описано выше. Весь регион кодирования гена gtfB заменяется эритромицин сопротивления ген 8 в S. mutans Δ gtfB. Каждого штамма S. mutans культивировали в BHI бульон при 37 ° C в анаэробных условиях.

5. Проверка гена нарушения и хранения

  1. выбрать случайные колоний и прививать им в смесь ПЦР для выполнения колонии PCR согласно таблице 2 и таблице 3. Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно.
  2. Загрузить реакционную смесь ПЦР на геле агарозы 1% для подтверждения spc r-конкретные группы ДНК.
  3. Выбрать позитивные колонии, с использованием стерилизованные зубочистку и субкультуры клетки в 10 мл спектиномицин содержащих BHI бульон для 2 дней при 37 ° C в анаэробных условиях.
  4. Проверить поколения S. mutans Δ gtfC.
    1. Делят суспензию клеток одинаково. Извлечение геномной ДНК из клетки, описанные выше (шаги 2.3. чтобы 2.5.5.). Выполнять ПЦР с геномной ДНК как ПЦР шаблон, используя Праймеры для проверки gtfC нарушения (Таблица 1) согласно таблице 2 и таблице 3.
      Примечание: Праймеры PCR, реагентов и усиления циклов кратко излагаются в таблице 1, в таблице 2 и таблице 3, соответственно.
    2. Загрузить смесь ПЦР на 2% гель агарозы и сравните размер усиливается группы с размером ожидаемого диапазона для подтверждения поколения соответствующие ампликон .
    3. Центрифуга оставшиеся суспензию клеток для 15 мин на 2000 × g на 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл PBS.
    4. Центрифуги для 15 мин на 2000 × g на 4 ° C. Ресуспензируйте клетки пеллет в 1,5 мл бульона BHI, содержащих 25% глицерина и хранить в-80 ° Cor -20 ° C.

6. Фенотипического анализа

  1. подряд каждый штамм s S. mutan на тарелку агар BHI. Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
  2. Подобрать единую колонию с использованием стерилизованные зубочистку и инокуляции в 2 мл BHI бульон с или без соответствующего антибиотика. Инкубируйте на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
  3. Инокуляции 20 мкл ночи подвеска культуры в 2 мл бульона BHI, содержащей 1% или 5% сахарозы без антибиотиков в стеклянной пробирке; культура клетки с пробирку в наклонном положении на ночь при 37 ° C в анаэробных условиях.
  4. Vortex стеклянные пробирки для 10 s и сцеживаться суспензии культуры. Промойте пробирки три раза с дистиллированной водой. Добавить 1 мл 0,25% Кумасси блестящий синий (НБР) пятно биопленке на стенке трубки, а затем инкубировать 1 мин
  5. Сцеживаться окрашивание раствора, вымыть пробирки три раза с дистиллированной водой и сухие пробирки.
  6. Оценить плотность цвета и расширение окрашенных CBB биопленки визуально определить биопленки формирование способности в фенотипического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2 показывает, что размер каждого продукта от 1st ПЦР, как заметил на геле агарозы 1%, был в хорошем согласии с предсказал размером примерно 1 КБ. Рисунок 3 показывает анализ электрофореза геля продукции 2nd ПЦР. Рисунок 4 показывает колоний S. mutans преобразована с разрушение конструкции и анализ электрофореза геля продуктов PCR колонии. Ампликонов от всех коло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем Протоколе Праймеры для 1st ПЦР должны разрабатываться для того чтобы усилить примерно 1 КБ, вверх и вниз по течению фланговых районах целевого региона в геноме. Такие длинные Фланкируя последовательности являются необходимыми для повышения эффективности гомологичная рекомбинация.

Последовательности праймеры (вверх назад, вниз вперед, spcr-вперед и spcr-обратный) в этом протоколе были автоматически определяются на месте инкорпорации...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддержали японское общество содействия развитию науки [номера грантов 16 K 15860 т.м. и 15 K 15777 N.H.].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Штамм Streptococus mutansStock в лаборатории.Штамм дикого типа (Штамм UA159)
Набор для экстракции геномной ДНКZymo ResearchD6005
Аппарат для разрушения бисераTaitecGM-01
Синтетические геныEurofins GenomicsИндивидуальный заказгена устойчивости к спектиномицину и эритромицину
ТермоциклерAstecPC-708
ПЦР-праймерыEurofins GenomicsИндивидуальный заказ35 оснований в длину
ДНК-полимеразаTakaraR045AВысокоточная ДНК-полимераза
Набор для экстракции гелемNipponGenetics FG-91202Экстракция ДНК из агарозного геля
Гелевый резакNippon GeneticsFG-830
СпектрофотометрBeckman CoulterDU 800
ЭлектропораторBio-rad1652100
Электропорационная кюветаBio-rad1652086зазор 0,2 см
АнаэропакMitsubishi Gas ChemicalA-03Анаэробная система для культивирования
Мозговая инфузия сердцаBecton, Dickinson237500Бактериальные питательные среды
SpectinomycinWako195-11531Антибиотики
ЭритромицинWako057-07151Антибиотики
СахарозаWako196-00015Для проявки биопленки
CBB R-250Wako031-17922Для окрашивания биопленки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  3. Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).
  4. Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
  5. Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
  9. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
  10. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
  11. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  12. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BHI

Похожие статьи