Method Article

Количественного определения микроорганизмов при низких концентрациях, с использованием голографической цифровой микроскопии (DHM)

DOI:

10.3791/56343

⸱

November 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Голографической цифровой микроскопии (DHM) является объемный метод, который позволяет после обработки изображений образцов, выполненных толще, чем brightfield микроскопии в сопоставимых резолюции, с упором на 50-100 X. DHM используется здесь для выявления, учета и отслеживания микроорганизмов на очень низкой плотности и по сравнению с измерения оптической плотности, плита count и прямых игр.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точного обнаружения и подсчета разреженные бактериальные образцы имеет много приложений в продуктов питания, напитков и фармацевтической промышленности, в медицинской диагностике, а также для обнаружения жизни роботов миссиями на другие планеты и спутники солнечной системы. В настоящее время разреженные бактериальные образцы учитываются по культуре обшивка или эпифлуоресцентного микроскопии. Плиты культуры требуют долго инкубационный раз (дней до нескольких недель), и микроскопия помощью эпифлуоресцентного требует обширных окрашивание и концентрации образца. Здесь мы продемонстрируем использование вне оси цифровой голографической микроскопии (DHM) для перечисления бактерий в очень разбавленных культур (100-104 клеток/мл). Во-первых строительство пользовательских DHM обсуждается, а также подробные инструкции по созданию инструмента лоу кост. Обсуждены принципы голографии, и статистическую модель используется для оценки, как долго видео должно быть обнаружить клетки, основанный на оптические характеристики инструмента и концентрация бактерий раствора (Таблица 2) . Видео выявление клеток на 105, 104, 103и 100 клеток/мл свидетельствует в реальном времени с помощью ООН реконструированный голограммы. Реконструкция амплитуды и фазы изображений показано с помощью пакета с открытым исходным кодом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение точной бактериальных отсчетов в очень разбавленных пробах крайне важно во многих приложениях: несколько примеров являются воды и продовольствия качества анализа1,2,3; обнаружение возбудителей в крови, спинномозговой жидкости или мокроты4,5; Производство фармацевтической продукции, в том числе стерильной воды6; и анализ экологического сообщества в олиготрофном средах, например в открытом океане и отложений7,8,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. рост и перечисление бактерии

Примечание: это применимо к почти любой бактериальный штамм, выращенных в соответствующих средних 36. В нашем примере, мы используем три штамма: Serratia marcescens как общие, легко идентифицируемые лаборатории штамм; и меньше, очень подвижные экологической нагрузки, Shewanella oneidensis MR-1. Для сравнения обнаружения подвижных против не подвижные клетки, не подвижные Shewanella мутант, Δ FlgM, также используется для сравнения 37. Все штаммы выращиваются в бульоне lysogeny (LB).

  1. Подготовить стерильные LB среднего (за ли....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты следует указать способность обнаружить живых и мертвых бактерий на очень низких уровнях DHM. Количество бактерий, учитываются должны согласовываться с результатами, полученными с помощью Petroff-Хаузер Счетной палаты и пластины отсчеты. Стандартные статистические методы предоставляют сведения о точности обнаружения различных методов в различных концентрациях, бактериальных.

Рисунок 1 пока.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Численное реконструкция голограммы: численные реконструкции голограмм, используется метод угловой спектра (АНМ). Это включает в себя свертка голограмма с функция Грина для Вывинтить. Комплекс волновому изображения в частности фокальной плоскости можно рассчитать, используя Фурье импульсной Теорема следующим:

figure-discussion-1(1)

Где figure-discussion-2 нахо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, Гордон и Бетти Мур фонд грантов 4037 и 4038 на Калифорнийский технологический институт для финансирования этой работы.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto ДрожжиBD Biosciences212750
Bacto TryptoneBD Biosciences211705
Sodium chlorideSigma-Aldrich7710Множество вариантов покупки
Bacto AgarBD Biosciences214010
10 см чашки ПетриVWR10053-704
15 мл пробирки для культурыFalcon ( Corning Life Sciences)352002Камера Петрова-Хаузера со свободным колпачком
Электроннаямикроскопия Sciences3920
10 мл шприцыBD Biosciences309604наконечник Люэра-Лока не требуется
Male Luer to 1/16" колючий фитингMcMaster-Carr51525K291
Автоклавируемый 1/16" ID Трубка из ПВХ для потокаNalgene8000-0004Продается по длине, приобретайте соответственно
Шприцевой насосHarvard ApparatusPHD 2000
Камера для образцовПользовательскийн/дСм. раздел материалов
Голографический микроскопПользовательскийн/дСм. Wallace et al.
Программное обеспечение с открытым исходным кодомCustomhttps://github.com/bmorris3/shampoo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Digital Holographic MicroscopyBacterial DetectionLow Concentration EnumerationHologram ReconstructionPetroff Hausser ChamberCFU PlatingSerial DilutionSyringe Pump FlowMedium Subtracted FilteringCell Density Calculation

Related Articles