Method Article

Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

DOI:

10.3791/56332

⸱

March 12th, 2018

 , 
1Pediatric Oncology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2BC Cancer Agency, Provincial Health Services Authority, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этой статьи заключается в том, предоставить подробное описание протокола для assay легочных метастазов (PuMA). Эта модель позволяет исследователям изучить метастатического остеосаркома (OS) рост клеток в легочной ткани, с помощью widefield флуоресценции или конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay легочных метастазов (PuMA) — ex vivo экспланта легких и закрытыми порами культуры система, которая позволяет исследователям для изучения биологии легких колонизации в остеосаркома (ОС) по микроскопии флуоресцирования. Эта статья содержит подробное описание протокола и рассматриваются примеры получения данных изображения на метастатическим роста, с помощью widefield или конфокальный флуоресценции микроскопии платформ. Гибкость Пума модели позволяет исследователям изучить не только рост клеток ОС в легких микроокружения, но и оценить эффекты анти метастатическим терапии с течением времени. Конфокальная микроскопия позволяет беспрецедентным, с высоким разрешением изображений ОС взаимодействия клеток с паренхимы легких. Кроме того когда модель PuMA сочетается с флуоресцентными красителями или генетические Репортеры флуоресцентный белок, исследователи могут изучить легких микроокружения, клеточном и субклеточном структур, функции гена и промоутер деятельность в метастатических OS клеток. PuMA модель обеспечивает новый инструмент для остеосаркомы исследователей для обнаружения новых метастаз биологии и оценить деятельность роман с метастазами, целенаправленной терапии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Улучшения результатов для педиатрических больных с метастатическим остеосаркома (ОС) по-прежнему остается критическим неудовлетворенный клинических 1. Это подчеркивает важность разработки новых молекулярно целевой терапии. Обычные химиотерапевтические, что целевой пролиферации клеток опухоли не доказаны, чтобы быть эффективным в лечении метастатической болезни и таким образом новые стратегии должны быть ориентированы самого метастатического процесса 2. В текущей статье рассматриваются практические аспекты относительно нового типа ex vivo легких метастазов модели, пробирного легочных метастазов (PuMA), разработанный Мендоса и коллеги3, который обеспечивает полезный инструмент в раскрытии новых молекулярные драйверы в легких метастазов прогрессии в OS 4,5. Прежде чем продолжить, однако, было бы целесообразно кратко затронуть несколько текущих моделей метастазов, и как PuMA модель предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычными в vitro assays.

Самые экспериментальные модели используются для изучения метастазов составляют in vitro и in vivo систем, которые охарактеризовать конкретный шаг или несколько шагов метастатического каскада. Эти шаги включают в себя: 1) опухолевых клеток, переход от первичной опухоли, 2) intravasation в близлежащих сосудов (кровь или лимфатическую) и транзита в циркуляции, 3) арест на дополнительный сайт, 4) кровоподтек и выживания на дополнительном сайте, 5) образование микрометастазы и 6) рост в васкуляризированной метастазов (рис. 1). В vitro модели метастазов может включать 2-мерной миграции (2D) и 3-мерные (3D) Matrigel вторжения анализов, которые рассматриваются в других местах подробно 6. Для моделей в естественных условиях , два часто используемых модель системы включают в себя: 1) спонтанное метастазов модель является, где опухолевые клетки orthotopically вводят в конкретных тканей типа сформировать местные опухоль, которая спонтанно проливает метастатического клетки в отдаленные места; 2) метастазов в экспериментальной модели является, где опухолевые клетки вводят в кровеносный сосуд, вверх по течению органа-мишени. Например хвост инъекции Вену опухолевых клеток приводит к развития легких метастазов5,7,8. Другие экспериментальные метастазов модели включают в себя инъекции опухолевых клеток селезенки или брыжеечных вен, что приводит в развитии метастазов в печени9,10. Уэлч 11подробно обсуждаются практические соображения в отношении этих моделей в естественных условиях . Другая модель в естественных условиях , используется для изучения метастазов в педиатрических сарком является модель имплантации подкапсулярный опухоли почечной функции почек, которая приводит в формировании местной опухоли и спонтанное метастазов легких 12,13. Технически более требовательных техники такие как прижизненной videomicroscopy могут непосредственно визуализировать, в режиме реального времени, взаимодействия между метастазами раковых клеток и microvasculature метастатического узла (т.е. легких или печени) как описано Макдональда14 и Entenberg15, или рак ячейки кровоподтек в chorioallantoic мембраны, как описано на Ким 16.

PuMA модель является ex vivo, тканях экспланта легких, закрытые культуры системы где флуоресцентные опухолевых клеток может быть продольно наблюдается рост через микроскопии флуоресцирования в течение месяца (см. рис. 2а). Эта модель воспроизводятся на начальных стадиях колонизации (шаги 3-5) легких в метастатических Каскад. Некоторые основные преимущества модели PuMA над обычными в vitro модели: 1) предоставляет возможность продольно измерять рост клеток метастатического рака в 3D микроокружения, который сохраняет множество функций легких микроокружения в VIVO 3; 2) puMA позволяет исследователю оценить ли нокдаун кандидат ген или наркотиков лечения имеет анти метастатического деятельности в контексте микроокружения 3D легких; 3 модель PuMA является гибкой со многими типами платформ микроскопии флуоресцирования (Рисунок 2B) как widefield микроскопии флуоресцирования или сканирование лазерная конфокальная микроскопия, приведены примеры каждого из них в рисунке 2 c и D, соответственно. Этой статье мы обсудим, как использовать модель PuMA для получения продольной визуализации данных на метастатический рост расширенной зеленого флуоресцентного белка (eGFP)-выражая, клетки человека высоких и низких метастатического остеосаркома (МННГ и HOS клеток, соответственно) с помощью низкий увеличение widefield флуоресценции. Также обсуждаются примеры изображений Люминесцентную краску, которая этикетки паренхимы легких и красный флуоресцентный белок, которую генетических репортер, который этикетки митохондрий в OS клеток в Пума модели с помощью конфокальной микроскопии лазерное сканирование.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы животных, от которых были получены визуализации данных выполнялись с одобрения животное уход и использование Комитета национального института рака, национальные институты здравоохранения. Все животные протоколы обсудили и изображается в статье видео были утверждены Комитетом животных ухода Университета Британской Колумбии.

1. Подготовка опухолевых клеток для инъекций и материалы для Пума модели

Примечание: Количество решений и клетки будет достаточно для мыши. Масштабирование при необходимости, если в исследовании используются больше мышей. Для СМИ рецепты обратитесь к таблице 1 и таблице 2.

  1. Предварительно теплой 5 мл A-СМИ в 15 мл конические пробки на 37 oC на водяной бане.
  2. Расплава 1,2% низких плавления агарозы решения (в стерильной воде) с помощью микроволновой лаборатории.
  3. Передача 5 мл расплавленный агарозы в 15 мл Конические трубки и держать в тепле на 37 oC водяной бане. Убедитесь, что на 37 oC и жидкости до легких инсуффляции шаг растопленным агарозы.
  4. Предварительно охладите 30 мл культуры клеток класса PBS, дополнены 1 Х перо/воспаление в ведёрке со льдом.
  5. В одной скважиной 6-ну плиты, предварительно Замочите желатин губку в 1,5 мл B-медиа. Губка будет поддержки привязки для легких ломтиками.
  6. OS клетки обеспечивают около 70-90% вырожденная в день процедуры. Не используйте клетки, которые являются чрезмерного притока или если средства массовой информации является оранжевый желтый, поскольку клетки обычно подчеркнул и уменьшились жизнеспособность на данный момент. Для остеосаркомы клеточных линий, МННГ и ХОС, 5 x 105 в объеме 100 мкл будет использоваться для вставки в духе хвост мыши. Высококлассные соответственно если больше мышей, используются для изучения.
  7. Урожай опухолевых клеток с помощью 0,25% трипсина ЭДТА (3 мл для T75 колбу или 2 мл в 10 см культуры блюдо). Когда клетки начинают поднимите пластину, нейтрализовать трипсина ЭДТА с полной СМИ. Спин вниз клетки и один раз промыть культуры клеток класс PBS. Ресуспензируйте Пелле в 5 мл ФСБ.
  8. Выполните подсчет клеток стандартными методами. Это лучше сделать более суспензию клеток, чем на самом деле необходима, поскольку потеря суспензию клеток часто происходит во время игла дро вверх и неудавшиеся попытки инъекции.
  9. Выполните Assay исключения Трипановый синий на выборке из суспензии клеток оценить жизнеспособность клеток. Только если ячейка Показать жизнеспособность 90% или выше.
  10. Придать 5 x 105 клеток в объеме 100 мкл. Подготовить избыток 2 X этой суммы, 1 x 106 клеток должны вращаться вниз и высокомобильна в 0,2 мл HBSS.
  11. Место суспензию клеток в ведро льда при подготовке мышей для инъекций.

2. хвост инъекции Вену и легких инсуффляции

Примечание: Количество решений и клетки в этом разделе будет достаточно для мыши. Масштабирование при необходимости, если в исследовании используются больше мышей. Список оборудования, материалов и хирургических инструментов, используемых в следующих шагов обратитесь к таблице 3 и таблице 4.

  1. Теплый женского мышь (возраст 6-8 недель) под лампой Отопление для 5 минут для того, чтобы сделать их хвост вен более явно очевидной. Для мышиных K7M2 или K12 ячеек используйте мышей Balb/c; для клеток человека MG63.3, MG63, МННГ и ХОС используйте тяжелый комбинированный иммунодефицит мышей.
  2. Убедитесь, что форма суспензию клеток, осторожно встряхивая трубки. Тщательно составить суспензию клеток в 1 мл шприц без иглы. Колпачок шприца с 27 манометра. Убедитесь, что скос иглы находится на той же стороне как объем маркировку на иглу.
  3. Поместите указатель мыши в фиксатор и хвост с алкоголем протрите тампоном.
  4. Перейдите к выполнить инъекции Вену хвост и залить 100 мкл суспензии клеток. 5 мин после инъекции, поместите указатель мыши в камере2 CO и начать Стандартная операционная процедура эвтаназии (как план институционального ухода за животными Комитетом). Шейки матки вывих не должны использоваться как средство эвтаназии, поскольку процедура будет повредить трахею.
  5. После того, как мышь умерщвлены, начните подготовку Ламинарный шкаф для инсуффляции мыши легких с агарозы/A-медиа-решение. В пределах Ламинарный шкаф настроить рабочую зону с стерильных площадку. На эту площадку место стерилизованные инструменты, IV катетер, IV расширение набора и тяжести перфузии аппарата (см. дополнительный рисунок 1).
  6. Поместите указатель мыши в спинной recumbancy. С небольшой стерильными ножницами тщательно анализировать из грудины подвергать грудной полости. Позаботьтесь, чтобы не прокола легких, поскольку агарозы/A-медиа-решение будет использоваться для insufflate легких.
  7. Когда вскрывали из грудины, вскрыть мимо грудной входе на обеих сторонах трахеи. Предоставить трахеи, пройдя от окружающих мягких тканей.
  8. Иглу трахеи с катетером IV 20 калибра. Слабо завязывайте хирургический узел с помощью шовный материал стерильный кетгут вокруг канюлированной трахеи.
  9. Прикрепите IV расширение набора из catheterized трахеи шприц 10 мл аппарата перфузии гравитации.
  10. Объедините подогретым 37 oC агарозы (5 мл) и A-медиа (5 мл) в смесь 1:1. Залейте жидкий раствор агарозы/A-СМИ в шприц 10 мл тяжести перфузии устройства. До инсуффляции легких с агарозы/A-медиа решения убедитесь, что по всей длине расширение набора был заливают агарозы/A-средства массовой информации, тем самым отрицая случайного инсуффляции образцов легких воздухом.
  11. До тех пор, пока полностью интраназально легких, заполните легких агарозы/A-медиа-решение.
  12. После легких полностью интраназально, удалить канюлю и твердо галстук с хирургический узел для предотвращения утечки agarase/A-медиа решения через трахею.
  13. Перейти к вскрыть вне общипывает (трахеи, сердца и легких) из грудной полости. Будьте осторожны, чтобы не прокола или повредить поверхность легких.
  14. Место шайбу (в никакой конкретной ориентации) в предварительно охлажденные 30 мл PBS с 1 Х перо/воспаление и позволяют агарозы/A-СМИ закрепить за 20 мин.
  15. С помощью тонкой ножницы и щипчики, вырезать кусочки легких (3 x 1,5 мм), как показано на рисунке 1A. Небольшие кусочки легких может быть легко imaged с использованием 2,5 X цель. Несколько фрагментов можно резать на экспериментальные условия, как правило 4-10 ломтиков каждой группы.
    Примечание: Для каждой экспериментальной группы, место ломтики легких в отдельную скважину (6-ну Латы) содержащий губкой желатин 2 x 2 см, предварительно смоченной в B-СМИ. Количество средств массовой информации за хорошо должна быть 1,5 мл. Измените СМИ каждые 2-3 дня. Для исследования наркотиков частота смены СМИ/наркотиков является определяется пользователем.

3. Widefield флуоресценции томографии легких ломтиками и анализа

Примечание: Для флуоресценции widefield изображений, небольшие фрагменты разрезают (3 x 1,5 x 1 мм) чтобы уместить в разделе легких в 1 изображение с использованием 2,5 X цель.

Приобретение изображений на widefield флуоресцентным микроскопом:

  1. Кусочки легких обычно отражаются на 0, 3, 7 и 14 дней после инъекции. В стерильных условиях биологического кабинета, тщательно передачи легких фрагменты из желатина губки для стерильных 35 мм стекло дно раунд блюдо. Позаботьтесь, чтобы тыкать от лишней жидкости из легких среза как лишнюю жидкость будет действовать как зеркало и отражают флуоресцентный свет, исходящий от опухолевых клеток.
  2. Устройте ломтики легких в подобной манере, изображенные на рисунке 1A. Различные экспериментальные Условие будет представлять каждый столбец. Позаботьтесь, чтобы не кросс загрязнять легких с помощью пинцета. Промойте с 70% этанола и просохнуть легких фрагменты из другой экспериментальной группы.
  3. Оптимизировать параметры обработки изображений (т.е. усиление, смещение, воздействие время, биннинг) которая обеспечивает лучший контраст между флуоресцентные опухолевые клетки и ткани легкого фона в элементе управления (автомобиль не лечить) группы. Используйте те же параметры из контрольной группы для изображения экспериментальной группы. Сохраните в формате tiff изображений.
  4. Для ссылки на шкале сфотографируйте цифровые микрометра на той же цели.
  5. Поскольку легких авто флуоресценции изменяется с течением времени, изображений параметры должны быть скорректированы в легкие управления изображений каждой сессии. Изображений параметры для одной сессии может не обязательно быть оптимальной для последующих сессий изображений.

Анализ изображений:
Примечание: Следующие шаги обработки изображения сделаны с ImageJ 1.51h программного пакета 17.

  1. Откройте файл изображения в ImageJ (рис. 3A).
  2. Вычитание фона: процесс > вычитание фона > Rolling шар радиуса (начать с 50 пикселей), снимите флажок «Свет фон» (рис. 3B).
  3. Конвертируйте изображение в формат 8-битный: изображение > тип > 8 - бит (рис. 3 c).
  4. Значение единицы пикселей: изображение > Ввод «Пиксели» в единицу длины, введите 1 в «Пикселей в ширину», «Пикселей высота», «Voxel». Установите флажок «Глобальные» для применения к последующим изображениям.
  5. Используя инструмент выделения многоугольник, наметить форму срез всей легких и определить области (2пикселя) всего легкого фрагмента. Это значение будет использоваться для вычисления бремя процент опухоли легких.
  6. Порог изображения: изображение > Настройка > порог > голы «По умолчанию» и «B & W» > Используйте бегунок порог изображение таким образом, что большинство клеток тумора точно выделяются. Нажмите «Применить» приведет к черно-белое изображение, где легкя все черные, и белые флуоресцентные поражения (рис. 3D). Нажмите «Применить» во второй раз будет инвертировать изображение, где все флуоресцентные структуры в настоящее время черные фигуры (Рисунок 3E).
  7. Количественная оценка числа и формы поражения:
    Анализировать > задать измерения > проверить «Район». Снимите все другие флажки.
    Анализ частиц > Размер (2пикселя): 0-бесконечность представляет диапазон фигур, которые ImageJ будет перечислять. Эмпирически определите наименьший поражение, которое считается один опухолевых клеток в день 0 транспортного средства изображения. Используйте область этого единого опухолевых клеток как нижний предел для остальных изображений в наборе данных. Для работы, представленные в настоящем документе 11 пикселей2 устанавливается как нижнего предела. Для работы, представленные в пример видео 24 пикселя2 устанавливается как нижнего предела. Оставьте «Округлость» диапазон 0-1. «Показать» может быть присвоено «Ничего». Кроме того Если выбран параметр «Показать» и «Кривые», создается рисунок всех контурных фигур. Проверьте «Display results» на отдельном окне измерений всплывал. При необходимости имея флажок «Добавить в Диспетчер» сохранит все фигуры, количественно рентабельность менеджеру, который можно сохранить для будущей справки. После нажатия OK, появится окно «Результаты» содержащие всех перечисленных форм и области измерений (Рисунок 3F).
  8. Скопируйте и вставьте данные из окна «Результаты» в электронную таблицу. Использование математической функции SUM в Excel для суммирования всех областей метастатического поражения для этого конкретного легких фрагмента. Чтобы оценить процент легких бремя опухоли легких фрагмента, разделите сумму областей метастатического поражения, Общая площадь легких фрагмента. Этот параметр также называется области фракция (A), которая описана далее Андервуд 18.
    Опухоли легких бремя = сумма метастатического поражения областей/общей области легких ломтик
  9. Рассчитайте бремя опухоли легких для остальной части легкого секций в контрольной группе и остальных групп. Участок 0, 3, 7 и 14 дней средняя легких опухоли бремя на группу. Представитель widefield флуоресцентные фотографии высоких и низких метастатического клеток человека OS, растущих в Пума модели прогрессивного время точках показаны (рис. 4A). Линия график, показывающий фолд изменения (нормализованное день 0) в процентах метастатические опухоли бремя со временем показано (рис. 4В).

4. конфокальный флуоресценции изображений модели PuMA

Примечание: Для конфокальная томография, обработка ткани похож на, в предыдущем разделе за исключением того, что более легких ломтиками вырезаны (полной поперечной секции, толщиной 1-2 мм) для более трансформирования к записи образа.

Маркировки паренхимы легких с DAR4M:

  1. Погрузить кусочки легких в 10 μμM DAR4M (в HBSS) 45 мин при температуре 37 ° C. DAR4M этикетки химически активные разновидности азота в клетках легких.
  2. После 45 минут инкубации промывайте ломтики легких с свежими HBSS.
  3. Место среза легких в 35 мм стекло дно вокруг блюдо и изображение на confocal микроскопа.
  4. В таблице 5перечислены изображений параметры для изображений пример, показанный на рисунке 5 .
  5. Приобрести Z-стек для региона интерес. Используйте предлагаемые толшины Z для выборки Найквиста. Представитель фильм 3D стека показаны Зеленый флуоресцентный OS клетки в DAR4M-меченых легочной ткани содержится в 1 кино и Дополнительные фильм 1.

Для примера конфокальный изображений показано на рисунке 5изображений сессии был терминала. Если требуется продольной томографии, использование 2-Фотон или несколькими Фотон оборудованный конфокальный LSM микроскопа для изображений рекомендуется так как есть меньше фотоповреждения жизни тканей19,20.
Imaging mito-RFP выражая MG63 клетки в Пума модели:

  1. Выполните протокол PuMA наброски в шаге 1 и 2 с использованием клеток MG63, выражая mito-RFP конструкции.
  2. Место среза легких в 35 мм стекло дно вокруг блюдо и изображение на confocal микроскопа.
  3. В таблице 6перечислены изображений параметры для изображений пример, показанный на рисунке 6 . Представитель фильм 3D стека, показывая Зеленый флуоресцентный OS клетки с красным, флуоресцентный митохондрий предоставляется в кино 2 и Дополнительные фильм 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Низкий увеличение widefield микроскопии флуоресцирования

Для widefield микроскопии флуоресцирования PuMA легких срезов представитель изображения и количественной оценки данных приводятся в Рисунок 2 cи Рисунок 4A и B. Метастатическим склонности для высокой и низкой метастатического клеточных линий визуально очевидны над время п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие технические статьи описывает некоторые практические аспекты модели PuMA в изучении легких колонизации в OS. Некоторые важнейшие шаги в протоколе, где исследователи должны проявлять особую осторожность, включают следующее:

) катетеризации трахеи. Трахеи могут быть легко повреждены во время рассекает окружающих мышц и соединительной ткани. Кроме того иглы катетера может быть легко толкнул через трахею. Уделять пристальное внимание как скос иглы входит трахеи при вставке канюли.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить доктора Арнульфо Мендоса, который обеспечивал подготовку в технике PuMA. Кроме того мы хотели бы признать Drs. Чанд Кханна, Сьюзен Гарфилд (NCI/низ) и Сэм Апарисио (до н.э. Рак Агентство) для обеспечения использования их микроскопов в ходе этого исследования. Это исследование было поддержано (частично) интрамуральных исследовательской программы национальных институтов здравоохранения, центр для исследований рака, отделение детской онкологии. M.M.L. была поддержана национальной институтов из интрамуральных посещения сотрудник программы здравоохранения (премия 15335) и в настоящее время поддерживается Джоан Паркер стипендий в исследованиях метастазов. Британской Колумбии рак Фонда поддерживается P.H.S..

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Table 2
Cell Culture реагенты для A-сред, B-сред и полных сред
MNNG-HOSATCCCRL-1547высокометастатическая клеточная линия
OSATCCCRL-1543слабометастатическая клеточная линия
OS MG63.3Amy LeBlanc Laboratory (NCI)Н/Авысокометастатическая клеточная линия ОС
MG63ATCCCRL-1427слабометастатическая клеточная линия ОС
10X M199 средаThermofisher11825015Базовая среда для А-среды и В-среды
Дистиллированная вода (стерилизованная)Thermofisher15230-147Компонент А-среды и В-среда
7,5% раствор бикарбоната натрияThermofisher25080094компонент А-среды и Гидрокортизон B-медиа
Sigma-AlrichH6909Компонент A-среды и B-media
Ретинол ацетат-водорастворимыйSigma-AlrichR0635-5MGКомпонент A-среды и B-среда
Пенициллин/стрептомицин 10X концентрированный (10000 Ед/мл) растворThermofisher15140122компонент А-среды и B-media, полноценная среда.
Раствор бычьего инсулина (10 мг/мл)Sigma-AlrichI0516-5MLКомпонент А-среды и B-media
DMEM, с высоким содержанием глюкозыThermofisher11965092Базовая среда полной среды
L-глутамин (200 мМ)Thermofisher25030081компонент полной среды
Фетальная бычья сывороткаThermofisher16000044компонент полной среды
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буферThermofisher14190144используется в клеточных культурах.
Хэнк s Буферизованный раствор солей, без кальция, без магния, без фенола красногоThermofisher14175095Используется для ресуспендирования клеточных гранул перед инъекцией
Трипсин-ЭДТА (0,25%), феноловый красныйThermofisher25200114Используется в клеточной культуре.
DAR4MEnzoALX-620-069-M001Используется для маркировки паренхимы легких.
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Таблица 3>
Материалы для PuMA
Zeiss 710 Конфокальный LSMZeissN/AВертикальный конфокальный LSM микроскоп
Zeiss 780 Конфокальный LSMZeissN/AИнвертированный LSM конфокальный микроскоп
SCID мышиCharles RiverN/ANOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, женщина, возраст 6-8 недель
GelFoamHarvard Apparatus59-9863Используется в качестве поддержки для участков легочной ткани.
SeaPlaque AgaroseLonza50100Используется во время инсуффляции легких.
Шприц 1 мл с иглой 27 калибраFisherscientific14-826-87Используется для инъекций в хвостовую вену.
Шприц 10 млBD309604Используется для инсуффляции легких.
Катетер 20 калибраTerumoSR-OX2032CAИспользуется во время инсуффляции легкого.
Набор для наращивания Abbott IV (30", стерильный)Medisca8342Используется во время инсуффляции легкого.
Спиртовые тампоныBD326895Для протирания хвостовой вены перед инъекцией
Стерильные хирургические перчаткиFisherscientificВарьируются в зависимости от размераАскептическое обращение с мышиными легкими
30 см ЛинейкаСкобыИспользуются для инсуффляции легких.
Опорная подставка для линейкиPipette.comHS29022AИспользуется для инсуффляции легкого.
Чашка для культуры со стеклянным дном 35 ммIbidi81158Используется при визуализации срезов легких
Абсорбирующие пеленки с водонепроницаемым влагозащитным барьеромVWR56617-014Используется для выравнивания стерильной рабочей зоны в биологическом колпаке.
Кетгут Простой рассасывающийся шовный материалBraunN/AИспользуется для перевязывания канюлированной трахеи.
НазваниеCompanyНомер в каталоге>Комментарии
Таблица 4
Хирургические инструменты для PuMA
Диссекционные ножницы 3,5" Прямой острый/SharpRobozRS-5910Для резки срезов легких
4" (10 см) Длинный зубчатый прямой экстра деликатный наконечник 0,5 ммRobozRS-5132Для манипуляций/удержания участков легких.
4" (10 см) Длинный зубчатый небольшой изогнутый наконечник 0,8 ммRobozRS5135Для манипуляций/удержания участков легких.
щипцы для перевязки большого пальца; Зубчатый; Нежный; Длина 4,5 дюйма; Ширина наконечника 1,3 ммRobozRS-8120Для общего рассечения.
Щипцы для повязки большого пальца 4,5" зубчатый 2,2 мм Ширина наконечникаRobozRS-8100Для общего рассечения.
Сверхтонкие микродиссекционные ножницы 3,5 дюйма Прямые Острые/Острые, лезвие 20 ммRobozRS-5880Для общего препарирования.
Ножницы Кнаппа; Прямой; остро-тупой; Длина лезвия 27 мм; 4" Общая длинаRobozRS-5960Для общего препарирования.
Micro

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
  2. Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
  3. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  4. Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
  5. Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
  6. Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
  7. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  8. Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
  9. Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
  10. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  11. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  12. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
  13. El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
  14. MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
  15. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  16. Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
  19. Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
  20. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  21. Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  22. Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
  23. Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
  24. Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
  25. Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pulmonary Metastasis AssayOsteosarcoma Lung ColonizationMetastatic Osteosarcoma CellsLung MicroenvironmentFluorescence MicroscopyImage AnalysisConfocal MicroscopyWidefield MicroscopyLung Tissue PreparationTumor Cell Quantification

Related Articles