Протокол для построения тканей проникающего осветитель для доставки больших объемов с минимальным диаметром свет представлен.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Большой объем, поведенчески соответствующего освещения для Оптогенетика в Non-human приматов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает большого объема осветитель, который был разработан для optogenetic манипуляции в мозге нечеловеческих приматов. Осветитель является изменение пластикового оптоволокна с выгравированным кончиком, что светоиспускающей поверхности > 100 x, что из обычных волокна. Помимо описания строительство большого объема осветитель, этот протокол детали калибровки контроля качества, используемые для обеспечения распределения даже света. Кроме того этот протокол описывает методы для вставки и удаления осветитель большой объем. Поверхностные и глубокие структуры могут быть освещены. Этот большой объем осветитель не нужно быть физически связаны с электродом, и потому что светильник выполнен из пластика, не стекла, он просто будет согнуть в обстоятельствах, когда бы разрушить традиционные оптических волокон. Потому что этот просветитель поставляет свет над томов (≈ 10 мм3) поведенчески соответствующие ткани с не больший ущерб проникновение, чем обычные оптические волокна, она облегчает поведенческие исследования с использованием Оптогенетика в нечеловеческих приматов.
Введение
Optogenetic инструменты, которые позволяют миллисекунды точный, ориентированное на свет нейрональных контроля широко используются для изучения функциональных физиологии и поведения в грызунов и беспозвоночных. Однако технические проблемы ограничили использование Оптогенетика в нечеловеческих приматов мозг, который имеет объем ~ 100 x больше, чем грызунов мозга 1.
Для облегчения исследования Оптогенетика в нечеловеческих приматов, просветитель был разработан для решения двух конкурирующих целей: большой объем освещения и минимальное проникновение повреждения. Предыдущие попытки решить одну из этих проблем прийти в дорогих другого. Пучки волокон освещения больших томов, но с увеличенным диаметром и, таким образом, ущерб2,3. Конические стекловолокон уменьшить ущерб проникновение, но узко фокус свет излучающих поверхностей < 100 µm2 4,5. Внешних мозга освещения через окно в Дура обходит проблему повреждения проникновения и может позволить для большого объема освещения, но он может использоваться только для несколько поверхностный мозг районах6.
Для создания большого объема, малый диаметр осветитель (рис. 1а), кончик пластиковой оптического волокна тепла конические и ядро и облицовки травления (рисунок 1bc). В отличие от других конические волокна, которые сфокусировать свет к узкой точки травления позволяет свету побег равномерно из стороны наконечника, таким образом, широко распространять свет на большой площади (рис. 1 de). Потому что ущерб проникновение пропорциональна диаметр проникновения, это светильник имеет не больше повреждения проникновения чем обычных волокна, но она имеет > 100 x светоиспускающей поверхности области и поставляет свет более широко с 1/100th силы света плотность в мозге Фантом (1,75% агарозном) (Рисунок 1e). Модель Монте-Карло (Рисунок 1f) иллюстрирует разницу в распространения света между обычными волокна и осветитель большой объем, когда они имеют равные силы света плотности как их светоиспускающей поверхности. Каждый прожектор индивидуально калиброванные, используя интегрирующей сферы (Рисунок 2a, b) для обеспечения распределения даже света вдоль кончик (рис. 2 c).
Этот большой объем осветитель протестирована с optogenetic манипуляции как поведение, так и нейронов стрельбы в нечеловеческих приматов. Длина волокна подсказка может быть настроен для любой области мозга и карты отдельных восприимчивы поле каждого животного. Осветитель может быть в паре с проникающей электрода для нейронов записей, которые охватывают продолжительность освещения. Кроме того потому что волокна могут носить любой цвет видимого света, это может быть сопряжено с любым из доступных optogenetic молекул доступны.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: все процедуры животных были в соответствии с руководящими принципами низ и были утверждены Массачусетский Институт технологии Комитет по животных уход.
1. осветитель изготовление
- использовать пару острых ножниц вырезать часть 250 мкм диаметром пластикового оптоволокна, по крайней мере 10 см больше чем длина желаемого общего осветитель.
- Удалить 15-20 см полиэтилена куртка из одного конца пластикового оптоволокна, используя зачистки проводов 22 манометрическое.
- Безопасного дистальной большинство 3-5 см раздели конца волокна в таблицу тиски струбцина.
- Проводят с рубашкой конце волокна тугой в одной руке с постоянный устойчивый тянуть. Волокно должно быть параллельно полу, перпендикулярно вице. Поддерживать этот постоянное напряжение на волокна на протяжении нагрева и охлаждения (шаги 1.5 и 1.6 ниже), так что волокна остается прямой и подтянутой, как его редеет.
- С помощью параметра низкий двойной температуры тепловые пушки (570/1,000 ° F), тепло лишил раздел волокна до тех пор, пока его разбавлять диаметром 60-100 мкм, или о диаметра человеческого волоса.
- Поддерживать постоянное напряжение на волокно позволяя волокна для охлаждения. Неспособность поддерживать напряженность может привести к волоконно виться.
- Подтверждают диаметр кончика разбавлять под микроскопом рассечения. Поочередно одно может использовать суппортов.
- Если не достаточно тонкие волокна, повторите шаги 1.4 через 1.6, необходимы для достижения желаемого наконечник диаметром.
- Необязательно если вновь потянув, положить небольшой знак в самой узкой части волокна, если он будет нагреваться снова, так что центр тепловой пушки целей в узкой части волокна.
- Если волокна слишком тонкий, начинать.
- После полного остывания волокна и был достигнут желаемый диаметр, щепотка волокна 3 см от узкой точки на обеих сторон. С быстро, острые тянуть вдоль оси волокна, отдельные стороны для создания конический наконечник.
- Изучить конический наконечник под малой мощности (например, 4 X) на рассечение микроскопа. Если кончик раздвоенной или курчавый ( Рисунок 1f), удалить волокна.
- Подготовка до etch конический наконечник, поместив кусок ленты лаборатории в конце кончика, оставляя последние 5 мм подвергаются. Кассету защищает волокна от травления выше желаемой длины светового излучения. Этот кончик длиной был выбран на основе толщина коры приматов в целевом регионе. Длиннее или короче длины могут быть включены в зависимости от желаемой длины освещения. Если длина кончика различные etch, края ленты лаборатории можно переместить ближе к или дальше от конический наконечник.
- Сложите малая (~ 1 дюйма x 2 дюйма) площадь 5 мкм кремния карбид доводочные листа между большим и указательным пальцами. Место кончике волокна между двумя сторонами доводочные листа и аккуратно etch волокна, используя небольшие круговые движения, как будто прокатки BB между большим и указательным пальцами. Таким образом, чтобы все стороны травленная равномерно часто поверните волокна. Появится подсказка волокна “ шероховатую ” невооруженным глазом в районах, которые травления, хотя ООН травлению областей обычно появляются гладкие.
- Повторите шаг 1.11 с 3 μm оксид алюминия, доводка листа.
- Прикрепите к разъему на конце осветитель напротив кончик травлению. Это позволяет осветитель для подключения к оптического кабеля или лазер.
Примечание: Этот метод отличается от метода предпочтительным для крепления стекла / кремнезема оптических волокон в втулки. Потому что металлическая обойма труднее, чем пластикового оптоволокна, полировка волокна и обойма как единица после склеивания может повредить пластикового оптоволокна как крошечные осколки металла, производимых в процессе полировки можно встраивать себя в расщепляется с плоским волокна.- Удалить около 5 мм полиэтилена куртка с противоположного конца осветителя, используя зачистки проводов 22 манометрическое.
- Вырезать в противоположном конце плоский с горячим ножом для сглаживания поверхности.
- Польский противоположном конце плоский с последовательно тонкой притирки листы: 5 мкм, 3 мкм, 1 мкм и 0,3 мкм.
- Вставить квартиру напротив конец-в обойма нержавеющей стали внутренний диаметр 260 мкм до тех пор, пока это заподлицо с концом обойма.
- Визуально подтвердить, что противоположный конец плавно и равномерно полируется с помощью микроскопа волокно.
- Снять обойма волокна и ленты обойма вертикально на краю таблицы с волокна, указывая вниз.
- Заполнить 1 мл шприц с пластиковой эпоксидной и прикрепить тупым 18 иглы шприца.
- Использовать иглы для применения эпоксидной вниз в обойма. Полностью заполнить обойма с эпоксидной.
- Вставить волокна в обойма.
- Любой избыток эпоксидной из полированной поверхности волокна протирайте влажной безворсовой стирание до сушки при необходимости. В противном случае, избыток эпоксидной могут быть удалены после 12-24 ч.
- Нежно хранить волокна до калибровки и место пылезащитный колпачок над обойма.
2. Осветитель калибровки и контроля качества
Примечание: эти методы для калибровки оценки для светоотдачи нелинейности на различных расстояниях от кончика волокна. Обычно результатом неравномерного распределения света “ неровной ” или “ волнистые ” конусом.
Диафрагма- создать легкие экранирование для верхней части интегрирующей сферы с использованием свет поглощающих фольги ( рис. 2).
Примечание: Надевайте перчатки, всякий раз, когда обработка свет поглощающих фольга для предотвращения кожи масла от создания света отражающей пятен.- Раза в 2 ” 4 ” кусок света поглощает фольги над на себя форму 2 ” x 2 ” кв. альтернативный метод является резать 2 ” x 2 ” площадь с одной свет поглощающих стороны и один свет, отраженный стороне (т.е. сторона стандартных алюминиевой фольги); Однако, метод диван за безопаснее, потому что он обеспечивает тупой край для обработки диафрагмы в следующем шаге.
- сложить лаборатории лентой или электрические по краям площади для связывания не сложить края. Это держит стороны вместе и защищает от порезов с острыми краями.
- Отверстие в центре площади, используя 26 иглы прокол.
- Удалить большой винт на колпачок из интегрирующей сферы и охватывают открытие с диафрагмой. Место отверстие по центру. Если диафрагма была создана с одним свет поглощающих и один свет, отраженный стороне, место свет поглощающих стороной вверх и светоотражающими стороной вниз, обращена внутрь интегрирующей сферы.
Примечание: Для предотвращения проникновения интегрирующей сферы пыли и мусора и держать отверстие по центру, защитить диафрагмы к внешней интегрирующей сферы лаборатории лентой.
- Мера легкий выход вдоль режущей 500 мкм с шагом с помощью микроманипулятор или стереотаксического руку и интегрирующей сферы в.
Примечание: Всякий раз, когда лазер на следует носить защитные очки соответствующие волны.- Подключите противоположный конец волокна лазерной или света источника, но не спровоцировать еще светоотдачу.
- Безопасный осветитель для стереотаксического держатель (preferably лаборатории лентой) с наконечником 7-10 мм ниже нижней части держателя.
- Винт держателя стереотаксического в стереотаксического arm.
- Совместите кончик осветитель с отверстием в центре диафрагмы. Нулевой микроманипулятор, когда кончик на точно том же уровне диафрагмы.
- Включить выключить свет номер и нулевой интегрирующей сферы.
- Активировать лазер (или другой источник света) и измерения общей силы света, выход с использованием шар Ульбрихта.
Примечание: Используйте низкие светоотдачи возможно для калибровочных испытаний. - Более низким волокна 500 мкм в интегрирующей сферы и повторите шаг 2.2.6.
- Продолжают снижение волокна в сфере интеграции и измерения общего светового потока в 500 мкм с шагом до выкл уровни общей силы света
Осторожностью: Общая сила света должна выравниваться после того, как весь кончик пера находится в сфере. Не продолжать снизить волокна более чем 1-2 мм травлению Совет длины. Если кончик контакты дне интегрирующей сферы, он может расплавить или разрушить интегрирующей сферы.
- Подтверждают равномерно травлению волокна путем построения всего света мощности как функция насколько волокна был снижен в сфере интеграции для подтверждения линейность.
3. в естественных условиях освещения
Примечание: здесь, эти методы указаны с использованием пластиковых моделей, вместо того, чтобы нечеловеческих приматов.
- Имплантат, 25 мм диаметр записи камеры был имплантирован над районом мозга интереса до экспериментов.
- Выполнять анатомические магнитно-резонансная томография (МРТ) до экспериментов. Поместите сетку настраиваемую запись в камере и заполнить его с стерильные хирургические смазка для визуализации сетки и определение уровня Дура и целевых структур мозга.
- Подготовить башня микро привод до каждой сессии тестирования.
- Аффикс 25 колеи направляющая трубка с скошенным наконечником для среднего и нижнего зажимы на диске. Два зажима используются для обеспечения прямой направляющей трубе. Оба эти зажимы могут быть вручную перемещены при желании.
Примечание: Направляющая трубка может быть epoxied или припаяна к зажимы. - Обеспечить большой объем осветителя в верхний зажим на одном диске. Этот зажим прилагается к приводной двигатель.
- Поток осветитель большой объем через направляющая трубка полностью и подтвердить, что кончик просветителя расширяет мимо кончик трубки руководство.
Примечание: Длина осветитель, который простирается прошлом кончик трубки руководство равна расстоянию от Дура к нижнему краю целевой области мозга, как определено через МРТ. - Замочить в антисептическим раствором (например, chlorohexidine) для стерилизации по направляющей трубе и осветитель.
- Аффикс 25 колеи направляющая трубка с скошенным наконечником для среднего и нижнего зажимы на диске. Два зажима используются для обеспечения прямой направляющей трубе. Оба эти зажимы могут быть вручную перемещены при желании.
- Место сетку пользовательских стерилизовать в чистой камере и закрепите его на предварительно указанный ориентации с помощью винта на стороне камеры. Сетка, показанный здесь имеет интервал 1 мм; Однако, интервалы могут быть настроены при необходимости.
Примечание: Это должно быть идентично сетки и ориентации, используемые в анатомические МРТ. - Обеспечения стереотаксической держатель микро привод на запись камеры в заранее определенной ориентации.
- Отозвать стерилизованные осветитель от направляющей трубе, потянув осветитель с помощью стерильных, тупой щипцами. Кончик осветителя должно быть 5-10 мм выше кончика трубки руководство.
Примечание: Осветитель поклонятся наружу между направляющей трубе и зажим. Это не повредит гибкий осветитель. - Аффикс микро привод для владельца и место направляющей трубе дыру целевой сетки.
- Нижняя стадию микро привода, до тех пор, пока направляющая трубка является просто через уровень Дура.
Примечание: При желании, второй микро привод с электрода может размещены на сцене и опускают в яму сетки. Местах, потенциал этого электрода покажет расстояни зависимая света артефакт, который может использоваться для подтверждения размещения осветитель. - Попытка нижний осветитель вручную стерильным пинцетом.
- Если есть любое сопротивление, отозвать просветителя 5 - 10 мм, подождите 10 минут, чтобы позволить ткани, чтобы урегулировать и повторите попытку.
- Если есть еще сопротивления во время второй попытки, отозвать кончик прожектор в трубу руководство, ниже руководство труба 0,25 мм и повторите попытку.
- Повторить до осветитель слайды через направляющей трубе без какого-либо сопротивления.
- Нижняя просветителя, до тех пор, пока это тугой.
Осторожностью: Не толкайте осветитель решительно против сопротивления. В этих случаях руководство трубки обычно не проникла Дура полностью. Насильственно толкает волокна приведет к его согнуть на себе, предотвращая волокна попадание мозга и возможно уничтожение кончик ( рис. 1 g).
- Обойма на другом конце осветителя больших Оптика, созданы или подключиться лазер.
- Убедитесь, что не свет виден в нечеловеческих приматов.
- Использовать защитные плотными или светло-поглощая фольгой, чтобы полностью охватить башни записи.
- Место все оптические соединения в экранированных конверты из света поглощает фольги.
- Щит все соединительные кабели с любой свет поглощающих фольги или черной изоленты.
- В качестве дополнительной предосторожности, место манок светоизлучающих диодов (СИД) Банк же светлый цвет, используемый в эксперименте за нечеловеческих приматов и флэш-светодиоды непрерывно на 2,5 Гц. Это предотвращает полной адаптации к темноте глаза. Если там были случайной утечки света, это мигающий свет поможет предотвратить утечки в качестве триггера поведенческих.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Свечение большого мозга томов в нечеловеческих приматов позволяет для поведенчески соответствующих optogenetic манипуляции. Экер и др. (2016) используется этот большой объем осветитель с красно смещается галородопсин, 7 челюсти для изучения временных вклад лобной глаз поля (ФЭФ) память руководствуясь саккад в двух макаках. В частности ФЭФ нейроны были вводят с вирусный вектор, содержащий челюсти и затем освещенной красным светом, используя осветитель большой объем во время целевой презент...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В то время как optogenetic инструменты широко используются для изучения болезни и физиологии в грызунов, техническую проблему освещающей томов большого мозга ограниченное использование Оптогенетика в нечеловеческих приматов. Пионерские исследования на обезьянах используется плотности большой мощности света (~ 100 МВт/мм2 до 20 Вт/мм2) для освещения небольших объемов, возможно < 1 мм3и сообщил скромный поведенческие эффекты с возбуждающим опсины в коре4,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
LCA отмечает, финансирование от стипендий NDSEG, NSF GRFP и друзей института Макговерн. EP признает Гарри и финансирования Юнис Nohara UROP фонд, MIT класса 1995 UROP фонда и Фонд UROP MIT. ESB признает, финансирование из низ 2R44NS070453-03A1, премия Харви МТВ и премии Фонда-Робертсон стволовых клеток Нью-Йорке. RD признает, финансирование из низ EY017292. Майкл Уильямс помог команде организовать и собрать поставок до съемок.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пластиковое оптическое волокно | Промышленное волокно | SK-10 | диаметр 250 микрон, Super Eska line |
| Стриппер для проводов | Klein Tools | 11047 | 22 калибр |
| Зажим тиски | Wilton | 11104 | Общий настольный зажим для тисков |
| Двойной температурный термофен | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1,000 ° F |
| Lab маркер | VWR | 52877 | |
| Диссекционный микроскоп | VistaVision | 82027-156 | Стереомикроскоп с двойным светом накаливания, увеличение 2X/4X, доступно из VWR |
| Lab лента | VWR | 89097-972 | 4 упаковки фиолетового цвета; однако цвет ленты не имеет значения |
| Лист притирочный из карбида кремния | ThorLabs | LF5P | 5 мкм зернистость, 10 упаковка |
| Притирочный лист из оксида алюминия | ThorLabs | LF3P | зернистость 3 мкм, 10 шт |
| Притирочный лист из оксида алюминия лист | ThorLabs | LF1P | 1 мкм зернистость, 10 шт. |
| Прокаленный глинозем притирочный лист | ThorLabs | LF03P | 0,3 мкм, 10 шт. |
| Горячий нож | Промышленная волоконная оптика | IF370012 | 60 Вт, сверхмощный |
| Эндоскоп | для осмотра волокнаThorLabs | FS201 | опционально |
| Наконечник из нержавеющей стали | Прецизионный волоконный оптика | MM-FER2003SS-265 | 265 микрон внутренний диаметр |
| 1 мл шприц | BD | 14-823-30 | Наконечник Люэр-лока предпочтительнее для снижения риска утечки, но не строго необходим |
| Пластиковая эпоксидная | промышленная волоконная оптика | 40 0005 | |
| 18 калибр тупой иглой | BD | 305180 | Салфетка длиной 1,5 дюйма |
| (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | доступна у многих поставщиков |
| Светопоглощающая фольга | ThorLabs | BKF12 | |
| Изолента | 3M | Temflex 1700 | Опционально, может заменить другие бренды / модели |
| 26 калибра острой иглой | BD | 305111 | длиной 0,5 дюйма |
| Микроманипулятор | Siskiyou | 70750000E | может заменить другие марки/модели |
| Steretactical | arm Kopf | 1460 | может заменить другие марки/модели |
| Лазерные защитные очки | KenTeK | KCM-6012 | должны быть выбраны в зависимости от цвета используемого лазера, пример приведен здесь |
| Лазер или другой источник света | vortran | Stradus 473-50 | пример синего лазера |
| Интегрирующая сфера | ThorLabs | S142C | Прилагаемый измеритель мощности, также доступный у ThorLabs, артикул #PM100D |
| Камера записи Ultem | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Индивидуальный с выравниванием выреза |
| Башня микропривода с зажимами | NAN | DRTBL-CMS | |
| Направляющая трубка | Пользовательский | Н/Д | Изготовлен из спинальной иглы (BD) 25 калибра или тупой трубки |
| Система драйвера | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | индивидуальные | планы доступны по запросу | |
| Тупые щипцы | FischerScientific | 08-875-8A | Общие тупые щипцы из нержавеющей стали |
| Цифровые штангенциркули | Neiko | 01407A | Доступно на amazon.com. Может выбрать штангенциркуль с более высоким разрешением для более точных измерений. |
| Патч-кабель | ThorLabs | FG200LCC-custom | Это один из многих возможных патч-кабелей. До тех пор, пока диаметр волокна меньше или равен диаметру волокна большого объемного осветителя и до тех пор, пока разъемы взаимодействуют, любой патч-кабель (стеклянный или пластиковый, купленный или изготовленный в лаборатории) подходит для этого приложения. |
| Прозрачные пластиковые пылезащитные колпачки | ThorLabs | CAPF | Упаковка из 25 |
| керамических разъемных ответных рукавов | Precision Fiber Products, Inc. | СМ-CS1140S |
Ссылки
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).
- Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
- Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
