Оценка вторжения клеток и процесс миграции: сравнение видео на базе микроскопа нуля раны пробирного и пробирной палаты Бойдена

Summary

Это исследование доклады двух различных методов для анализа клеток вторжения и миграции: Бойден Пробирной палаты и в пробирке видео на базе микроскопа заживление assay. Описываются протоколы для этих двух экспериментов, и сравнение их преимущества и недостатки.

Abstract

Вторжения и миграции способности опухолевых клеток являются главными источниками прогрессии рака и повторения. Многие исследования изучили миграции и вторжения способности, чтобы понять, как распространение раковых клеток, с целью разработки новых стратегий лечения. Анализ клеточных и молекулярные основы этих способностей привело к характеристика клеток мобильности и физико-химических свойств цитоскелета и клеточных микроокружения. На протяжении многих лет Пробирной палаты Бойден и пробирного скретч раны были стандартные методы для изучения клеток вторжения и миграции. Однако эти два метода имеют ограничения. Пробирная палата Бойден, сложным и трудоемким, и пробирного скретч раны имеет низкая воспроизводимость. Развитие современных технологий, особенно в микроскопии, увеличилась воспроизводимость assay скретч рану. С помощью мощных аналитических систем, видео Микроскоп «инкубатор» может использоваться для обеспечения автоматического и в реальном времени анализ миграции клеток и вторжения. Целью этого документа является отчет и сравнить два анализов, используется для изучения клеток вторжения и миграции: Бойден Пробирной палаты и оптимизированный в vitro видео на базе микроскопа царапин РАН пробирного.

Introduction

Клетки вторжения и миграции участвуют в распространении раковых клеток, который является основной причиной резистентности к лечению¹ и может привести к локорегионарной или метастатической рецидива после лечения рака². Эпителиальный мезенхимальных переход (EMT) является начальный процесс клеток вторжения миграции в котором рака клеток переключиться из эпителиальных мезенхимальных фенотип. E-Кадгерины является внеклеточным маркер эпителиальных фенотипу³, и увеличение выражение N-Кадгерины и виментин характерно мезенхимальных фенотип⁴. Миграции также зависит от внутренней способности раковых клеток вторгнуться внеклеточного матрикса (ECM) через действие матрицы металлопротеаз⁵.

Этот механизм вторжения – миграции был описан для рака во многих местах, особенно в головы и шеи рак⁶. Многие исследователи сосредоточились на процессах миграции и вторжения, чтобы лучше понять, как распространение раковых клеток в надежде на то, что это знание приведет к новой стратегии лечения. Важно, что эти исследования выполняются с использованием надежных и воспроизводимых анализов.

В vitro анализа подвижности клеток может быть сложным. Разработаны много лет назад, Пробирной палаты Бойден считается стандартом для вторжения – миграции анализ⁷. Однако это занимает много времени и часто неточно. Второй тест является ранозаживляющим пробирного⁸, которая предполагает принятие царапина на культуру монослоя клеток и захвата изображения клетки вторжения и миграции в фиксированных временных интервалов. Этот метод широко подвергается критике из-за большого различия между результатами двух последовательных испытаний. Однако применение современных технологий, особенно в микроскопии, улучшилась воспроизводимость assay скретч рану. Видео Микроскопы могут быть легко введены в инкубаторы и может генерировать изображения в реальном времени миграции клеток. Эти устройства записи микроскопических данных и автоматического анализа слияния клеток рану со временем. Цель этого документа — для описания Бойден Пробирной палаты и пробирного оптимизированный скретч рану и обсудить преимущества и недостатки каждого подхода.

Protocol

Примечание: Бойден камеры и нуля анализы без включения ECM упоминаются как assay переноса, и же анализов с ECM именуется как assay вторжения.

1. Бойден Пробирной палаты

Примечание: Этот протокол приспособлен для линии клеток SQ20B, который является производным от периодических головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC) рак гортани и был получен от Иоанна мало (Бостон, MA, США).

1 день

1. Заполнение ячеек
   1. Семенной 2 10⁶ SQ20B клетки в 12 мл питательной среды (CM) в колбе² 175 см 72 h до один день и позволяют клеткам расти до 80% клеток слияния.
      1. Чтобы подготовить см для SQ20B клеток, дополнение Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), гидрокортизон 0,04 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
   2. Под капотом ламинарного потока trypsinize клетки. Удалите носитель, вымыть клетки с стерильных фосфат амортизированное saline (PBS) и добавить 2,5 мл трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (0,5 г/Л). Инкубировать клетки для 5 минут при 37 ° C и затем остановить реакции, добавив 12,5 мл см прогреты до 37 ° C. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчик соматических клеток.
   3. Заполнить клетки в колбе² 25 см на плотность клеток 6 10 клеток⁵ для каждого проверяемое условие. Инкубируйте клетки для 24 часа в 3 мл см.

День 2

2. Голодание клеток и подготовка покрытием камер
   1. Голодать клетки, заменив средних в каждый флакон 3 мл low плода бычьим сывороточным (ФБС) среды с помощью 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) вместо FBS. Голодать клетки для 24 h в инкубаторе.
      1. Чтобы подготовить голода (s-см), дополнение DMEM с 0.1% BSA, гидрокортизон 0,04 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
   2. Для анализа миграции перейдите к шагу 1.3.
   3. Для вторжения assay, 12 h до дня 3 Подготовьте покрытием камер Бойден, добавив 500 мкл s-см к каждой камере с покрытием. Использование коммерчески подготовленные покрытием Бойден камер и держать их на 4 ° C перед использованием. Место каждой камеры Бойдена в пластину компаньон и установите его в инкубаторе при 37 ° C на ночь.

День 3

3. Ячейка, посева в зале Бойдена
   1. Используйте пластину компаньон для подготовки хемотаксического. Заполните каждый хорошо из 24-ну компаньон пластины с 750 мкл полной среды с 10% FBS, гидрокортизон 0,04 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
      1. Адаптировать хемотаксического для каждой ячейки строки и каждое условие лечения. Чтобы подготовить хемотаксического см (ca см), дополнение DMEM с 10% FCS, гидрокортизон 0,4 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
   2. Передача верхняя палата в пластину преднаполненных компаньон, заботясь, чтобы избежать пузырей.
   3. Для вторжения assay осторожно удалите 450 мкл см от каждой камеры Бойден.
   4. Под капотом ламинарного потока trypsinize клетки. Удалите носитель, вымыть клетки с стерильных PBS, добавить 0,5 мл трипсина ЭДТА (0,5 г/Л) и затем инкубации клеток для 5 минут при 37 ° C. Остановить реакции, добавив см прогреты до 37 ° C. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчик соматических клеток.
   5. Семенной 3 10⁴ SQ20B клетки в 500 мкл 0,1% BSA среды, давая окончательного растворения⁴ 6 10 клеток/мл.
      Примечание: Концентрация клеток должны быть адаптированы для каждой ячейки строки.
   6. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C за 24 ч.

День 4

4. Клетки фиксации и окраски
   1. Исправьте клетки до удвоения времени, характерные для этой линии клеток. Исправьте SQ20B клетки до 24 ч.
   2. Снять пластину компаньон каждой вставки и тщательно удалить ячейки из верхней камеры с помощью ватного тампона. Это особенно важно, чтобы удалить все ячейки, расположенные в верхней палате.
   3. Исправление и пятно вставить индивидуально для получения мая-Грюнвальд Гимза окраска⁹ с помощью окрашивания комплекта предусмотрено. В качестве альтернативы используйте параформальдегида 4% другой спутник пластина для фиксации 30 мин.
   4. Держите вставок в пустой 24-ну компаньон пластине под капотом лаборатории для просушки каждой палаты.

День 5

5. Микроскопический анализ
   1. Вставьте пластину компаньон с вставками на 20 фазово контрастной микроскопа и рассчитывать каждый миграции клеток в нижней части мембраны. Оптимизировать правый фокус позицию путем перемещения цель от дна к верхней и остановить позицию на нижней части мембраны.
   2. Рассчитайте соотношение между количеством миграции клеток и клеток в сеяный. Повторите каждое количество для каждого условия лечения в трех экземплярах.

2. нуля ранение пробирного: Миграция клеток

Примечание: Инструкции должны быть адаптированы для каждого типа клеток.

1 день

1. Заполнение ячеек
   1. Семенной 2 x 10-⁶ SQ20B клетки в 12 мл см в колбе² 175 см 72 h до один день и позволяют клеткам расти до 80% клеток слияния.
   2. Под капотом ламинарного потока trypsinize клетки. Удалите носитель, вымыть клетки с стерильных PBS, добавить 2,5 мл трипсина ЭДТА (0,5 г/Л) и инкубации клеток для 5 минут при 37 ° C. Остановить реакции, добавив 12,5 мл см прогреты до 37 ° C. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчик соматических клеток.
   3. Создайте образец prediluted на клетки плотности 4 x 105/мл, давая окончательный плотность клеток⁴ 4 10 100 мкл в каждой скважине. Эта концентрация должна быть адаптирована для каждой ячейки строки и должно быть в диапазоне от⁴ 1 x 10-6 10⁴ клетки.
   4. Семя клеток в каждой скважине 96-луночных плиты сдачи 100 мкл раствора, подготовленную на этапе 2.1.2.
   5. Оставьте при комнатной температуре за 5 мин для разгона ячейки равномерно в нижней части скважины пластину.
   6. Место пластину в инкубаторе и позволяют клеткам присоединиться к пластине для 12-16 ч (максимальная) при 37 ° C.

День 2

2. Поцарапать рану пробирного
   1. Снимите крышки, подготовленные на шаге 2.1 из инкубатора.
   2. Под капотом чтобы раны с использованием коммерческих ранив устройства согласно протоколу производителя.
   3. Немедленно удалите средство из каждой хорошо с помощью пипетки с адаптированы конический наконечник, стараясь не коснуться рану.
   4. Вымойте клетки дважды, повторяя стремление и используя 100 мкл см, разогретую до 37 ° C для каждой скважины.
   5. Удалите с помощью пипетки с адаптированных конический наконечник после стирки шагов см.
   6. Добавьте 100 мкл среды, конкретных для каждого условия лечения в каждой скважине.
   7. Старайтесь избегать создания любые пузыри в скважинах. Реверс дозирование технику могут быть полезны здесь. Кроме того Удалите пузырьки с иглой шприца.
   8. Место пластину в адаптированных стойку видео Микроскоп.
   9. Чтобы улучшить качество изображения, позволяют плита тепло для по крайней мере 15 минут до первого сканирования, чтобы избежать конденсации на нижней стороне пластины.
   10. Программа расписание сканирования, используя программное обеспечение видео Микроскоп на одно изображение на хорошо. Для эксперимента вторжения миграции требуется максимальный интервал 2-h. Если Цель эксперимента для производства видео, интервал 30 мин Максимальная является предпочтительным.
   11. В конце эксперимента тщательно вымыть ранив устройства и следовать за каждый из четырех шагов Стиральная, указанных заводом-изготовителем.

3, 4 и 5 дней

3. Анализ миграции с помощью видео Микроскоп
   1. Минимум 24 h и до 5 дней мониторинг и Проверка миграции клеток.
   2. Используйте маску соответствующую ячейку, адаптированы для каждого типа клеток для анализа миграции клеток. Для получения клеток маска, адаптированы для каждой ячейки строки, генерировать обработки определения от программного обеспечения, используя коллекцию изображений определенных ячеек ячейки.
   3. Трассировки кривых и экспортируйте данные в электронную таблицу, которая может использоваться для анализа и сравнения результатов.

3. нуля раны пробирного: Вторжение ячейки

Примечание: Инструкции должны быть адаптированы для каждого типа клеток.

1 день

1. Заполнение ячеек
   1. Используйте тот же протокол для заполнения ячейки, как описано в шаге 2.1.

День 2

2. Подготовка ECM
   1. Размораживание матрица для по крайней мере 12 h перед использованием при 4 ° C. Убедитесь, что нет агрегатов являются видимыми. Если статистические выражения являются видимыми, держите матрица на 4 ° C для более длительного периода, до тех пор, пока агрегатов исчезают. Сохраните матрицу на льду. Использование охладить наконечники.
      Примечание: Матрица будет закрепить, если не держал при 4 ° C.
   2. Холод microcentrifuge трубы на льду на 5 мин.
   3. Возьмите см охлаждается до 4 ° C из холодильника и разбавленных матрицы в помощи microcentrifuge трубы для получения конечной концентрации 300 мкг/мл.
   4. Возвращение microcentrifuge трубки с разбавленной матрицы в холодильник на 4 ° C.
      Примечание: Охлаждение стойки адаптированы для труб microcentrifuge полезен для поддержания трубы на 4° C на протяжении всего эксперимента.

День 2

3. Assay скретч раны и лечение ECM
   1. Снять пластину, подготовленный на шаге 3.1 из инкубатора.
   2. Под капотом чтобы раны, с использованием коммерческих ранив устройства согласно протоколу производителя.
   3. Немедленно удалите средство из каждой хорошо с помощью пипетки с адаптированных конический наконечник, стараясь не коснуться рану.
   4. Вымыть клетки дважды, повторяя процедуру аспирации и используя 100 мкл см прогреты до 37 ° C.
   5. После второго мыть место пластину на 4 ° C инкубатор для сбалансировать ее температуры на 5 мин.
   6. Удалите средство холодной из каждой скважины с пипеткой аспирации с коническим наконечником, заботясь Пипетка тщательно от края и не прикасайтесь к ране.
   7. Добавьте 50 мкл разбавленной матрицы для каждой скважины с использованием помощи конической советы при 4 ° C.
   8. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C за 30 мин.
      Примечание: Подогретую поддержки стойку при 37 ° C целесообразно ускорить потепление 96-луночных пластины.
   9. Снять пластину из инкубатора и добавить 100 мкл адаптированы см к каждой скважины, как указано для каждого условия лечения.
   10. Старайтесь избегать создания любые пузыри в скважинах. Реверс дозирование технику могут быть полезны здесь. Кроме того Удалите пузырьки с иглой шприца.
   11. Место пластину в адаптированных стойку в видео Микроскоп.
   12. Чтобы улучшить качество изображения, позволяют плита тепло для по крайней мере 15 минут до первого сканирования, чтобы избежать конденсации на нижней стороне пластины.
   13. Программа расписание сканирования, используя программное обеспечение видео Микроскоп на одно изображение на колодец, в режиме сканирования поцарапать раны. Максимальный интервал 2-h в необходимых для эксперимента вторжения миграции. Если Цель эксперимента для производства видео, интервал 30 мин Максимальная является предпочтительным.
   14. В конце эксперимента тщательно вымыть ранив устройства и следовать за каждый из четырех шагов Стиральная, указанных заводом-изготовителем.

3, 4 и 5 дней

4. Анализ вторжения клеток под микроскопом видео.
   1. Повторите шаг 2.3.

Results

Мы приводим здесь два различных метода для анализа клеток вторжения и миграции. Рисунок 1 показывает Бойден камеры эксперимента. Вставки помещаются в компаньоны плита с хемотаксического среднего, и клетки являются семенами в см. Мембрана может быть без покрытия (миграции проба) или с покрытием (вторжения проба). Клетки будут посеяны в верхней палаты в s см. Нижняя палата заполняется с см как хемотаксического. Клетки фиксируются до удвоения времени.

Discussion

Мы приводим здесь два различных механизмов для изучения процесса вторжения и миграции клеток. Анализ этого процесса имеет важное значение для понимания факторов, участвующих в метастатических повторения, которые могут быть объяснены повышенной подвижности субпопуляции клеток рака называется Рак стволовых клеток^10,11.

Бойден камеры эксперимента является одним наиболее часто используемые методы для изучения клеток вторжения и миграции. О...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фетальная сыворотка теленка Gold	GE Healthcare	A15-151
Гидрокортизон водорастворимый	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Пенициллин/стрептомицин 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Ореховая смесь (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	Раствор необходимо готовить непосредственно перед использованием, потому что он очень нестабилен
Z1 сошниковой частицей	Beckman Coulter	6605698
Оптическим микроскопом	Olympus	Клеточная линия CKX31
SQ20B	Подарок от Джона Литтла s	Lab-Wound
Maker	Essen Bioscience	4494	Хранить в безопасном и сухом месте
96-луночный ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F Система с CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox с M30 System	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Вставка с покрытием Dominique Dutcher	353097
Boyden	Dominique Dutcher	354483	хранить при -20 градусах; C
Companion 24-луночная пластина	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel standard	BD BioScience	BD 354234	Храните при -20°C.
RAL 555 Набор для окрашивания	RAL Diagnostics	361550	Хранить в безопасном и сухом месте
Микроцентрифужные пробирки	Eppendorf	33511