Assay органоид растворения (ОРА) для функционального анализа кишечных стволовых и ниша клеток

Краткое содержание

Кишечные органоид культур устанавливаются от всей склепы и не позволяют анализ самообновления и дифференциации в клетки конкретных моды. Этот протокол описывает воссоздание отсортированных стволовых (Lgr5⁺) и ниши (Paneth) клетки, которые порождают organoids обеспечивая их предыдущие биохимических и генетических изменений и функционального анализа.

Аннотация

Кишечного эпителия характеризуется чрезвычайно быстрая текучесть. В млекопитающих весь эпителиальной выстилки обновляется в течение 4-5 дней. Кишечные стволовые клетки находятся в нижней части склепы Lieberkühn, выделяются по экспрессии гена Lgr5 и сохранения гомеостаза через их характерным Высокий пролиферативный¹. На протяжении тонкого кишечника Lgr5⁺ стволовые клетки являются перемешан с специализированными секреторных клеток, называемых Paneth клеток. Paneth клетки секретируют антибактериальных соединений (то есть, лизоцима и cryptdins/дефензинов) и оказывают контрольный роль на кишечную флору. Совсем недавно Роман функция была обнаружена Paneth клеток, а именно их способность обеспечивать поддержку нишу Lgr5⁺ стволовые клетки через несколько ключевых лигандов как Wnt3, EGF и Dll1².

Когда изолированные ex vivo и культивировали при наличии конкретных факторов роста и компоненты внеклеточного матрикса, весь кишечные крипты порождают долгоживущих и самостоятельного обновления 3D структуры под названием organoids, весьма напоминающие склеп ворсинок Эпителиальный архитектура взрослых тонкой кишки³. Органоид культур, когда создана из всей склепы, позволяют исследования самообновления и дифференцировку стволовых клеток кишечника нишу, хотя без учета вклада ее отдельных компонентов, а именно Lgr5⁺ и Paneth клетки.

Здесь мы опишем новый подход к assay органоид, который использует способности Paneth и Lgr5⁺ клетки объединяться и создавать organoids когда совместно культивируемых. Этот подход, здесь называют «органоид воссоздание пробирного» (ОРА), позволяет генетических и биохимических изменений Paneth или Lgr5⁺ стволовых клеток, после растворения в organoids. Таким образом это позволяет функциональный анализ двух основных компонентов ниши стволовых клеток кишечника.

Введение

Кишечного эпителия является наиболее быстро самостоятельного обновления тканей в организме млекопитающих и, таким образом, был объектом множества исследований, направленных на выявление и функциональной характеристике стволовых клеток взрослых, проживающих в нижней части склепа из Lieberkühn, целевых, экспрессия гена Lgr5 и зависит от канонических Wnt сигналы¹. В частности, Lgr5⁺ стволовые клетки бокам и поддержке специализированных нишевых клетки, то есть Paneth клетки, которые также зависеть Wnt сигнализации для их созревания². Вместе, эти типы две клетки лежат в основе самообновлению эпителиальной выстилки кишечника и сохранить ежедневно гомеостатических равновесия: Lgr5⁺ стволовые клетки быстро разделить и порождают прародителем и более специализированных кишечного эпителия клетки; Paneth клетки обеспечивают ниши основных факторов (например, Dll1, Wnt3, EGF) для Lgr5⁺ стволовые клетки². Количество кишечных склепы когда покрытием ex vivo в форме организованных и самостоятельного обновления структуры под названием organoids, или «мини кишки», была использована как экспериментальный инструмент для обеспечения понимания процессов, таких как самообновления и дифференциация в нормальных и патологических условиях, включая рак⁴. Из нескольких тканей, в том числе кишечника, поджелудочной железы, печени и почек, как мышь, так и человеческих пробах⁴были созданы органоид культур. Метод добычи и факторы роста, занятых в разработке этих культур органоид ткане- и предназначены для привода мульти линии дифференциации и максимально точно имитировать оригинальные ниши стволовых клеток в vivo. Organoids могут иметь потенциальные приложений, включая лечения генетических заболеваний, оценка терапевтической эффективности в рак, анализ лекарственной токсичности или изучению органогенеза в vitro⁵.

В целом основным ограничением органоид культурах когда создана из образцов тканей является отсутствие клеток специфика. К примеру, кишечные organoids с целом кишечные крипты не позволяют анализ отдельных клеточных компонентов, входили в источнике ткани (например, содержат весь склепы Lgr5⁺, Paneth, и клетки-предшественники).

Здесь мы опишем новый метод, именуемый ORA, который сочетает в себе преимущества кишечных органоид культур с функционального анализа его самых основных компонентов, а именно стволовых (Lgr5⁺) и ниши (Paneth) клетки. Это достигается за счет уникальной способности Paneth и Lgr5⁺ клетки к физически связаны друг с другом совместно инкубировали при породить organoids^2,6,10. Мы воспользовались этой функции и предварительно индивидуально типы двух клеток перед предоставлением им для воссоздания organoids. При этом каждый компонент ячейки могут подвергаться любого данного препарата, фактор роста, биохимические ингибитор, генетической модификации или химической обработки до растворения и органоид формирования. Таким образом используя ORA assay позволит определение о том, имеет ли конкретный препарат лечения или генетической модификации специфическое воздействие на стволовые клетки или их двойники нишу.

Протокол

Все процедуры были сделаны согласно местных животных законов и руководящих принципов.

1. Подготовка документов, средства массовой информации культуры и блюда

1. Автоклав 1 набор кишечника ножницы, ножницы нормальной и щипцами в стерильный контейнер.
2. Поместите блюдо 96-луночных (плоское дно) в инкубаторе при 37 ° C.
3. Подготовка 10 мл полной питательной среды с реагентами, перечисленных в таблице материалов.
4. Инкубируйте полного среднего при 37 ° C на водяной бане.
5. Оттепель воссоздана базальной мембраны, поместив его в ведро льда. Восстановленный базальной мембраны станет жидким при температуре 4 ° C.
6. Заполните 4 чашки Петри с холодной фосфат амортизированное saline или сокращенно PBS (4 ° C).

2. изоляция малых кишечные крипты

1. Пожертвуйте при вдыхании CO₂ мыши - eGFP-IRES-CreER^t2 Lgr5на фоне C57BL6/J. Рассечь брюшину продольно с ножницами.
2. Держите живот с щипцами и резать поперек пополам.
3. Теперь с помощью кишечной ножницы, вытащить кишечника и поместите его в чашку Петри, содержащие PBS.
   Примечание: Кишечные ножницы имеют острым и тупым кончиком. Тупым кончиком эти ножницы предназначен чтобы не повредить склеп ворсинок архитектуры при открытии в кишечнике.
4. Начните с размещения тупой совет в желудок и осторожно протолкнуть пилоруса. Перейти резки ножницами и потянув с щипцами.
5. После продольно открыт весь кишечник, стирать в холодной PBS, удерживая его с щипцами и осторожно промойте его в растворе PBS с U-образной движений.
6. После того, как будут удалены все остатки стул, переходите к придавить кишечника на разделочную доску, просветный стороной вверх. Люминал сторона легко узнаваемы, отсутствие кровеносных сосудов и его бледный вид, по сравнению с внешней части.
7. С на стеклянное скольжение аккуратно удалите ворсинки соскабливания уплощенных кишечника. Выполните этот шаг два раза по всей длине ткани.
8. Нарежьте тонкой кишки с стерильные хирургические лезвия 2-5 мм.
9. Место небольшой кишечных фрагментов в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл холодного льда PBS.
10. Очистите фрагменты тканей, удаление любых оставшихся примесей, закупорить их вверх и вниз в PBS. Отменить супернатант и повторите этот шаг до тех пор, пока PBS совершенно ясно.
11. Добавьте 15 мл холодной PBS, довести объем окончательный PBS до 25 мл. Добавить 2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и проинкубируйте 45 мин на ролике на 4 ° C.
12. Выбросите PBS/ЭДТА.
13. Добавить 10 мл PBS и отсоедините склепы, жестко закупорить фрагменты тканей вверх и вниз (по крайней мере три раза). Соберите супернатант.
14. Повторите шаг 2.13 четыре раза. Добавьте питательной среды для достижения окончательный объем 50 мл.
15. Пелле клетки центрифугированием (300 x g 5 мин).
16. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл питательной среды и Пелле склепы центрифугированием (80 g x 3 мин).

3. одну ячейку подготовка

1. Отменить супернатант гранулированных склепы и Ресуспензируйте их в 1 мл трипсина как ферменты вместе с 50 мкл DNAse (50 мкг/мл).
2. Инкубируйте клетки в водяной бане при температуре 32 ° C на 2 мин.
3. Добавьте 10 мл питательной среды. Отделить склепы в отдельные клетки, жестко закупорить вверх и вниз по крайней мере 5 раз.
4. Фильтр решение через стрейнер 40 мкм (для устранения кусты и других примесей) и Пелле одной клетки на 300 g x 5 мин.

4. поток цитометрии и обшивка

1. Подготовка 50 мл 1 x Хэнк буфферезированный раствор соли или HBSS/2% плода корова сыворотки (FCS) раствора и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл на каждые 10⁶ клеток
2. Добавьте в суспензию клеток BV421 Линь^– (CD31, CD45, TER119) в концентрации 1: 100 и CD24-APC и CD117-PE как в концентрации 1: 250 антител на 30 мин.
3. Сортировка Lgr5⁺ стволовых клеток и клеток Paneth в отдельный низкий связывать трубы. Дополнительные сведения о сортировке протоколы для Lgr5⁺ и Paneth клетки, смотрите рот и др. ⁷ и Шюи и др. ⁶
   1. Центрифуги, отсортированных клетки на 300 x g 5 мин Ресуспензируйте клетки в 100 мкл среде с компонентов, описанных в 1.3 (см. Таблицу материалов).
4. Лечения (например, путем химического или генетические модификации) Paneth клетки (n = 2000) или Lgr5⁺ стволовые клетки (n = 2000).
   1. Для лечения ячейки, используйте 5 мкл Реагента липосомы опосредованной трансфекции в суммарный объем 100 мкл питательной среды и малые интерферирующие РНК (siRNA) в концентрации 100 Нм. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C для малых интерферирующих РНК или время, необходимое для выбранной модификации.
5. Вымойте клетки дважды в 500 мкл питательной среды.
6. Центрифуга на 300 g x 5 мин и Ресуспензируйте клетки в 10 мкл питательной среды.
7. Объединить два клетчатых компонентов (Paneth или Lgr5⁺ клетки) в 20 мкл общий объем и центрифуги на 300 x g 5 мин на RT.
8. Совместное инкубировать Paneth и Lgr5⁺ клетки для 10 мин на RT.
9. Удаление 10 мкл супернатант и оставить мениске жидкости быть уверенным не аспирационная Пелле ячейки.
10. 30 мкл восстановленный базальной мембраны клеток для общего объема 40 мкл, Ресуспензируйте клетки и пластины в подогретым 96 пластины хорошо. После 10 минут, добавить 200 мкл полной среды (см. Таблицу материалов). Изменение среднего каждые 48 ч.
11. Граф органоид кратности на 5 день.

Результаты

Воссоздание пробирного органоид позволяет отдельный функциональный анализ основных компонентов ниши и стволовых клеток кишечного эпителия, здесь продемонстрировано малые интерферирующие РНК (siRNA) гена Apc .

Для достижения этой цели, мы впервые использовали флуоресцентный активированных клеток, сортируя (FACS), чтобы отделить 8000 Lgr5⁺ и 6000 Paneth ячейки от инбредных мышей C57BL6/J. На

Обсуждение

ORA позволяет изысканный функциональный анализ двух основных компонентов ниши стволовых клеток кишечника, а именно: Lgr5⁺ и Paneth клетки. Этот подход ранее работали с нами и другими с незначительными изменениями^6,10,11. Здесь мы представляем ORA процедуры как воспроизводимость и стандартизированных лабораторных протокол. Кроме того, мы доклад о воздействии Даунрегуляция Apc в Lgr5⁺

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Глутамакс *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Конечная концентрация: 10 мМ
пенициллин/стрептомицин *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Конечная концентрация: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Конечная концентрация: 10 мМ
Рекомбинантный мышиный EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Конечная концентрация: 50 нг/мл
Рекомбинантный мышиный Noggin *	Peprotech	250-38	Конечная концентрация: 100 нг/мл
y27632 *	Sigma	Y0503	Конечная концентрация: 10 & микро; M
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Конечная концентрация: 1 & микро; M
Рекомбинантный мышиный R-спондин *	R& D systems	3474-RS-050	Конечная концентрация: 1 мг/мл
Flexitube Раствор гена siRNA APC	Qiagen	GS11789	Конечная концентрация: 100 нМ
Липофектамин 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
пробирки с низким связыванием	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* Комбинация этих реагентов представляет собой полноценную питательную среду

102424