В пробирке Фагоцитоз миелина мусора макрофагами, костного мозга, полученных

Костный мозг производные макрофагов (BMDMs) являются важным связующим звеном между врожденная и адаптивного иммунитета. Как антиген представляющих клеток (БТР) они могут общаться с лимфоцитов через обе презентации антигена и цитокина релиз^1,2,3. Однако как профессиональных фагоцитов, их основная функция – очистить патогенов, возрасте клеток и клеточных обломков^1,4. После травмы спинного мозга (SCI) значительное количество миелина мусора генерируется из умирающих олигодендроциты, типа клеток, ответственных за ЦНС аксона миелинизации⁵. Мы и другие показали, что распродажа миелина мусора является прежде всего обязанностью проникновения BMDMs^5,6,7. Однако в пределах спинного сайты сплошным миелина мусора было предложено перенести эти обычно противовоспалительных клеток к про воспалительных государство^5,8,9. Как основные посредники нейро-воспаления спинного мозга пострадавшего BMDMs являются важные клинические цели.

Чтобы помочь изучить влияние BMDMs в спинной мозг потерпевшего, мы разработали модель в vitro непосредственно изучить, как BMDMs реагировать миелина мусора. Для улучшения биологической значимости, первичный мышиных BMDMs и свежевыделенных миелина мусора используются в этих расследований. Таким образом представленные здесь методы также подробно изоляции и культуры первичной мышиных BMDMs, и изменение сахарозы градиентный метод, используемый для изолировать мышиных ЦНС производных миелина мусора^10,,1112. Миелиновые мусора могут быть легко помечены Люминесцентную краску, Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE), трек, который его интернализации, BMDMs. CFSE хорошо подходит для этого приложения, потому что это не цитотоксических, и разрешений на его узких флуоресцентного спектра мультиплексирование с другими флуоресцентных зондов^13,14. После фагоцитоза миелина мусора липиды транспортируются через лизосом и упакованы как нейтральные липиды в внутриклеточного липидного капель⁵. Для количественного определения это накопление внутриклеточных липидов, мы представляем O Красного масла (Оро), окрашивание метод, оптимизированный для анализа количественных изображений. Этот простой метод окрашивания производит надежные воспроизводимость результатов и количественной оценки¹⁵. Эти методы содействия изучению миелина мусора фагоцитоза и липидов удержания с ограниченным специализированного оборудования.

Методы описанные здесь и в разделе 2 были одобрены Флорида государственного университета институциональных животное уход и использование Комитет (IACUC) и руководящие принципы, изложенные в руководство для ухода и использования лабораторных животных, 8-^й выпуск . Все животные, используемые в этом в настоящем Протоколе, дом в учреждении специальных лабораторных животных до использования. Не в естественных условиях экспериментов был выполненных ранее в жертву. Поголовья были основаны на экспериментальных потребности, используя средний клеток и миелина коллекций в качестве руководства для того, чтобы свести к минимуму использование.

Примечание: Этот протокол описывает поколения костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) (раздел 1), подготовка дневно обозначенные мозга, полученных миелина мусора (раздел 2), Общая процедура для анализа миелина мусора фагоцитоза (раздел 3), и Общая процедура для анализа миелина мусора накопления липидов (раздел 4). Подготовка реагента, уборки клеток и манипуляции, коллекции миелина и маркировки и анализа производительности должен быть завершен в ламинарный поток воздуха биобезопасности кабинета.

1. Генерация первичных макрофагов, костного мозга, полученных

1. Подготовка полного макрофагов питательной среды (CMCM)
   Примечание: макрофагов поколения от костного требует использования макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF). Эта подготовка использует L929 мышиных фибробластов кондиционером СМИ как источник M-CSF.
   1. Генерировать L929 мышиных фибробластов кондиционером СМИ путем культивирования клеток в 145 мм блюда с 50 мл из высоких глюкозы (4500 мг/Л Л-глюкозы) Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнена 5% новый род телячьей сыворотки (NCS) и пенициллин/стрептомицина за 7 дней.
   2. Собирать СМИ от культур в 50 мл конические пробирок и центрифуги для 30 минут на 3500 x g, 4 ° C.
   3. Фильтр supernatants через фильтр 0.2 мкм шприц в новый Тюбик 50 мл конические центрифуги. Кондиционерами СМИ могут храниться при температуре-80 ° C до 6 месяцев.
   4. Для высокой глюкозы DMEM, добавить 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 мышиных фибробластов кондиционером DMEM и 1% пенициллина/стрептомицина. Средства массовой информации могут храниться при температуре 4 ° C на 2-3 месяца. Теплой до 37 ° C перед использованием.
2. Сбор первичных костный мозг клеток и макрофагов индукции
   Примечание: С помощью одной мыши этот протокол будет генерировать около 20 миллионов костного мозга-производные макрофагов (BMDMs).
   1. Усыпить желаемое количество 8-10 недели старых мышей с использованием стандартных руководящих принципов удушение CO₂ следуют шейки матки дислокации.
   2. Дезинфекции животных с помощью 70% этанола (vol/vol): H₂O, насыщая мех.
   3. Вырезать небольшое отверстие в животе и осторожно потяните кожу, чтобы выявить основной ткани. Позаботьтесь, чтобы не пункции брюшной полости.
   4. Удалите оба лань legs начиная с бедра и заканчивая лодыжки. Место собраны ткани в чашке Петри 100 мм, содержащий 5-10 мл стерильной фосфат буфер солевой раствор (PBS), с 1% пенициллина/стрептомицина.
      Примечание: Когда обработка нескольких животных не забудьте сохранить блюда на льду ограничить деградации ткани.
   5. Удаление мышечной и соединительной ткани из кости с помощью скальпеля. Используются только бедра и голени для коллекции ячейку, малоберцовой кости, может быть удален.
   6. Разоблачить полости костного мозга костей, собранных путем обрезки небольшой участок от каждого конца с помощью скальпеля.
   7. С помощью иглы 25g, Очистка полости костного мозга с CMCM в 50 мл конические пластиковых пробирок. Кости появится белый после того, как они были достаточно покраснел.
   8. После завершения сбора, агитируйте пунктаты с 18g игла для 30-90 s для генерации подвеска одну ячейку.
      Примечание: Лизис шаг необязательный эритроцитов (РБК) может быть выполнено на данный момент. Недавно было предложено, что содержание внутриклеточного железа может влиять на последствия миелина мусора после макрофагов поляризации¹⁶. Для информации относительно включения РБК лизис шаг обратитесь к Trouplin и др. ¹⁷.
   9. Фильтр подвеска через стрейнер 70 мкм стерильным клеток в новый Тюбик 50 мл конические центрифуги.
   10. Семя собраны ячейки равномерно в 145 мм блюд культуры клеток, содержащих 15-20 мл CMCM. Используйте примерно три культуры блюда на мышь жертву. Инкубируйте культур при 37 ° C, 5% CO₂.
   11. После 72 часов мыть плиты с стерильных PBS, чтобы удалить не сторонник клетки, затем добавить 15-20 мл свежего CMCM. Инкубируйте культур еще 4 дней при 37 ° C, 5% CO₂. После 7 дней, общей культуры кроветворных клеток костного первоначально изолированные будет зрелой BMDMs (рис. 1).

2. поколение дневно обозначенные мозга, полученных миелина мусора

Примечание: Все реагенты могут храниться при температуре 4 ° C до 1 месяца.

1. Подготовка миелина мусора коллекции реагентов
   1. Подготовка Tris· CL буферного раствора.
      1. До 800 мл дистиллированной деионизированной H₂O (ddiH₂O) добавляют 20 мл 1 M Tris· CL, pH 7.45 (20 mM концентрации выпускных экзаменов) и 20 мл 100 мм Na₂ЭДТА (2 mM концентрации выпускных экзаменов).
      2. Отрегулируйте пэ-аш до 7,45. Отрегулируйте громкость до 1000 мл с ddiH₂O. фильтра раствором через блок фильтрации 0,2 мкм.
   2. Подготовка 1 М раствора сахарозы.
      1. До 100 мл Tris· CL буферного раствора, добавить 68.46 г сахарозы. Отрегулируйте громкость до 200 мл с Tris· CL буферного раствора. Фильтр раствор через блок фильтрации 0,2 мкм.
   3. Подготовка 200 мл раствора сахарозы 0,32 М путем разбавления 1 М раствора с Tris· CL буферного раствора 0.83:0.16 (vol/vol).
   4. Подготовка 150 мл раствора сахарозы 0,83 М путем разбавления 1 М раствора с Tris· CL буферного раствора 0.83:0.16 (vol/vol).
2. Сбор мусора мозга производные нефти миелина
   Примечание: Для изоляции нефти миелина мусора коллекции метод, описанный здесь.
   1. Усыпить мышей 10-12, 8-10 недель возраста с использованием стандартных руководящих принципов по удушение₂ CO следуют шейки матки дислокации.
   2. Рассечь мозги и поместите их в тарелку 100 мм, содержащие 10 мл раствора сахарозы 0,32 М.

3. миелина мусора фагоцитоза Assay

Примечание: Ниже приведен базовый метод наблюдения фагоцитоза дневно обозначенные миелина мусора. Добавление других процедур и экспериментальных условий будет необходимо оптимизировать следователем.

1. Подготовка лечения пластин
   1. Для каждой пластины 145 мм собирают Зрелые BMDMs в 15 мл конические пластиковых пробирок с помощью 5-6 мл 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) Дульбекко фосфат амортизированное saline (dPBS) (рН 7,4).
      Примечание: Не используйте трипсина, как она может изменить состояние активации клеток¹⁸.
   2. Добавьте равное количество подогретым CMCM в каждую пробирку собранных клеток.
   3. Центрифуга на 180 x g 8 мин при 20 ° C. Выбросите супернатант.
   4. Вновь приостановите клетки в CMCM и count.
   5. В каждую лунку 24-ну клетки культуры плиты добавьте 1 х 10⁵ клеток в 1 мл CMCM.
   6. Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO₂ на 24 часа.
2. Лечение мусора миелина и анализ
   1. Добавьте 10 µL 100 мг/мл CFSE помечены миелина мусора для каждой скважины (конечной концентрации 1 мг/мл).
   2. Инкубируйте 1-3 часа при 37 ° C, 5% CO₂.
   3. Промойте пластины 3 раза с стерильных PBS для удаления мусора не охватил миелина.
   4. 400 мкл параформальдегида 4%, в каждой скважине. Инкубируйте 30 мин на RT.
   5. Вымойте тарелка 2 раза с стерильных PBS.
   6. Добавьте 400 мкл раствора Hoechst 33258 в каждой скважине. Инкубируйте 5 мин на RT, защищенном от света.
   7. Мыть тарелки 2 раза с стерильных PBS.
   8. Добавьте 200 мкл фтор гель с трис-буфер для каждой скважины для уменьшения Фотообесцвечивание.
   9. Изображение клетки с помощью инвертированным микроскопом способны epi люминесцентные.
      Примечание: Возбуждения и выбросах волн CFSE, 494 Нм и 521 Нм, соответственно.
   10. Разделите количество положительных клеток CFSE на количество ядер для определения относительной миелина поглощение мусора.
   11. До обработки изображений, сохранить пластины на срок до 7 дней при 4 ° C, защищать от света.

4. Количественная оценка внутриклеточных липиды через пятнать Красного O нефти

Примечание: Ниже приведен базовый метод наблюдения внутриклеточный миелин мусора производные липиды.CFSE, помечены миелина мусора не рекомендуется использовать для флуоресцентных квантификации Оро пятнать благодаря спектрального наложения. Добавление других процедур и экспериментальных условий будет необходимо оптимизировать следователем.

1. Подготовка пятнать решения
   1. Готовят 0,5% нефти красно-O (Оро) окрашивание раствора.
      1. Медленно добавьте 100 мл 100% пропилен гликоль (1,2-пропандиола) по 0,5 г Оро (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) помешивая.
      2. Нагрейте раствор при 95 ° C в течение 15 минут или до тех пор, пока все крупные частицы растворяются.
         Примечание: не нагреваются свыше 100 ° C.
      3. Фильтр раствор через кусок фильтровальной бумаги пока еще тепло в новый контейнер.
      4. Разрешить решение прохладно ночь на RT. раствор может храниться до 1 года на RT.
   2. Готовят раствор пропиленгликоля 85%.
      1. Добавьте 85 мл 100% пропиленгликоля 15 мл ddiH₂O. Stir пока не смешано. Раствор может храниться до 1 год на RT.
2. Подготовка лечения пластин
   1. Подготовка 24-ну пластины после метода, описанного в разделе 3.
   2. Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO₂ на 24 часа.
3. Миелиновые мусора лечение
   1. 10 мкл мусора миелина 100 мг/мл, для каждой скважины (конечной концентрации 1 мг/мл).
   2. Инкубируйте 1-3 ч при 37 ° C, 5% CO₂.
   3. Промойте пластины 3 раза с стерильных PBS для удаления мусора не переваривается миелина.
      Примечание: В этой точке, пластины, либо можно пройти немедленной фиксации или свежие CMCM могут быть добавлены, и клетки вернулся в инкубации для дополнительного времени точек.
   4. 400 мкл параформальдегида 4%, в каждой скважине. Инкубируйте 30 мин на RT.
   5. Вымойте тарелка 2 раза с стерильных PBS затем приступайте к пятнать.
4. Оро окрашивание и анализ
   1. Вымойте фиксированной пластина 3 раза с ddiH₂O.
   2. 400 мкл 100% пропиленгликоля для каждой скважины и инкубировать в течение 5 мин на RT.
      Примечание: это позволит уменьшить вынос ddiH₂O.
   3. Аспирационная пропилен гликоль и 400 мкл раствора Оро в каждой скважине.
   4. Инкубируйте 8 мин при 60 ° C.
   5. Аспирационная Оро решения. Затем добавьте 400 мкл 85% пропиленгликоля для каждой скважины и проинкубируйте 5 minumintes на RT.
   6. Вымойте тарелка 3 раза с ddiH₂O.
   7. Добавьте 400 мкл раствора Hoechst 33258 в каждой скважине. Инкубируйте 5 мин на RT, защищенном от света.
   8. Мыть тарелки 2 раза с стерильных PBS.
   9. Добавьте 200 мкл фтор гель с трис-буфер для каждой скважины.
   10. Изображение клетки с помощью инвертированным микроскопом способны epi люминесцентные. Оро может отражаться с использованием набора стандартных Техас красный или DsRed фильтр.
   11. Количественно относительные липидов удержания, определяя Оро положительной области в каждом поле изображения и разделить на количество ядер.
   12. Поддерживать пластины для 7 дней при температуре 4 ° C, защищенном от света.

Лечение BMDMs с CFSE надписью миелина мусора должно дать четкие интернализации (рис. 2). В то время как время 3 часа взаимодействия является достаточным для BMDMs фагоцитировать достаточно добавлен миелина мусора для надежного обнаружения вниз по течению, внутриклеточного накопления может наблюдаться с всего лишь 1 час взаимодействия. Однако некоторые миелина мусора могут быть присутствует на поверхности клеток после стирки. Это может быть из-за недостаточной Стиральная или частиц, не полностью учитываются на ранних этапах фагоцитоза.

В то время как BMDMs можно быстро усвоить миелина мусора, лизосомальных обработки требуется до Оро stainable липидов капельки виде. Для демонстрации, BMDMs были инкубировали с мусором миелина 90 минут, промывают и культивируемых на дополнительное количество времени до фиксации и окраски (рис. 3). Рисунок 4 показывает, что есть задержка между начало лечения и липидный нейтральными внешний вид. Следует также отметить, что липидов удержания не является стабильным во время культуры. BMDMs начинают усваивать накопленный липиды вскоре после формирования капли. Таким образом мы рекомендуем ожидания не более 24 часов между Стиральная далеко не охватил миелина мусора и фиксации.

Количественная оценка Оро, окрашенных области демонстрирует уровень миелина жирового обмена в BMDMs (рис. 5). После периода 90-минутный взаимодействия клетки были возвращены в инкубации в свежих CMCM. В начале периода Чейз в свежих средних BMDMs метаболизировать фагоцитированы миелина мусора жирового компонента в нейтральных Оро stainable липиды. Устойчивый рост в положительной области Оро является типичным в течение часов после взаимодействия. Однако, после 24 часов BMDMs будет иметь effluxed или метаболизируется значительную часть внутриклеточных липидов.

Рисунок 1 : Представитель культур BMDM. Первоначально будет наблюдаться несколько адэрентных клеток. На 3 день удаляются любые non сторонник клетки. День 7 наблюдаются Зрелые макрофаги костного мозга-производные. Масштаб = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Представитель изображения BMDM миелина мусора фагоцитоза пробирного. Клетки были относиться с 1 мг/мл CFSE, помечены миелина мусора за 1 час до мытья и фиксации с 4% PFA. Интернализированных миелина мусора могут быть визуализированы с помощью стандартных наборов фильтров GFP на epi флуоресцентный Микроскоп способны. Масштаб = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Диаграмма нефти экспериментальный дизайн красный O (Оро). BMDM лечат с 1 мг/мл миелина мусора (разбавления 1: 100) за 90 минут, после мытья и культуры в свежие среднего до фиксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Оро окрашивание BMDM после фагоцитоза мусора миелина. После записи с 4% ПФА в указанных точках BMDMs-время окрашивали Оро и Hoechst 33258. Представитель изображения для каждой точки времени отображаются. Масштаб = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Анализ количественных изображений Оро пятнать. Для количественной оценки Оро окрашивание 3 скважины были образы 20 X с 5 изображений в колодец. Все параметры изображения приобретения были идентичны. Планки погрешностей = SEM. (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы имеют не раскрытия.