Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56325

⸱

12 октября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем флуориметрический свободных клеток биохимических assay для определения HDL-перекисного окисления липидов. Этот быстрый и воспроизводимые assay может использоваться для определения функции HDL в крупных исследований масштаба и может способствовать нашему пониманию функции HDL заболеваний человека.

Аннотация

Холестерина низкой липопротеинов высокой плотности (HDL-C) являются одним из самых мощных независимых негативные предикторы атеросклеротической сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Структура и функции ЛПВП, вместо того, чтобы HDL-C может более точно предсказать атеросклероза. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. HDL функция определяется обычно ячейки на основе анализов, таких как холестерин измеряем пробирного но эти анализы имеют многочисленные недостатки отсутствием стандартизации. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. HDL окисления повреждает функцию HDL. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Липидов зонд взаимодействия следует рассматривать при интерпретации результатов неферментативного флуоресценции assays для измерения окислительное состояние липидов. Это побудило нас к разработке свободных клеток биохимических ферментативного метода для оценки HDL перекиси содержание липидов (HDLox), способствующий HDL дисфункции. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C. Вот протокол describedfor определение HDL-перекисного окисления с помощью флюрохром реагента. Пробирного изменчивость может быть уменьшена строгой стандартизации экспериментальных условиях. Более высокие значения HDLox связаны с снижение HDL антиоксидантные функции. Индикация этот assay связан с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов. Этот технический подход является надежный метод оценки функции HDL в человеческих заболеваний, где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов играют ключевую роль (например, атеросклероз).

Введение

Атеросклеротические сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) является ведущей причиной смерти во всем мире1,2. Эпидемиологические исследования показали, что низкие уровни холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL), как правило, обратно, связанные с риском развития атеросклероза1,2. Хотя некоторые исследования поддерживают atheroprotective роль для ЛПВП1,2, механизм, по которому HDL ослабляет посвящения и прогрессирования атеросклероза является комплекс 3,4. Таким образом было высказано предположение о том, что сложная структура и функции ЛПВП, а не абсолютный уровень может более точно предсказать атеросклероза 5,6,,78. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. Эти i) сократить ее уровень холестерина измеряем потенциальных 9, ii) уменьшить противовоспалительный и повышение ЛПВП связанные pro воспалительные белки 6,7, iii) снижение антиоксидантной фактор уровней и деятельности и HDL способностью ингибировать окисления липопротеидов низкой плотности (LDLox)10 и iv) увеличить липидов гидропероксид содержание и окислительно-восстановительной деятельности (HDLox)9,11. Надежные анализы, которые оценивают pleotropic функции HDL (например холестерин измеряем, Антиоксидантная функция) может дополнить определение HDL-HDL-C в клинике.

HDL функция обычно оценивается на основе ячеек методами, такими как холестерин измеряем пробирного8,12,,1314. Эти методы имеют основные ограничения, включая значительную гетерогенность в отношении типов клеток используется, тип индикации сообщили, отсутствие стандартизации и накладывающееся воздействие триглицеридов 7,15. Эти недостатки представляют трудности для крупных клинических исследований16. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. Измеряем холестерина является одним из наиболее важных функций ЛПВП, но он только может определяться на основе ячеек анализов. Другие подходы для определения HDL функции, такие как протеомики17,18,19,20,21,,2223, 24 и хемотаксис анализов на основе ячеек Моноцит HDL функция 17,,2225 не были стандартизированы и не может использоваться в крупных масштабах человеческих исследований.

HDL имеет значительные антиоксидантными atheroprotective эффект5,6,,78. Антиоксидантная функция HDL определил присутствии ЛПНП в предыдущей ячейке бесплатно флуориметрический анализов 26. Эти биохимические методы флуориметрический HDL антиоксидантные функции были первоначально разработан Мохамад Наваб и Алан Фогельман и их коллег26. Хотя многие человеческие исследования использовали эти методы для определения HDL функция 17,18,19,20,21,22,23 ,24, липидов (HDL)-липидов (ЛПНП) и липидов флюрохром взаимодействия может ограничить воспроизводимость этих клеток бесплатно неферментативного биохимических анализов HDL функция27,28.

Последнее время интерес была сосредоточена на функциональных последствий HDL окисления, что является результатом окисления липидов и белков в пределах HDL 27,29,30. Предыдущие исследования показали, что окисление HDL ухудшает HDL функция 27,29,30. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Таким образом могут быть использованы для определения HDL функция 9,17,,2031 и учитывая известные ограничения предыдущих анализов HDL функция7, HDL липидной перекиси содержание 15,27,32, мы развитых флуориметрический альтернативный метод, который дает количественную оценку HDL липидной перекиси содержание (HDLox) 32. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C- 32. Биохимический принцип анализа показано на рисунке 1. Мы показали, что этот подход на основе флуоресценции не имеют ограничений предварительного HDL функция анализов27,28. Этот assay далее уточнены и стандартизированы в нашей лаборатории, так, чтобы он надежно может использоваться в крупных масштабах человеческой исследований, даже с криоконсервированных плазменный 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. Индикация этот assay ассоциируется с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. здесь мы опишем этот простой, но надежный метод для измерения HDL липидной перекиси содержания (HDLox). Этот assay может использоваться как инструмент, ответить на вопросы важных исследований относительно роли функции HDL заболеваний человека где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов имеют ключевую роль (например, атеросклероз)32.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

всех экспериментов с использованием человеческого биологические образцы были выполнены с одобрения этики из университета Калифорнии-Лос-Анджелес, Лос-Анджелес и Альфред больницы человеческой этики Комитета, Мельбурне.

Примечание: существует много вариантов флюрохром HDL функции анализа (см. обсуждение) 32. Ниже мы опишем протокол, который дает наиболее последовательной и воспроизводимые результаты. Обзор анализа показано на рисунке 2.

1. образец обработки

  1. использования свежий, не Опаковые сыворотки (могут быть собраны в сыворотке разделитель трубы) или цитрата плазмы, полученные после 12-14 часов голодания. Если с помощью криоконсервированных образцов, включают соответствующий элемент управления, как описано в настоящем Протоколе.

2. День 0-подготовка для assay

  1. подготовить рабочий макет эксперимента с соответствующие элементы управления, образцы и реплицирует. Запуск каждого образца по крайней мере в triplicates. Представитель 96 хорошо схема приведена на рис. 3.
  2. Вычисления всех томов реагентов, которые будут использоваться для assay основанный на количество образцов и реплицирует.
    Примечание: Включить дополнительные 10% объем в каждой рабочей акции, чтобы убедиться, что существует достаточный объем для каждого реагента для конкретного эксперимента.
  3. Этикетка все необходимые трубы для всех различных этапов анализа, например, для разделения ЛПВП, измерение HDL-C (опционально) и fluorochromeassay.

3. День 1-Подготовка элементов управления

    1. создать образец элемента управления из пула плазме или сыворотке Подготовка исследования конкретных Объединенного управления всех исследования образцов. Если работает 20 образцов в каждой пластины в трех экземплярах, объединить 10 мкл от каждого образца в элемент управления 200 мкл пуле. Дать отдельный Алиготе этого объединенного элемента управления клиническую лабораторию для определения HDL-C значение данного элемента управления.
      Примечание: Используйте этот объединенный элемент управления для стандартизации анализа и учета всех возможных известный (например, тип матрицы сыворотки против плазмы, циклов замораживания оттаивания, криоконсервация) и неизвестных вмешивающиеся факторы, которые могут повлиять на экспериментальной изменчивости 27 , 28.
  2. Подготовка специфичные для лаборатории контроля качества (бок)
    1. подготовить большой запас HDL в каждой лаборатории (например, ЛПВП, изолированных от 5 мл плазмы от 10 здоровых доноров) и криоконсервировать несколько аликвоты этого складе для сведения к минимуму циклов замораживания оттаивания.
    2. Использование по крайней мере 10 различных реплицирует из этого фонда, чтобы определить среднее значение HDLox. Допустимый диапазон измеряемых HDLox значения для каждого образца КК, включены в калибровочных находится в пределах < 15% коэффициента вариации этого среднего значения.
    3. Дать отдельный Алиготе этого объединенного элемента управления клиническую лабораторию для определения HDL-C значение этого элемента управления (например, 40 мг/дл).
      Примечание: Детальный подход как использовать кровь от крови банков для создания этих элементов управления ранее был описан 27 , 28 , 32. Используйте дополнительные бок по мере необходимости (например, один из здоровых доноров, известно, что нормальной функции HDL и одним из доноров, известно, что во многом ненормальное функции HDL.
  3. Оптимизация фонового сигнала и пустые значения (необязательно)
    1. к минимуму фон, добавить соответствующее количество каталазы (1-4 ед/мл) в средство инкубации быстро удалить сформированные H 2 O 2 из-за окисления спонтанное воздуха буферов.
      Примечание: Поскольку значения из пустых скважин (не HDL) вычитаются из значений образцов HDL и результаты в настоящее время сообщили относительно объединенного элемента управления (который включен в пластину же 96 хорошо), мы обнаружили, что этот шаг не практически не affec t результаты. Таким образом, оптимизация фонового сигнала с каталазой может быть опущен, если это необходимо.

4. День 1-разделение HDL холестерина HDL осадков с использованием

Примечание: использование коммерчески доступных стандартизированных ЛПВП реагента, чтобы изолировать сыворотки апов в исчерпаны согласно данным производителя ' s инструкции. Эти реагенты широко используются в колориметрические анализов для определения холестерина ЛПВП.

  1. Использовать свежие (или разморозить) плазме или сыворотке образца.
  2. Смесь равных объемов (например 80 мкл) плазмы и HDL холестерина осаждения реагента (20% w/v полиэтиленгликоль в buffer глицин, pH 10.0 (25 ° C)).
  3. Смесь в хорошо закупорить вверх и вниз.
  4. Центрифуг на 1000-2000 x g 10 мин
  5. Аспирационная супернатант (HDL фракция).
  6. Идеально немедленно использовать изолированные HDL для fluorochromeassay HDL перекисного окисления липидов. Однако, если несколько образцов выполняются в тот же день, и другие шаги, такие, как измерение концентрации HDL-холестерина также сделали, затем хранить изолированных ЛПВП при температуре 4 ° C и использовать его следующий день для функции fluorochromeHDL Assay.

5. День 1-определение HDL-C в изолированных HDL

Примечание: это не является обязательным, если используется значение HDL-C от клинической лаборатории для нормализации HDLox величину HDL-C.

  1. Quantify HDL-холестерина из плазмы, используя стандартные колориметрические assays 27. Добавьте 50 мкл Реагента холестерина в каждой скважине и определения концентрации холестерина с помощью колориметрических пластины читателя и стандартный уровень холестерина, в каждый комплект.

6. День 2-Подготовка реагентов

  1. подготовить HRP и холестерина решения HRP 5 ед/мл раствора (диапазон 1-10 ед/мл).
  2. Подготовить 20 мм флюрохром (например, Amplex красный) решения: оттепель флакон флюрохром реагента и ДМСО до комнатной температуры. Перед использованием растворяют флюрохром реагента (1 мг) в 200 мкл ДМСО. Хранить замороженные в раствор ≤-20 ° C, защищать от света.
  3. Подготовить положительной и отрицательной контроля: использование 1 X ' буфер реакции ' без холестерина и 20 мм H 2 O 2 рабочего раствора как положительные и отрицательные управления, соответственно.

7. День 2-флюрохром Assay

  1. добавьте 50 мкл 1 x буфер реакции как пустой (отрицательный контроль).
  2. Дополнительно: добавить рабочий раствор 20 мм H 2 O 2 как положительный контроль в каждой пластинке.
  3. К минимуму экспериментальной изменчивости и обеспечить это добавление реагенты и образцы выполняются последовательно и своевременно, выполняют все дополнения образцов в отдельной 96 хорошо раунд снизу, ясно, из полистирола или полипропиленовые пластины (пластина 1). Затем использовать многоканальные пипетки для передачи определенных томов в 3 96-луночных пластины (плиты 2-4: полипропилен, плоские Скрипттом, черный) (которые имеют идентичные макет) ( рис. 2, рис. 3).
    1. Например, сначала мкл 160 изолированных HDL в каждый образец хорошо, плиты 1, а затем с использованием многоканальных дозаторов перевести 50 мкл HDL-холестерина из каждой скважины/образца на черный 96-луночных пластины. Изменение советы между каждым столбцом и использование нефильтрованной советы для всех переводов.
  4. Оставить образцы в скважинах. Не выбрасывайте. Существует не мыть шаги между добавлением реагентов.
  5. Добавьте 50 мкл раствора HRP 5 ед/мл (0,25 U) в каждой скважине.
    Примечание: Использование HRP перед добавлением реагента флюрохром.
  6. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C. Не выбрасывайте образцы после инкубации (не мыть шагов между дополнения реагентов).
  7. Добавьте 50 мкл fluorochromereagent для окончательного концентрации 300 мкм. На данный момент общая реакция объем составляет 150 мкл. хорошо перемешайте и защищать от света.
  8. Оценить флуоресцентные индикация (в темноте) каждую минуту более 120 минут при 37 ° C с читателем флуоресцентные пластины (530/590 нм фильтры).
    Примечание: Используйте короткие 60-минутный интервал с свежих образцов. Мы обнаружили, что 120-минутный пробирного дает больше воспроизводимость данных с использованием криоконсервированных образцов.
  9. Запись данных с использованием соответствующего программного обеспечения.

8. День 3-данных анализа

  1. запись флуоресценции единиц (произвольные единиц) на 120 минут после добавления флюрохром реактива для всех образцов, включая пустые скважин и всех элементов управления.
  2. Вычислите среднее значение флуоресценции единиц (на основе по крайней мере triplicates) (ox_sample HDL). Не принимайте промахов (> 2 ПБ от среднего значения) во внимание.
  3. Вычитание фона флуоресценции, используя следующее уравнение:
    figure-protocol-1
  4. нормализации сумму HDL холестерина (HDL-C): нормализовать значение перекисного окисления липидов HDLox для каждого образца (в том числе Объединенный элемент управления), HDL-C) (мг/дл). Во всем разделе результаты HDL быка представлен как n (HDL-C) HDLox меры для отражения коррективов для HDL-C. Используйте следующее уравнение:
    figure-protocol-2
  5. стандартизировать выражение значение перекисного окисления липидов HDLox каждого образца против значение объединенного элемента управления. Нормализовать n (HDL-C) HDLox липидной пероксидации значение для каждого образца (с поправкой на HDL-C), n (HDL-C) HDLox липидной пероксидации значение объединенного элемента управления. Во всем разделе результаты HDL быка представлен как nHDL быка меры для отражения коррективов для экспериментальной изменчивости и HDL-C. Используйте следующее уравнение:
    figure-protocol-3
    Примечание: этот подход похож на другие установленные экспериментальные подходы к сокращению экспериментальных вариативности измерений такие как международный нормализованный соотношение (INR) 44 , 45. Этот подход был одобрен в клинических исследованиях 32 , 33 , 34 , , 35 36 , 37 , 38 , 39.
  6. выполнять контроль качества экспериментальных результатов с использованием стандартного контроля качества образцов. Каждая лаборатория должна создать свои собственные элементы управления качества (бок). В идеале есть КК для nHDLox из образца с известными неблагополучных HDL и КК для nHDLox из образца от здоровых доноров [например использование пула образца от молодых людей, установленных банком крови доноров и имеют не известны сопутствующие заболевания и факторы риска сердечно-сосудистые заболевания, включая Курение]. Последний элемент управления стандартизирует результаты между различными лабораториями. Средние значения этих бок, созданной на основе по крайней мере 5 реплицирует (обычно мы используем 10 реплицирует для этого важного шага).
    1. Проверить, имеют ли измеренные бок в калибровочных значений в ожидаемый диапазон значений. Предполагая, приемлемый максимальный экспериментальный изменчивость 15%, всех экспериментальных измерений должны подпадать 15% известных средних значений установленных КК. Используйте следующие уравнения:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      Примечание: если либо включены контроля качества образцов () нормальный против неблагополучных HDL) дает HDLox значения за пределами ожидаемого диапазона (создан в каждой лаборатории), а затем повторить эксперимент.
  7. Выполнять контроль качества экспериментальных результатов, используя коэффициент вариации (кв) для количественной оценки экспериментальных изменчивости: повторить все образцы с ООПС > 15%. Используйте следующее уравнение:
    figure-protocol-6
    Примечание: типичный интра пробирного (в рамках же пластины) и между анализами (среди различных пластин) изменчивости и экспериментальной < 15%. 2) типичный внутри пробирного CV находится между 1-7% и типичные interassay CV, составляет 3-10%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В каждом также шаг 7.3 добавляются 50 мкл каждого образца HDL. 50 мкл раствора HRP, 5 ед/мл (0,25 U) затем добавляются в каждой скважине как шаг 7.5. Образцы инкубируют 30 минут при 37 ° C как шаг 7,6. 50 мкл Реагента флюрохром затем добавляются в каждой скважине как шаг 7.7 (конечная концентрация 300 мкм). Флуоресцентный индикация (в темноте) затем оценивается каждую минуту в течение 120 минут при 37 ° C с читателем флуоресцентные пластины (530/590 нм фильтры). Представитель флуоресценци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанные здесь предлагает надежный инструмент ответить вопросы важных исследований относительно роли функции HDL в атеросклероза и заболеваний человека. Assay количественно перекиси содержание ЛПВП липидов на мг HDL-C помощью ферментационная амплификация (ПХ). Этот подход позволяет избежать известных ограничений предварительного HDL функция анализов (например assay измеряем холестерина) включая значительная неоднородность, что касается типов клеток, используется, тип индикации сообщили, отсутствие стандартизац...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Этот протокол и пробирного имеют отношение к патентной PCT/US2015/018147.

Благодарности

Авторы с благодарностью отмечаем работу Наваб Мохамад доктор, Алан Фогельман и Редди Сриниваса за их ключевую роль в развитии более ранних итераций этой модели. T.A.A. поддерживается КМТИ университета вице-канцлера докторантура стипендий. AJ и AH поддерживаются NHMRC Грант проекта 1108792. TK поддерживается NIH предоставляет низ K08AI08272, гранта NIH/NCATS # µL1TR000124.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>экспериментальные реагенты
ЛПВП ПЭГ (полиэтиленгликоль) осаждающий реактивPointe ScientificH7511
Amplex Red.Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-ЙоркA12216Набор для анализа красного холестерина Amplex.
• ≤ – 20° C & Desiccate
& bull; Беречь от попадания света
ДМСО.Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-ЙоркA12216Набор для анализа красного холестерина Amplex.
• ≤ – 20° C & Desiccate
& bull; Защитите от легкой
пероксидазы конской редьки (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Anasay Kit.
• ≤ – 20° C & Desiccate
& bull; Беречь от легкого
холестерина эстеразы.Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-ЙоркA12216Набор для анализа красного холестерина Amplex.
• ≤ – 20° C & Desiccate
& bull; Защита от легкого
холестерина Эталонный стандартLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Набор для анализа красного холестерина.
• ≤ – 20° C & Desiccate
& bull; Беречь от света
Резоруфин флуоресценс Эталонный стандартLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Набор для анализа красного холестерина.
• ≤ – 20° C & Desiccate
& bull; Беречь от света
5-кратный реакционный буфер.Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-ЙоркA12216Набор для анализа красного холестерина Amplex.
• ≤ – 20° C & Desiccate
& bull; Защитите от легкого
холестерина ЛПВП Автоматический реагентThermoFisher Scientific Co., Сан-Хосе, Калифорния, США.TR39601
Название<strong>CompanyКаталожный номер>Комментарии
Plasticware
96-луночные пластины (полипропилен, плоское дно, прозрачные).Sigma AldrichM0687
96-луночные планшеты (полипропилен, плоское дно, черные).Sigma AldrichM9936
1,5 мл пробирки Eppendorf Eppendorf0030 125.150
ClipTip 200, стерильныеThermoFisher Scientific Co., Сан-Хосе, Калифорния, США.14-488-058
Многоканальные пипетки Thermo Scientific, 8-канальные, 125 ThermoFisher Scientific Co., Сан-Хосе, Калифорния, США.  14-387--955
Название<strong>Company>Номер в каталогеКомментарии
Software
Gen5 2.01 программное обеспечениеBiotek, Вермонт, СШАNA
Name Company>Номер в каталогеКомментарии
>Оборудование
Gen5 Считыватель пластинBiotek, Вермонт, СШАNA

Ссылки

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367(2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87(2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716(2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23(2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342(1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Amplex Red
Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.