Эта статья описывает протокол для крупных стерильных изоляции и коллекции свободноплавающих miracidia человеческой крови fluke Schistosoma mansoni и их последующей обработки для введения в культуру в пробирке .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Массовые изоляции и культивирования In Vitro Intramolluscan стадий человеческой крови Fluke Schistosoma Mansoni
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человеческой крови сосальщики, Шистосомы spp., имеют сложный жизненный цикл, который включает бесполыми и сексуальной фаз развития внутри улитки промежуточные и млекопитающих окончательного хозяина, соответственно. Способность изолировать и поддерживать различные жизненного цикла этапов в vitro условиях культура в значительной степени способствовало расследований сотовой, биохимических и молекулярных механизмов, регулирующих паразита роста, развития и принимающих взаимодействий. Передача о шистосомоза требует бесполое размножение и развитие нескольких личиночных стадий в узле Улитка; от инфекционных miracidium, через первичных и вторичных sporocysts, в cercarial стадии, инфекционный для людей. В этой статье мы представляем пошаговые протокол для массового штриховки и изоляции Schistosoma mansoni miracidia из яйца, полученные от печень инфицированных мышей, и их последующее введение в культуру в пробирке . Предполагается, что подробный протокол будет поощрять новых исследователей заниматься и расширения этой важной области schistosome исследований.
Введение
Человека кровь сосальщики Schistosoma spp., уже возбудителей о шистосомоза, забытых тропических болезней, от которых страдает примерно 230 миллионов человек во всем мире1. Наиболее распространенных видов, Schistosoma mansoni, географически распределены в Южной Америке, Карибском архипелаге, Ближнем Востоке и к югу от Сахары Африке2. Жизненный цикл S. mansoniи другие шистосомоз, сложные, включающие млекопитающих принимающей окончательные и пресноводных улиток род Biomphalaria , которые служат в качестве облигатного промежуточных хозяев.
S. mansoni му....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все Уход за животными и экспериментальной процедуры были утверждены институциональный уход за животными и использования Комитетом из университета Висконсин-Мэдисон протоколом не. V005717. Следующий протокол включает в себя работу в объекте 2-го уровня биобезопасности (BSL2) для патогенов человека, хотя ни один из этапов schistosome, изображенные в этом протоколе инфекционный людей или других млекопитающих. Следуйте институциональную политику для обработки 2 группы риска (RG2) патогенов человека.
Примечание: Мы используем самок мышей Swiss-Уэбстер (6 - старый неделю) из-за их более высокой подверженности инфекции10, т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Подавляющее большинство miracidia обычно будет были собраны в первых двух «урожай». Инкубация изолированных miracidia в СГБМ + инициирует процесс трансформации miracidium Спороциста (Рисунок 4A- C). В течение первого часа следующие передачи культуры скважин, содержащие CBSS +, большинство miracidia прекратить плавания (рис. 4A). В 6 ч в культуре miracidia занимаются активно пролить их мерцательного эпидермального.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Miracidia S. mansoni, изолированные и манипулировать, как описано в настоящем документе, может заразить только Улитка промежуточного узла и поэтому не представляют человека биологической во время этой фазы развития личинок. Однако чтобы избежать случайного воздействия/инфекции улиток, уход следует выполнять miracidial изоляции в месте, отличном от районов, где восприимчивых видов Biomphalaria Улитка может быть настоящей или сохранить. Отдельную комнату, зарегистрирована как BSL2 пространства, настоятель.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Частично финансируется гранта NIH RO1AI015503. Schistosome инфицированных мышей были предоставлены NIAID шистосомоз ресурсный центр биомедицинских научно-исследовательском институте (Роквилл, MD) через низ-NIAID контракт HHSN272201000005I для распространения через BEI ресурсов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Сбалансированный раствор соли Чернина (CBSS+) | <сильно>На 1 л раствора | ||
| >2,8 г хлорида натрия | Fisher Scientific | S271-3 | Растворите соли, кроме хлорида кальция, и |
| 0,15 г хлорида калия | Sigma-Aldrich | P5405 | сахара в 800 мл ddH2O |
| 0,07 г натрия фосфата, двухосновного безводного Fisher | Scientific | S374-500 | Растворить хлорид кальция отдельно в 200 |
| 0,45 г гептагидрата сульфата магния | Sigma-Aldrich | M1880 | мл ddH2O |
| 0,53 г дигидрата хлорида кальция | Mallinckrodt | 4160 | Медленно добавить кальциевый раствор в соль/сахарный раствор с |
| 0,05 г гидрокарбоната натрия | Fisher Scientific | S233-3 | при постоянном перемешивании |
| 1 г глюкозы | MP Biomedicals | 152527 | Отрегулируйте до pH 7,2 и простерилизуйте фильтром с помощью a |
| 1 г трегалозы | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 &; m одноразовый фильтр для бутылки |
| 10 мл 100X пенициллин/стрептомицин | Hyclone | SV30010 | Добавить отфильтрованный пенициллин и стрептомицин soln предыдущее применение |
| <сильный>неполный Bge средний (Ibge) | <сильный>Для 900 мл раствора | ||
| 220 мл Schneider' s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Смешайте среду Schneider's с 680 мл ddH2O |
| 4,5 г ферментативного гидролизата лактальбумина | Sigma-Aldrich | L9010 | Добавьте гидролизат лактальбумина и галактозу |
| 1,3 г галактозы | Sigma-Aldrich | G0625 | Отрегулируйте до pH 7,2 и простерилизуйте фильтром с помощью 0,22 µ m предварительно стерилизованный одноразовый фильтр для бутылок |
| <сильный>полный Bge medium (cBge) | Для 100 мл раствора | ||
| 90 мл Неполная Bge среда | Для термоинактивации FBS: Инкубировать размороженный FBS в | ||
| 9 мл тепловой сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | водяная баня при температуре 60°С; С в течение 1 часа при этом мягко |
| 1 мл 100X пенициллин/стрептомицин | Гиклон | SV30010 | взбивая флакон каждые 10 мин<бр/> Аликвот термоинактивированный FBS в 15-мл пробирки <бр/> и хранить при -20°C. Смешайте среду + FBS и простерилизуйте фильтром с помощью 0,22 & микро; m предварительно стерилизованный одноразовый фильтр для бутылок Добавьте пенициллин и стрептомицин перед применением |
| Pond water (стоковый раствор)< | >1л стокового раствора | ||
| 12,5 г карбоната кальция | Fisher Scientific | C64-500 | Смешайте все соли в 1л ddH2O |
| 1,25 г карбоната магния | Fisher Scientific | M27-500 | Обратите внимание, что соли не будут иметь полностью |
| 1,25 г натрия хлорид | Fisher Scientific | S271-3 | растворенный. Энергично встряхните, чтобы приостановить |
| 0,25 г солей хлористого калия | Sigma-Aldrich | P5405 | перед внесением рабочего раствора; |
| <сильная>прудовая вода (рабочий раствор) | <сильная>1,5 л раствора | ||
| 0,8 мл прудовой воды (встряхнуть перед использованием) в | Смешайте бульон с ddH2O | ||
| 1500 мл ddH2O | Стерилизуйте воду из пруда путем автоклавирования (медленно цикл) | ||
| 1,5 мл 100Х пенициллин/стрептомицин | Гиклон | SV30010 | Добавьте пенициллин и стрептомицин перед применением |
| <сильно>солевой раствор (1,2% NaCl) | <сильный>1,5 л раствора | ||
| >18 г натрия хлорида в 1500 мл ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Автоклавный солевой раствор для стерилизации |
| 1,5 мл 100-кратного пенициллина/стрептомицина | Hyclone | SV30010 | Добавить пенициллин и стрептомицин перед применением |
| <сильно>Дополнительное оборудование и материал: | |||
| 7-L камера | мышей В соответствии с утвержденным протоколом IACUC No V001551 | ||
| мыши | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, самка, 6-недельный возраст, мышь | |
| CO2 бак и регулятор | без патогенов | ||
| 24-луночный планшет для культуры тканей | TPP | 92424 | |
| 1-л объемные | |||
| Источник света (150 Вт) | Центрифуга Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| охлаждаемая, качающееся ведро | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge флаконы (250 мл) | Nalgene | ||
| 15-мл центрифужные пробирки, стерильные | Corning | 430053 | |
| Стерильные одноразовые трансферные пипетки | 1371120 | Фишера | |
| 0,22 & микро; m Предварительно стерилизованный одноразовый фильтр для бутылок | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Блендер из нержавеющей стали | Waring Коммерческая | модель 51BL31 | |
| Чашка блендера, емкость 100 мл | Waring Коммерческий | ||
| инвертированный составной микроскоп | Nikon Instruments | Эклипс TE300 |
Ссылки
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
