Эта статья описывает протокол для крупных стерильных изоляции и коллекции свободноплавающих miracidia человеческой крови fluke Schistosoma mansoni и их последующей обработки для введения в культуру в пробирке .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Массовые изоляции и культивирования In Vitro Intramolluscan стадий человеческой крови Fluke Schistosoma Mansoni
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человеческой крови сосальщики, Шистосомы spp., имеют сложный жизненный цикл, который включает бесполыми и сексуальной фаз развития внутри улитки промежуточные и млекопитающих окончательного хозяина, соответственно. Способность изолировать и поддерживать различные жизненного цикла этапов в vitro условиях культура в значительной степени способствовало расследований сотовой, биохимических и молекулярных механизмов, регулирующих паразита роста, развития и принимающих взаимодействий. Передача о шистосомоза требует бесполое размножение и развитие нескольких личиночных стадий в узле Улитка; от инфекционных miracidium, через первичных и вторичных sporocysts, в cercarial стадии, инфекционный для людей. В этой статье мы представляем пошаговые протокол для массового штриховки и изоляции Schistosoma mansoni miracidia из яйца, полученные от печень инфицированных мышей, и их последующее введение в культуру в пробирке . Предполагается, что подробный протокол будет поощрять новых исследователей заниматься и расширения этой важной области schistosome исследований.
Введение
Человека кровь сосальщики Schistosoma spp., уже возбудителей о шистосомоза, забытых тропических болезней, от которых страдает примерно 230 миллионов человек во всем мире1. Наиболее распространенных видов, Schistosoma mansoni, географически распределены в Южной Америке, Карибском архипелаге, Ближнем Востоке и к югу от Сахары Африке2. Жизненный цикл S. mansoniи другие шистосомоз, сложные, включающие млекопитающих принимающей окончательные и пресноводных улиток род Biomphalaria , которые служат в качестве облигатного промежуточных хозяев.
S. mansoni мужского и женского взрослого червя пар, живущих в задней брыжеечных вен воспроизводить млекопитающих хост, что привело к освобождению эмбриональные яйца (равнина), которые становятся подал в небольшой венул слизистой оболочки кишечника. Яйца, а затем перерывы через стенки сосудов, мигрируют через слизистых тканей и в конечном итоге введите просвета кишечника, где они будут аннулированы с калом. Когда яйцеклетки введите штрих пресной воды и свободноплавающих личинки (miracidia), они должны в короткие сроки, найти подходящую Biomphalaria улитки, чтобы заразить для того чтобы продолжать его жизненного цикла. Этот процесс инфекции включает miracidial привязанность к улитки космическое тело поверхности следуют активного проникновения и вход личинка в хозяина. Вскоре после вступления miracidium начинает проливать его внешней мерцательного эпидермального пластины, как он образует синцития, которая станет новой внешней поверхности (оболочки) следующий личиночной стадии первичной или мать Спороциста. Бесполое размножение каждой первичной Спороциста производит и выпускает второго поколения sporocysts, называют вторичные или дочь sporocysts, которые в свою очередь, создания и выпуска большого числа intramolluscan стадии, видовой3 . После побега из узла Улитка свободноплавающих cercariae способны подключения и непосредственно проникая кожи человека или другие подходящие млекопитающих хоста. После вступления в их новый хост cercariae преобразование на паразитарные schistosomula сцену и вторгнуться в сердечно-сосудистой системы. Они, в свою очередь, мигрируют в легких, а затем печеночной вены, где они Зрелые для взрослых червей, образуют мужских и женских пар и поехать брыжеечных вен для завершения их жизненного цикла.
Успех intramolluscan или «улитка этап» развитие личинок шистосомоз имеет важное значение для продолжения цикла человека хост узел передачи. Критически важное значение имеет период следующую запись свободноплавающих miracidium в узле улитки и превращение его ранних до стадии первичной Спороциста. В зависимости от физиологического и иммунологическая совместимость между хозяином и паразитом именно во время этой фазы развития личинок что первоначальный успех или неудача для установления инфекции определяется4,5,6 . Последующее развитие первичных sporocysts бесполым производить вторичные sporocysts, которые затем генерировать человека инфекционный cercariae, далее требуют разрешительной физиологических хост-среды, которая обеспечивает для всех паразита роста и репродуктивных потребностей.
На сегодняшний день мало что известно о лежащих в основе физиологических, биохимических и молекулярных процессов управления schistosome Улитка взаимодействия, особенно на молекулы и тропинки участвует в регулировании развития личинок и воспроизводства, или модулирующая хоста иммунных реакций. Свободный доступ к большое количество этих личиночной стадии в vitro условиях культуры, которые позволяют экспериментальных манипуляций значительно облегчит обнаружение пути развития и основных механизмов роста клеток, дифференциация и размножение. Критические паразита пути или механизмов, выявленных с помощью экспериментов в пробирке , может затем использоваться для нарушить личиночной роста/воспроизведение в узле Улитка, или для идентификации Улитка хост иммунные механизмы признания и ликвидации miracidial или Спороциста этапов.
В этой статье и видео презентации, мы предоставляем подробное описание метода для изоляции большого числа свободноплавающих S. mansoni miracidia для введения в культуру в пробирке , который затем может быть подвергнут последующих экспериментальных манипуляция (см. рис. 1 на Схематический обзор протокола рабочего процесса). Хотя аналогичные процедуры были описаны ранее7,8,9, мы чувствовали, что подробный протокол будет полезным для исследователей, которые хотят использовать эту модель для решения до сих пор без ответа вопросы, связанные с intramolluscan развития личинок, пролиферации и schistosome Улитка иммунных взаимодействий. Кроме того этот подход может быть легко адаптирована для изоляции яиц от других медицински важных трематоды мочевого пузыря жилья S. haematobium, печень сосальщиков или легких сосальщики.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все Уход за животными и экспериментальной процедуры были утверждены институциональный уход за животными и использования Комитетом из университета Висконсин-Мэдисон протоколом не. V005717. Следующий протокол включает в себя работу в объекте 2-го уровня биобезопасности (BSL2) для патогенов человека, хотя ни один из этапов schistosome, изображенные в этом протоколе инфекционный людей или других млекопитающих. Следуйте институциональную политику для обработки 2 группы риска (RG2) патогенов человека.
Примечание: Мы используем самок мышей Swiss-Уэбстер (6 - старый неделю) из-за их более высокой подверженности инфекции10, тем самым давая больше яйцо бремя. Tucker et al. описывают мыши и улитка инфекции протоколы, используемые в этой модели системы11. Таблица материалов перечислены все конкретного оборудования, материалов, реагентов и животных источников, необходимых для выполнения этот экспериментальный протокол.
1. Обработка зараженных печень
- Усыпить мышей, 6-7 недель после заражения, CO2 удушение (норма 10-30% от объема камеры в минуту). Монитор мыши для прекращения дыхания и пульса.
Примечание: Как правило, до 20 мыши могут быть обработаны в определенное время. - После передачи Усыпленных мышей биобезопасности кабинета, поместите мышь на их спинах и брызги их вентральной поверхности с 70% этиловом спирте. Дайте впитаться в течение 1 мин.
- Пинч и подтянуть кожу нижней части живота и сократить через базу ущипнул кожи ближе к живота с стерильные хирургические ножницы. Потяните вырезать кожу кпереди (т.е. к голове) выявить печени. Обратите внимание, что печень следует расширить и рябой благодаря яйцо индуцированные гранулематозный ответа (рисунок 2A).
- Удаление печени и поместите его в стакан, содержащие 200 мл стерильного 1,2% NaCl решение содержащий перо/стрептококк.
- Повторите шаги 1.3 и 1.4 с остальных мышей.
Примечание: Двадцать мыши обычно обрабатываются в одном урожая. - Место печень в стерильных Петри и удаление жира/соединительной ткани-печень стерильным пинцетом.
- Передать подстриженные чистить печень стерильные центрифуги 250 мл флакон, содержащий ~ 200 мл стерильного раствора NaCl 1,2% с пером/воспаление.
- Энергично встряхните флакон, содержащий печень и, используя Стерильные одноразовые пипетки, удалите избыток поверхности пены/плавучий мусор. Медленно слить оставшееся физиологический раствор в контейнер или приемник содержащий Блич 1% (дезинфекции).
- Добавить ~ 200 мл свежего физраствора в печень и повторите шаг 1.8 еще три раза.
2. печени добычи и miracidial изоляции
- Место печень в чашку маленький стерильный блендер из нержавеющей стали и добавить ~ 2 мл раствора NaCl 1,2% (рис. 2B).
- Обложка Кубок с фольгой и Петри для предотвращения разливов и смешать 1 мин, чередуя низкой и высокой скорости (низкая скорость/10 s высокая скорость 20 s; повтор) (рис. 2 c).
- Равномерно распределять смесовые печени подвеска в стерильных центрифуги 250 мл бутылки (для 20 печень использовать 4 бутылки).
- Добавьте стерильного физиологического раствора с помощью антибиотиков в ~ 200 мл общий объем/бутылка. Вес/баланс бутылки перед центрифугированием.
- Центрифуги, смесовые печень на 290 x g 15 мин на 4 oC. осторожно слить supernatants в контейнер с хлоркой до отмены.
- Повторите шаги 2,4-2,5 раз. Не забудьте тщательно Ресуспензируйте печени отложений до центрифугирования.
- После отмены последнего солевых мыть (шаг 2.6), добавить 200 мл стерильной воды с пером/воспаление гранулированных ткани печени, трясти Ресуспензируйте отложений, и передавать подвеска стерилизованные 1-L объемные настой, который был полностью покрыт с алюминием фольга, за исключением верхней 3 см шеи (Рисунок 2D).
Примечание: Используйте две бутылки (= 10 печень) за флакон 1 Л. Прудовой воды имитирует естественный пресноводной среде необходимо для стимулирования miracidial штриховки из яиц. - С помощью стерильных пруд водой, заполните вверх Фляга для приблизительно 3 см выше Фольга покрытия на шее. Затем, без промедления (как miracidia вскоре начинают люка), удалить остаточные пены и ткани печени, плавающей на поверхности, быстро закупорить вверх ~ 12 мл воды пруда, содержащие мусора и отбрасывая его в отдельном отбросить пробки. Замените свежей стерильные пруд водой.
- Повторите очистки 2.8 шаг, еще три раза, проверка на наличие miracidia в трубке отменить. Прекратить повторение Очистка шаг, если miracidia появляются в промывочный раствор.
- После последнего мыть медленно добавьте ~ 12 мл теплого стерильного пруд воды (предварительно разогретую до 30 oC) для создания градиента температуры с чистой, стерильные теплой водой на вершине.
Примечание: Лучше всего это достигается медленно выполняя воды вдоль стороны колбу шеи, чтобы избежать смешивания. - Место небольшой Петри крышка над отверстием колбу и светить яркий свет в верхней части колбы над защитное покрытие для освещения на верхней поверхности воды.
Примечание: Как правило, в течение 5-10 мин, бассейн miracidia, привлекли к свету, будет сосредоточена в большом количестве воды (рис. 3A) в течение первых 2-3 см.
3. Miracidial уборки и выращивания
- Когда miracidia накопили на поверхности после 10 мин, с использованием стерильных передачи пипетки, удалите ~ 8 мл воды и перевода в стерильных пластиковых 15 мл пробирок. Место труб, содержащих miracidia на льду.
- Добавьте обратно 8 мл теплого стерильного пруд воды вдоль внутри объемной колбу и ждать еще 10 мин.
- Используя новые трубы каждый раз, повторите шаги 3.1 и 3.2 еще три раза. После 4й коллекции сохраните окончательный трубки на льду за 10 минут позволить miracidia урегулировать. Этот набор трубок состоит из первого урожая.
- Пробирок, содержащие miracidia на 290 x g 1 мин на 4 oC в предварительно охлажденным охлажденных центрифуги.
- Немедленно удалите большую часть супернатант (~ 7 мл), стараясь не нарушить паразита Пелле (рис. 3B).
- Бассейн все miracidia от этого первого урожая в одну трубку, затем промойте все оригинальные труб с ~ 1 мл стерильной воды и добавить в «пуле» трубки.
- Разрешить паразитов поселиться на льду за ~ 5 мин и снова центрифуга паразитов на 290 x г за 1 мин на 4 oC.
- Тщательно удалить супернатант и добавить 6-8 мл стерильного Чернин сбалансированного солевого раствора (CBSS +; см. таблицу материалы) содержащий перо/воспаление.
- Осторожно приостановите miracidia и Алиготе, их в 24-ну культуры плиту (1 мл на колодец), следуют промывка труб в 6-8 мл CBSS + и добавление 1 мл промывки в каждой скважине. Инкубируйте паразитов в 26 oC в нормоксические условиях. Концентрации изолированных miracidia будут отличаться, но обычно будет в среднем ~ 7000/мл.
- Если паразитов по-прежнему сосредоточены на источнике света, повторите шаги 3.1 3.9 для продолжения уборки miracidia конце штриховкой, но увеличить интервал времени между коллекции до 15-20 мин.
Примечание: Этот новый набор трубок представляет второй урожай. Однако потому что miracidial чисел обычно являются низкими, личинок из всех труб обычно объединяются в одной культуры, также содержащий 2 мл CBSS +. - На 24 ч после сбора урожая и культивирования нежно ресуспензируйте sporocysts в их скважин, закупорить.
- Подождите несколько минут, чтобы позволить паразитов поселиться в нижней части скважины. После того как они поселились, тщательно удалите супернатант (~1.5 мл), который будет содержать большую часть мерцательного эпидермального пластин пролить miracidia во время личинок преобразования. Это «превращение» супернатанта может отказаться или включены в последующие исследования личиночной секреторных продуктов.
- Добавьте 1,5 мл свежего CBSS + каждый хорошо и аккуратно пипеткой Ресуспензируйте sporocysts. Повторите шаг 3.12 Если далее мытья или меняется на другой носитель.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Подавляющее большинство miracidia обычно будет были собраны в первых двух «урожай». Инкубация изолированных miracidia в СГБМ + инициирует процесс трансформации miracidium Спороциста (Рисунок 4A- C). В течение первого часа следующие передачи культуры скважин, содержащие CBSS +, большинство miracidia прекратить плавания (рис. 4A). В 6 ч в культуре miracidia занимаются активно пролить их мерцательного эпидермального...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Miracidia S. mansoni, изолированные и манипулировать, как описано в настоящем документе, может заразить только Улитка промежуточного узла и поэтому не представляют человека биологической во время этой фазы развития личинок. Однако чтобы избежать случайного воздействия/инфекции улиток, уход следует выполнять miracidial изоляции в месте, отличном от районов, где восприимчивых видов Biomphalaria Улитка может быть настоящей или сохранить. Отдельную комнату, зарегистрирована как BSL2 пространства, настоятель...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Частично финансируется гранта NIH RO1AI015503. Schistosome инфицированных мышей были предоставлены NIAID шистосомоз ресурсный центр биомедицинских научно-исследовательском институте (Роквилл, MD) через низ-NIAID контракт HHSN272201000005I для распространения через BEI ресурсов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Сбалансированный раствор соли Чернина (CBSS+) | <сильно>На 1 л раствора | ||
| >2,8 г хлорида натрия | Fisher Scientific | S271-3 | Растворите соли, кроме хлорида кальция, и |
| 0,15 г хлорида калия | Sigma-Aldrich | P5405 | сахара в 800 мл ddH2O |
| 0,07 г натрия фосфата, двухосновного безводного Fisher | Scientific | S374-500 | Растворить хлорид кальция отдельно в 200 |
| 0,45 г гептагидрата сульфата магния | Sigma-Aldrich | M1880 | мл ddH2O |
| 0,53 г дигидрата хлорида кальция | Mallinckrodt | 4160 | Медленно добавить кальциевый раствор в соль/сахарный раствор с |
| 0,05 г гидрокарбоната натрия | Fisher Scientific | S233-3 | при постоянном перемешивании |
| 1 г глюкозы | MP Biomedicals | 152527 | Отрегулируйте до pH 7,2 и простерилизуйте фильтром с помощью a |
| 1 г трегалозы | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 &; m одноразовый фильтр для бутылки |
| 10 мл 100X пенициллин/стрептомицин | Hyclone | SV30010 | Добавить отфильтрованный пенициллин и стрептомицин soln предыдущее применение |
| <сильный>неполный Bge средний (Ibge) | <сильный>Для 900 мл раствора | ||
| 220 мл Schneider' s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Смешайте среду Schneider's с 680 мл ddH2O |
| 4,5 г ферментативного гидролизата лактальбумина | Sigma-Aldrich | L9010 | Добавьте гидролизат лактальбумина и галактозу |
| 1,3 г галактозы | Sigma-Aldrich | G0625 | Отрегулируйте до pH 7,2 и простерилизуйте фильтром с помощью 0,22 µ m предварительно стерилизованный одноразовый фильтр для бутылок |
| <сильный>полный Bge medium (cBge) | Для 100 мл раствора | ||
| 90 мл Неполная Bge среда | Для термоинактивации FBS: Инкубировать размороженный FBS в | ||
| 9 мл тепловой сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | водяная баня при температуре 60°С; С в течение 1 часа при этом мягко |
| 1 мл 100X пенициллин/стрептомицин | Гиклон | SV30010 | взбивая флакон каждые 10 мин<бр/> Аликвот термоинактивированный FBS в 15-мл пробирки <бр/> и хранить при -20°C. Смешайте среду + FBS и простерилизуйте фильтром с помощью 0,22 & микро; m предварительно стерилизованный одноразовый фильтр для бутылок Добавьте пенициллин и стрептомицин перед применением |
| Pond water (стоковый раствор)< | >1л стокового раствора | ||
| 12,5 г карбоната кальция | Fisher Scientific | C64-500 | Смешайте все соли в 1л ddH2O |
| 1,25 г карбоната магния | Fisher Scientific | M27-500 | Обратите внимание, что соли не будут иметь полностью |
| 1,25 г натрия хлорид | Fisher Scientific | S271-3 | растворенный. Энергично встряхните, чтобы приостановить |
| 0,25 г солей хлористого калия | Sigma-Aldrich | P5405 | перед внесением рабочего раствора; |
| <сильная>прудовая вода (рабочий раствор) | <сильная>1,5 л раствора | ||
| 0,8 мл прудовой воды (встряхнуть перед использованием) в | Смешайте бульон с ddH2O | ||
| 1500 мл ddH2O | Стерилизуйте воду из пруда путем автоклавирования (медленно цикл) | ||
| 1,5 мл 100Х пенициллин/стрептомицин | Гиклон | SV30010 | Добавьте пенициллин и стрептомицин перед применением |
| <сильно>солевой раствор (1,2% NaCl) | <сильный>1,5 л раствора | ||
| >18 г натрия хлорида в 1500 мл ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Автоклавный солевой раствор для стерилизации |
| 1,5 мл 100-кратного пенициллина/стрептомицина | Hyclone | SV30010 | Добавить пенициллин и стрептомицин перед применением |
| <сильно>Дополнительное оборудование и материал: | |||
| 7-L камера | мышей В соответствии с утвержденным протоколом IACUC No V001551 | ||
| мыши | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, самка, 6-недельный возраст, мышь | |
| CO2 бак и регулятор | без патогенов | ||
| 24-луночный планшет для культуры тканей | TPP | 92424 | |
| 1-л объемные | |||
| Источник света (150 Вт) | Центрифуга Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| охлаждаемая, качающееся ведро | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge флаконы (250 мл) | Nalgene | ||
| 15-мл центрифужные пробирки, стерильные | Corning | 430053 | |
| Стерильные одноразовые трансферные пипетки | 1371120 | Фишера | |
| 0,22 & микро; m Предварительно стерилизованный одноразовый фильтр для бутылок | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Блендер из нержавеющей стали | Waring Коммерческая | модель 51BL31 | |
| Чашка блендера, емкость 100 мл | Waring Коммерческий | ||
| инвертированный составной микроскоп | Nikon Instruments | Эклипс TE300 |
Ссылки
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191(2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
