Методическая статья

Условное нокдаун экспрессии генов в рак клеточных линий для изучения набора моноцитов/макрофагов в микроокружения опухоли

DOI:

10.3791/56333

⸱

23 ноября 2017 г.

 , 
1Division of Hematology, Oncology and Blood and Marrow Transplantation, Department of Pediatrics, University of Southern California, 2The Saban Research Institute of Children's Hospital Los Angeles, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Southern California

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол служит схема для создания функциональной системы тет-ON в линии клетки рака и его последующего использования, в частности для изучения роли опухолевых клеток, полученных белков в наборе моноцитов/макрофагов в микроокружения опухоли.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

siRNA и индуцируемый опосредованной сбить (KD) методы регулирования экспрессии генов имеют неоценимое значение для понимания функции генов и белков. Однако в случае что KD протеина интереса имеет летальный эффект на клетки или ожидаемого эффекта KD время зависимых, безусловный KD методы не подходят. Условное системы являются более подходящими в таких случаях и были предметом особого интереса. К ним относятся экдистероидов индуцибельной гиперэкспрессия систем, индукция цитохрома P-450 системы1, и тетрациклин регулируемых системах выражения гена.

Тетрациклин регулируется ген выражение система позволяет обратимого контроля над выражение протеина путем индукции индуцируемый выражения присутствии тетрациклин. В этом протоколе мы представляем экспериментальный дизайн, с использованием функциональной системы тет-ON в человеческих раковых клеток линии для условного регуляцию экспрессии генов. Мы затем продемонстрировать использование этой системы в исследовании опухолевых клеток Моноцит взаимодействия.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опухоль связанных макрофагов (ТАМС) способствуют развитию опухоли путем поощрения роста опухоли, метастазы и регулирование иммунный ответ2. Раковые клетки набирать воспалительных моноцитов, которые проникновения опухоли и дифференцироваться в про онкогенной ТАМС3. Инфильтрация опухоли с ТАМС коррелирует с плохой клинических исходов и был связан с иммуносупрессивной роли макрофаги4,5. Однако не хорошо изучить механизмы вербовки макрофагов к опухоли и лучшего понимания путей, участие имеет решающее значение для дальнейшего развития области и перспективных методов лечения. Одной из задач в изучении взаимодействия между раковые клетки и нормальные клетки в микроокружения опухоли (ТМЕ) является сложность механизмов и клеток, участвующих, требующих в vitro подходы, которые позволяют рассечение перекрестных помех. Здесь мы представляем универсальный методологии, которые могут быть применены для изучения паракринными эффект клеток рака, секретируемые белки на миграции других типов клеток как макрофаги, в пробирке. С помощью системы, где выражение индуцируемый против рака клеток, полученных белка участвуют в вербовке моноциты находится под контролем промотора индуцибельной тетрациклин, предел паракринными эффект секретируемые белки на моноцитов. В этом протоколе клонирование индуцируемый последовательностей в тетрациклинового ряда, которые представлены регулируемых вектор следуют поколение стабильной рак клеточных линий. Кроме того очистка первичного человека моноцитов и пробирной палаты Бойден, используются для анализа паракринными эффект рака-производных белков на миграцию моноцитов.

Даунрегуляция кодирование генов белка обычно применяется с siRNA и индуцируемый методы, хотя и не без ограничения его использования. Долгосрочный НОК Даун (KD) генов может выявить вторичные Адаптивная реакция клеток, которые мешают экспериментальные результаты. Отсутствие временных контроля над экспрессии генов делает его сложным для изучения динамических роли белка течением времени или роли белка, решающее значение для выживания клетки. Эта проблема особенно важна в настройках в естественных условиях , где роль белка в развитие опухоли и прогрессии может потребовать Даунрегуляция выражения протеина интереса, только после того, как создан опухоли. Условное KD обладает преимуществом предотвращения слишком ранних летальный эффект KD на клетки и для анализа роли белка в различных стадиях опухолевого роста, в то время как безусловное KD может привести в отсутствие развития опухоли.

Ряд условных KD систем были разработаны для устранения ограничений стабильной KD. Системы выражение условного генов включают экдистероидов индуцибельной гиперэкспрессия системы, системы цитохрома P-450 индукции1и тетрациклин регулируемых системах выражения гена. Тетрациклин регулируется генов системы выражения позволяют контролировать выражение индуцируемый после добавления антибиотик Тетрациклин (или его более стабильным аналогом - Доксициклин). В системах тет-ON, выражение индуцируемый индуцируется в присутствии тетрациклин/доксициклин, что приводит к экспрессии генов KD, находясь в Тэт-OFF систем, выражение индуцируемый подавляется присутствии тетрациклин, что приводит к экспрессии генов. Недостатком тетрациклин индуцибельной системы является сообщалось ранее низкий уровень экспрессии индуцируемый в отсутствие доксициклин - так называемые негерметичности6,7. В Тэт-ON системы описано здесь, после отправления тетрациклин, связывание конститутивно выраженной тетрациклин репрессор (тетр) белка в тет отзывчивым последовательности элемент (TRE) в рамках H1, промоутер регион индуцируемый интерес подавлено. Это приводит выражение индуцируемый и ингибирование перевода протеина интереса в обнаруживавшие тетрациклин8,9.

Другие доступные тет-ON системы включают в себя одновременное забивные Тето последовательности между Тата поле и элемент проксимальной последовательности (PSE) и Тата коробки и транскрипции запустить сайт, разработанный Чан и др. 10 эта система требует меньше токсических доз тетрациклина регулировать индуцируемый выражения, однако, под-индуцированной государства, низкий уровень индуцируемый выражаются. Krüppel связанное поле (краб) на основе системы Тет-д11 включает в себя краб, цинковый палец белка, который субъектов гены расположены в диапазоне 3 КБ краб привязки сайта transcriptional подавления. Химерных белка tTRKRAB можно связать Тето, и из-за большого спектр ДНК контролируемый потенциала, Тето не должны ограничиваться между транскрипции начать сайта и промоутер и имеют низкое воздействие на активность промоутер. Под-индуцированной государства этой управляемой системы вмешательства РНК, как сообщается, показывают более низкий уровень экспрессии утечка индуцируемый11,12; Однако это требует последовательных, два вектор клонирования подход. По сравнению с ранее разработанной условного KD систем, таких как экдистероидов индуцибельной гиперэкспрессия системы или системы индукции цитохрома P-450 тетрациклин регулируемые системы имеет преимущество его надежности и обратимости и поэтому наиболее широко используется система13. Системы, используемые в настоящем Протоколе имеет преимущество перед двойной Тето забивные системы и системы краб тет-ON, как это требует прямо вперед, единый вектор клонирования, позволяя быстро поколения несколько клонов, и он имеет очень низкий уровень утечки в отсутствие доксициклин.

TME имеет решающее значение для развития рака. Для облегчения роста опухоли, раковые клетки набирать воспалительных моноциты секретирующих белков эозинофилов. Набранных моноцитов проникновения опухоли и дифференцироваться в про онкогенной ТАМС, влияющих на рост опухоли и метастазов. В vitro исследования вербовки иммунных клеток использовать анализов миграции, с Бойден Пробирной палаты, широко используется14,,1516,17. В этот assay хемотаксического источник белка, например, раковые клетки, или очищенный протеин, помещается в нижней камере. Иммунные клетки находятся в верхней палате разделены с пористые мембраны из отсека снизу. Перенос в сторону увеличения градиента хемотаксического, и тех, кто находится на нижней стороне мембраны клеток окрашенных и рассчитывает под микроскопом. Здесь мы тестируем хемотаксического функция 1 ингибитора активатора плазминогена (PAI-1) на моноцитов, создавая стабильные, индуцибельной рак клеточных линий, где выражение PAI-1 регулируется доксициклин сложения. Мы используем человека первичной моноцитов в Бойден Пробирной палаты миграции для оценки роли PAI-1 в Моноцит миграции. Различия между человека первичной моноцитов и широко используемым monocytic клеточных линий как THP1 поступили и включают различные цитокины выражение шаблоны18; к примеру 5-10 раз повышение уровня ФНО α выражение клетками THP1 по сравнению с человека моноциты19. THP1 клетки являются производными от monocytic клеток человека лейкемии, легко поддерживать и размножаться в среднем время 19-50 h20удвоения. Напротив человека моноциты характеризуются короткий срок при отсутствии факторов роста. Так как моноциты очищаются от крови доноров, изрядное количество изменчивости происходит среди людей и в зависимости от метода очистки может произойти загрязнение с другими типами клеток. Тем не менее основной моноциты имеют отношение и рекомендуется использовать или подтвердить результаты, полученные с monocytic клеточных линий, с помощью первичных моноцитов в биологических исследований19. Здесь мы описываем протокол для очистки человека первичной моноцитов в периферической крови. Альтернативные методы очистки Моноцит включают плотность градиента и адгезии протоколы и два шага процедуры с одной градиенты Ficoll-Hypaque следуют градиента Percoll21. Чистота Моноцит населения, полученные от этих методов колеблется от 70-90%. Метод, описанный здесь использует градиент плотности, следуют отрицательные иммунной выбор22 и позволяет очищению человеческого моноциты без прямого контакта с антителами, тем самым избегая их случайной активации и в результате > 95% чистой населения моноцитов.

Для создания функциональной системы тет-ON для экспрессии генов KD в человеческих раковых клеток линии используется протокол, представленные здесь для изучения эффекта хемотаксического рак производные выделяется белка PAI-1 на моноцитов. PAI-1 оверэкспрессировали разнообразные опухоли и ее выражение парадоксально коррелирует с плохой клинических исходов23,24. Про онкогенной роли PAI-1 является результатом ее про ангиогенных и анти apoptotic функции25,26. PAI-1 было показано вносить воспаление путем поощрения найма макрофаги на сайт воспаления27. PAI-1 было показано для содействия гладких мышц cellmigration28,29 и участвовать в Mac-1 зависимых макрофагов миграции30. Гиперэкспрессия PAI-1 также показало значительно повысить набора сырой 264.7 макрофагов в B16F10 меланома опухоли31. Однако роль PAI-1 в TAM миграции не были расследованы в деталях. Мы используем описать протокол для ответа на вопрос о ли PAI-1 привлекает моноцитов в раковые клетки. Эта методология позволяет рассечение перекрестных помех между опухолью и TME глушителей секретируемые белки в раковых клетках и анализируя компоненты ТМЕ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В разделе протокол, использующий человека моноцитов, полученные от здоровых добровольцев руководящими Детская больница Лос-Анджелеса человека исследований Комитета по этике и был одобрен Советом по рассмотрению институциональных рамках человеческого материала Протокол номер: CCI 08-00208.

1. Подготовка линий клеток рака с регулируемой тетрациклин индуцируемый выражение

  1. Клонирование индуцируемый PAI-1 в Тэт pLKO-puro вектор 8 , 9
    1. Дизайн-индуцируемый олигомеров, которые содержат возрастя и экори расщепления сайте ' конец 5, смысл последовательности, цикле 6 нуклеотидов и антисмысловых последовательности.
      Примечание: Типичный олигонуклеотиды предназначены следующим: вперед oligo: 5' CCGG - 19-21 bp смысле - CTCGAG - 19-21 bp antisense - TTTTT, обратный oligo: 5' AATTAAAAA-19-21 bp смысле - CTCGAG - 19-21 bp antisense 3'. Подробный протокол для олигомера дизайна можно найти в 8. В этом исследовании 3 индуцируемый последовательности против PAI-1 были протестированы для сильных глушителей эффект: индуцируемый 132, индуцируемый 2, индуцируемый 333и кинулись33 включены в таблице 1.
    2. Отжиг индуцируемый олигомеров и кинулись индуцируемый олигомеров.
      1. Воссоздания олигонуклеотиды до 100 мкм в воде и смешать 1 мкл вперед олигонуклеотида, 1 мкл обратный олигонуклеотида и 8 мкл H2O.
      2. Для отжига олигонуклеотиды, смешать следующее: 1 мкл олигонуклеотида смесь, 5 мкл буфера 10 мм трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 мм хлорид натрия (NaCl), 10 мм хлорид магния (MgCl2), 1 мм dithioerythritol (DTE) и 44 мкл H 2 БРИ
      3. Инкубировать смесь в полимеразной цепной реакции (ПЦР) тепловой циклователь на 95 ° C за 5 мин, выключите инструмент и подождите, пока не будет достигнут комнатной температуры (RT).
    3. Осадок отожженная олигонуклеотиды, добавив 5 мкл 3 M ацетат натрия рН 5.2 до 50 мкл отожженная олигонуклеотидов.
      1. Добавить 100 мкл холодной 100% этанола (EtOH) и Инкубируйте 30 мин при температуре-80 ° C. Центрифуга настольная центрифуга максимальной скоростью 30 мин при 4 ° C.
      2. Удалить супернатант, 500 мкл холодной 70% EtOH, центрифуги для 30 минут, удалить супернатант и растворяют гранулы в 20 мкл H2O.
      3. Оценить концентрацию отожженная олигонуклеотиды методом спектрофотометрии, измерения оптической плотности на 260 Нм. Разбавьте олигонуклеотиды до конечной концентрации 1 нг/мкл.
    4. Подготовка среднего Лурия Бертани (LB) и плиты агара фунтов.
      1. Для средних LB, Растворите Триптон 10 г, экстракт дрожжей 5 g, 10 g NaCl в 1 Л воды. Скорректировать рН среды до pH 7.0 с помощью 1 N NaOH и автоклав.
      2. Для плиты агара LB добавьте 15 г/Л агара в LB среднего. Автоклавы и остыть примерно 50 ° C. Добавить антибиотик и залить пластины.
    5. Полоса бактерий преобразованы с вектором тет pLKO Пуро (см. Таблицу материалы) на LB плита агара дополнена 100 мкг/мл Ампициллин и инкубировать на ночь (O/N) при 37 ° C.
    6. Прививок 100 мл LB среднего дополняется 100 мкг/мл ампициллин (LB/ампициллин) с 1 колонии от плиты и расти O/N с тряску при 37 ° C.
    7. IsolateTet-pLKO-puro из 100 мл бактериальной культуры с использованием комплекта изоляции плазмиды.
    8. Подготовьте ограничение реакции для тет pLKO-puro вектора с EcoRI и АИОД энзимами ограничения следующим: 1 мкл EcoRI, 1 мкл АИОД, 5 мкл 10 x буфер, 1 мкл плазмида ДНК (1 мкг), 42 мкл H2O. инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Чтобы получить достаточно из рассеченного вектора, готовить до 5 x 50 мкл реакций.
    9. Используйте гель агарозы 1% для очистки рассеченного вектор из геля агарозы, используя комплект для очистки ДНК. Чтобы увеличить доходность ДНК, свести к минимуму агарозы соотношение ДНК в геле, используя расческу гель агарозы для больших скважин и тщательно удалить большую часть агарозы из группы с помощью скальпеля.
    10. Подготовьте смесь реакции перешнуровки следующим: 1 нг отожженная олигонуклеотиды, 50 нг рассеченного вектор, 2 мкл 10 x лигаза буфер, лигаза 1 мкл и воды до 20 мкл. перевязать вектор с отожженная индуцируемый олигонуклеотиды на 16 ° C O/N.
      1. Кроме того, подготовка отрицательный контроль реакции без олигонуклеотиды для учета uncleaved, частично рассеченного и самостоятельной перевязаны вектор, который приведет к ложных положительных колоний.
    11. Использование методов стандартных преобразования, преобразования перешнуровки смеси в химически компетентным бактериальной клетки, предназначенные для предотвращения гомологичная рекомбинация лентивирусные векторы, содержащие прямые повторяется.
    12. Рост бактерий на плитах с ампициллина O/N 37 ° c.
      Примечание: Если рост колоний Спутниковое происходит, повторите преобразование и расти бактерий при 30 ° C до замедлить рост и тем самым предотвратить Спутниковое колоний.
    13. Для проверки успешного перевязки, выберите между 10-20 одной колонии, пересевать 2 мл LB/ампициллин культур и ампициллин пластины как запасов пластина (для использования в качестве позитивного клон позже). Расти жидкого культур встряхивании O/N 37 ° c. Инкубировать пластину O/N, 37 ° c.
    14. Уплотнение пластины с парафина и хранить при температуре 6 ° C.
    15. Изолируйте плазмида ДНК из жидкого культур с использованием комплекта изоляции плазмиды.
    16. Анализ ограничений плазмида ДНК, изолированный от ампициллина устойчивостью колоний, с помощью фермента XhoI. Для каждого клона, приготовить следующую смесь реакции: 0.5 мкл XhoI, 2,5 мкл 10 x буфер, 1 мкл плазмида ДНК (0,5 мкг) и 21 мкл H2O. инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Анализировать в результате реакции ограничение, запустив реакции на геле агарозы 1%.
      Примечание: Ограничение анализа вектора WT ферментами XhoI будет генерировать 3 фрагменты: 8,447, 1800 и 200 bp. Писака последовательность в Тэт pLKO-puro vector 1800 bp не присутствует в положительных клоны, содержащие индуцируемый PAI-1 и XhoI дайджест приведет к фрагментов ДНК размера: 8,447, 190 и 130 bp. Как показано на рисунке 1, 2000 фрагмент bp не найден в ДНК, изолированных от ампициллина устойчивостью колонии номер: 3, 8 и 11. В зависимости от конструкции олигонуклеотиды Длина и количество полученных фрагментов ДНК от положительных колоний могут различаться.
    17. Проверки правильной вставки индуцируемый последовательностей в Тэт pLKO-puro вектор последовательности8,9.
    18. Прививок 100 мл LB/ампициллин культуры с колонией, содержащий правильное клон и расти O/N 37 ° C.
    19. Изолируйте плазмида ДНК с помощью комплекта изоляции плазмиды.
  2. Поколение Лентивирусы частиц.
    1. Слой ткани культуры блюдо 15 см с поли-L-лизин, покрывая поверхности блюдо с стерильный водный раствор 0,01% поли-L-лизин и инкубации в РТ на 15 мин удалить решение путем аспирации и просушите блюда.
    2. Семена 5 х 106 человеческих эмбриональных почек 293 клеток (HEK293) клеток в поли-L-лизин покрытием 15 см блюдо, и культуры в среде среднего (DMEM) Дульбекко изменение орла дополнена 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина микс (Pen/Strep) при 37 ° C, 5% CO 2 до тех пор, пока они достигают 70% confluency.
    3. Для создания вирусных частиц, transfect HEK293 клетки с 25 мкг pLKO тет-на индуцируемый, 25 мкг psPAX, (упаковка плазмида) и 5 мкг pMD2.G плазмид (конверт выражая плазмида) с помощью трансфекции реагента.
      Примечание: psPAX и pMD2.G плазмиды, подарок от Дидье наконец лаборатории (Ecole Polytechnique Federale де Лозанна, Швейцария).
    4. Заставить клетки HEK293 следующий день, изменив среде DMEM дополнена 10 мм натрия бутират и 20 мм HEPES pH 7.2 и культивирования для 8 h.
    5. Вымыть клетки с фосфат амортизированное saline (PBS) и добавить 25 мл свежего DMEM средних содержащий 20 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES) рН 7,2. После инкубации при 37 ° C в течение 48 часов тщательно Соберите вирус содержащих среднего, закупорить; Избегайте разливов.
    6. Фильтр собранные среднего через фильтр 0,45 мкм шприц для удаления HEK293 клеток. Среду, содержащую вирусные частицы могут быть использованы сразу или температуре-80 ° C для последующего использования.
  3. Поколение линий стабильно transfected клеток
    1. Семя HCT116 толстой кишки раковые клетки и клетки рака груди MDA-MB-231 на 50 000 клеток/хорошо в среде DMEM, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% перо/воспаление в пластине 12-хорошо. Инкубируйте при 37 ° C на 5% CO2 , до тех пор, пока клетки являются 60-70% притока.
    2. Вымыть клетки с PBS и добавьте 1 mL-содержащий вирус средне рака клеток и инкубировать O/N при 37 ° C на 5% CO2. Как элемент управления, добавьте 1 mL свежих DMEM среды с 10% FBS и 1% перо/Strep 2 скважин с раковых клеток.
    3. Тщательно удалите вирус содержащих среды путем аспирации. Вымыть клетки с PBS и измените среднего DMEM с 10% (v/v) Тетрациклин бесплатно (тет бесплатно) FBS и 1% перо/воспаление.
    4. После 72 ч, вымыть клетки с PBS и измените среднего DMEM 10% бесплатно Тет FBS 1% перо/Strep, 1 мкг/мл puromycin для выделения вируса transfected клеток.
      1. В зависимости от линии клеток регулировка концентрации puromycin для оптимального выбора тестирования диапазон концентраций puromycin (0.1, 0.5, 1, 2 и 5 мкг/мл) в клетках не преобразованы и выбрав низкие концентрации, где нет контроля клетки выжить После 3 дней культуры.
    5. Выберите преобразованы вирусом клетки путем культивирования клеток в присутствии puromycin для 3-14 дней. Как элементы управления Подготовьте два дополнительных скважин с клетками не преобразованы, один со средой, содержащей puromycin и без puromycin. Наблюдать частичное убийства клеток, puromycin в скважине с преобразованы вирусом клетки, по сравнению с контроля скважин.
      Примечание: Не преобразованы клетки не будут расти в присутствии puromycin.
    6. Проверьте эффективность условной KD puromycin устойчивостью HCT116 рака толстой кишки и MDA-MB-231 клеток рака молочной железы.
      Примечание: Эффективную концентрацию доксициклина будет меняться с линией клеток используется и должен быть титруют (обычно от 100 нг/мл до 2 мкг/мл).
      1. Определите концентрацию доксициклина, не токсичны для клеток, но эффективный в экспрессируемых выражение протеина интереса. В этом протоколе 1 мкг/мл был успешно используется в пробирке.
      2. Культура клетки для 72 h в присутствии и отсутствии 0.1, 1 и 2 мкг/мл доксициклин. Проверить уровень экспрессии белка downregulated (здесь, PAI-1) в lysate клетки по западной помарки анализа. Сравнение HCT116 и MDA-MB-231 клетки условно выражая индуцируемый кинулись управления ячейки.
  4. Подготовка кондиционером среды
    1. Семян 1 x 106 клеток стабильно transfected с доксициклин регулировать содержащие lentiviruses pLKO индуцируемый блюдах 10 см.
    2. Расти клеточных линий в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среде с 10% бесплатно Тет FBS и 1% перо/воспаление в отсутствие и наличие 1 мкг/мл доксициклин для 72 ч при 37 ° C на 5% CO2, добавляя свежий доксициклин ежедневно.
      Примечание: RPMI среднего совместим с условиями культуры моноцитов. Доксициклин является свет чувствительные соединение. Защищать клеточных культур от света покрытия алюминиевой фольгой и избежать работающих под прямого воздействия света.
    3. Собирать средства, дозирование, процеживают через 0.45 мкм фильтром и заморозить при температуре-80 ° C в аликвоты.

2. изоляция моноциты из крови человека

  1. Изолируйте моноциты из периферической крови человека.
    Примечание: Человека первичной моноциты изолированы от 7 мл белых кровяных клеток, сосредоточены в лейкоцитарной фильтра, полученные от здоровых тромбоцитов доноров. В зависимости от доноров один лейкоцитарный фильтр производит от 1 x 10-9 и 2 х 109 мононуклеарных клеток периферической крови (получения), примерно 10% из которых составляют моноцитов.
    1. Подготовка рабочей станции в Ламинарный шкаф.
    2. Стерилизуйте ножницы и Ламинарный шкаф с ультрафиолет (УФ) за 30 мин.
    3. Spray лейкоцитарный фильтр с 70% EtOH и воздушно-сухой внутри Шкаф ламинарный поток.
    4. Вырезать ножницами обоих концах лейкоцитарный фильтр и Вылейте содержимое фильтра в 50 мл трубки.
    5. Разбавляют до 90 мл, добавив PBS, содержащей 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
    6. Подготовка 3 x 50 мл трубки с 15 мл градиента плотности раствора. Слой медленно 30 мл PBS/FBS разбавленной крови над плотность градиента решения с использованием контроллера пипетки на гравитационного потока установлен, чтобы избежать смешивания слоев.
    7. Центрифуга в качели ротора на 400 x g на RT без тормозов для 25 мин.
    8. Распоряжаться верхний слой и передачи средний слой, содержащий получения свежих 50 мл трубки.
    9. Добавьте что PBS/FBS до 50 мл и центрифуги на 120 x g на RT на 10 мин удалить супернатант, содержащие тромбоцитов. Повторите этот шаг еще два раза.
    10. Ресуспензируйте гранулы в 50 мл PBS/FBS и рассчитывать репликацию с помощью Горяева. Центрифуга на 120 x g в RT и Ресуспензируйте гранулы в PBS/FBS, содержащие 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (PBS/FBS/ЭДТА) до конечной концентрации 5 x 107 кл/мл.
    11. Используйте комплект негативный выбор обогатить моноцитов, истощение не monocytic клеток.
      Примечание: Негативный выбор kit использует коктейль антител (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 и Гликофорины A) против T клетки, NK клеток, нейтрофилы, B клетки, гранулоциты и эритроцитов. Комплексы антител связать поверхности этих не monocytic клеток и магнитные частицы декстрана. Когда трубка помещается в магнит, бусины присоединиться к стенкам трубки и удалить не monocytic клеток из решения.
      1. Добавьте 50 мкл антител коктейль 1 мл 5 x 10-7 мл/репликацию, смешать с пипеткой и проинкубируйте втечение 10 мин на RT. Добавьте 50 мкл магнитные бусы для получения с антителом коктейль, смешать с пипетки и инкубировать еще 10 мин на RT.
      2. Добавьте PBS/FBS/ЭДТА до 25 мл и место КСДОР смесь в магнит, который вмещает 50 мл трубки. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT. магнитные бусы будет присоединиться к стенкам трубки и секвестр non-monocytic клеток из решения.
    12. С помощью пипетки 25 мл, удалите раствор, содержащий моноциты из трубки в магнит. Будьте осторожны, чтобы не коснуться стороны трубки с пипеткой.
    13. Центрифуга решение на 250 x g на RT, удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы, содержащие моноцитов в среду RPMI, содержащую 10% бесплатно Тет FBS и 1% перо/воспаление.

3. Бойден камеры Assay миграции

  1. Готовят раствор 1% (w/v) бычьим сывороточным альбумином (БСА), растворяя 1 г BSA в 100 мл ультрачистая вода и процеживают через поры 0.2 мкм для стерилизации.
  2. Инкубируйте пластины пористые мембраны в 1% раствор стерильный BSA O/N для улучшения соблюдения макрофагов мембраны. Для моноцитов/макрофагов используйте 5-8 мкм поры размер вставок.
    1. Заполните стерильные тканевой культуры блюдо с 1% раствора БСА и место вставки в блюдо. Применить 200 мкл 1% раствора БСА внутри вставками.
  3. Вымойте вставки дважды, помещая их в тарелку, наполнены стерильный PBS и применяя PBS внутри фильтра.
  4. Семя 40000 HCT116 или MDA-MB-231 клеток в среде RPMI 0,5 мл, содержащие 10% бесплатно Тет FBS и 1% перо/воспаление в скважину, в 24-ну плиты, в трех экземплярах. Кроме того место 0,5 мл ранее сгенерированный кондиционером среды в колодец как источник хемотаксического.
  5. На следующий день, плита 8000 моноцитов в готовом вставить в объеме 0,3 мл среду RPMI, содержащую 10% бесплатно Тет FBS и 1% перо/воспаление, в трех экземплярах и инкубировать при 37 ° C на 5% CO2.
  6. Соберите вставки после 48 ч.
    Примечание: Продолжительность эксперимента должны быть оптимизированы в зависимости от конкретных условий и клетки, выполняя эксперимент курс, где вставки собраны в разных инкубации раз.
    1. Стряхните излишки среднего и точно проведите внутренней поверхности с ватным наконечником аппликатором для удаления клеток, которые не мигрируют.
    2. Пятно на внешней стороне вставок, с помощью метода Райт-Гимза.
    3. Тщательно Подключите 3 вставки/стеклянное скольжение в высокой вязкости нефти Микроскоп погружения, убедившись, что сторона фильтр с миграции макрофагов обращена.
  7. Изображения слайдов с использованием световой микроскоп 20 X цели. Сделайте фотографии 9 полей/фильтра. Количество миграции макрофагов в 9 областях/фильтр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Три индуцируемый последовательности были протестированы для наиболее эффективного KD PAI-1. Для этого индуцируемый последовательности против PAI-1 и омлет (Таблица 1) были клонированы в Тэт pLKO-puro выражение вектор протоколом, описанных выше. HT-1080 фибросаркома клеточная линия была стабильно transfected с сгенерированный конструкции и клетки обрабатывали доксициклин для 3 дней. Выражение PAI-1 была проверена на западной blotting ()

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Состоит из различных типов клеток, TME имеет решающее значение для развития рака. Чтобы определить оптимальные условия роста, раковые клетки привлекают моноциты через секрецию эозинофилов факторов. Здесь мы представляем собой протокол для изучения механизма найма Моноцит опухолевых клеток в пробирке. Для этой цели используется сочетание индуцибельной ген выражение системы, очистка первичных человеческих моноцитов и в качестве примера анализа миграции, Пробирной палаты Бойден.

Первым в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы признать Жаклин Розенберг для корректуры рукопись. Эта работа была поддержана США Департамент здравоохранения и социальных служб/национальные институты здравоохранения с Грант для YA DeClerck (Грант 5R01 CA 129377) и TJ Мартелл фонд. MH Кубала является получателем исследования карьеры развития стипендия Сабан научно-исследовательского института Детская больница Лос-Анджелеса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Tet-pLKO-puro лентивирусный векторAddgene21915
FBS (без тетрациклина)Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep Набор для обогащения моноцитов человекаStemCell19059
EasySep MagnetStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Умный буферNEBB7200S
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
PROMEGA Wizard SV Гель и система очистки ПЦРPROMEGAA9281
psPAX векторAddgene12260
pMD2.G векторAddgene12259
One Shot Stbl3 Химически компетентный E. coliThermo Fisher ScientificC737303
Hema 3 набор для окрашивания по методу Райта-ГимсыПротокол123-869
HEK293 клеткиATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
XhoI рестрикционный ферментNEBR0146S
ЛигазаNEBM0202S
Лигазный буферNEBM0202S
ЭДТА 0,5 М растворThermo Fisher ScientificR1021
Липофектамин 2000Инвитроген11668019
Большой Легко" EasySep Магнитныестволовые клетки18001
0,1% раствор поли-L-лизинаSigma-AldrichP8920
Ацетат натрияSigma-AldrichS7670
Бутират натрияSigma-AldrichB5887
0,45 μ М шприцевые фильтрыVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500г
Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис)Инвитроген15504-020
Хлорид натрия (NaCl)Сигма-ОлдричS7653-5 кг
Магния хлорид (MgCl<суб>2)Сигма-ОлдричM8266-100г
дитиоэритритол (DTE)Sigma-AldrichB8255-5g
этанол (EtOH)Sigma-Aldrich792780
триптонAmrescoJ859-500г
дрожжевой экстрактFluka70161-500g
Bacto agarBD214010
ампициллинSigma-AldrichA9393-5g
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM)Corning10-013-CV
фосфат-буферный физиологический раствор (PBS)Corning21-031-CV
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)Sigma-AldrichH3375
пуромицинSigma-AldrichP9620
Доксициклина гиклатSigma-AldrichD9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Corning10-040-CV
0,5 м EDTA pH 8,0Thermo Fisher ScientificR1021
Falcon Проницаемая опора для 24-луночной пластины с 8,0μ m Прозрачная ПЭТ-мембранаBecton Dickinson353097
бычья сыворотка альбуминSigma-AldrichA7906
Аппликатор с ватным наконечником MedlineMDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack Fisher Scientific Company123-869
Resolve Иммерсионное масло, высокая вязкостьRichard Allan ScientificM4004
Пенициллин стрептомицинGibco15140122

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972(2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tet ON SystemMonocyte MigrationWestern Blot AnalysisDensity Gradient CentrifugationBoyden Chamber AssayPAI 1 Protein

Похожие статьи