Method Article

Вскрытие и подготовка корональных срез развития гипофиза мыши

DOI:

10.3791/56356

⸱

November 16th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pathophysiology, Second Military Medical University, 2Department of Cell Biology, Second Military Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол вскрыть гипофиза и подготовить гипофиза коронковой части из развивающихся мышей.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза. Он состоит из двух желез с отдельным эмбриональное происхождение и функций — neurohypophysis и adenohypophysis. Развивающихся гипофиза мыши маленькие и тонкие с удлиненной овальной формы. Корональных разделе предпочтителен для отображения в adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши.

Целью настоящего Протокола является достижение надлежащего гипофиза корональных секции с архитектурами хорошо сохранившиеся ткани из развивающихся мышей. В этом протоколе мы подробно описывают, как анализировать и обрабатывать гипофиза правильно из развивающихся мышей. Во-первых мыши фиксируются transcardial перфузии формальдегида до вскрытия. Затем три различных рассечения методы применяются для получения нетронутыми гипофиза в зависимости от возраста мышей. Для плода мышей возрасте от новорожденных и эмбриональных дней (E) 17.5-18,5 до 4 дней, разделяются всей Селла регионов, включая клиновидной кости, железы и тройничного нервов. Для щенков возрасте послеродовой (P) 5-14 дней, гипофиза связано с тройничного нервов разделяются в целом. Для мышей более 3 недель гипофиза тщательно расчлененный бесплатно от окружающих тканей. Мы также отображать как внедрять гипофиза в надлежащей ориентации с помощью окружающих тканей как ориентиры для получения удовлетворяющих корональных секций. Эти методы полезны при анализе гистологические и развития функции гипофиза в разработке мышей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза1,2. Анатомически гипофиз является '' два в одном '' структура, состоящая из neurohypophysis и adenohypophysis. Эти компоненты имеют разные эмбриональное происхождение и функции очень по-разному. Neurohypophysis является производным от нейронных эктодермы и выделяет окситоцина и антидиуретического гормона. Adenohypophysis происходит от Ратке в мешочек и несет ответственность за освобождение гормонов, в том числе гормон роста, пролактина, тиреотропный гормон, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, Адренокортикотропный гормон, и 3,– меланоцитов, стимулирующий гормон4,5.

Гипофиз опирается на дорсальной поверхности клиновидной кости (турецкого седла) мыши черепа и прикреплена к полу мозга хрупкий стебель. Он окружен боково тройничного нервов и кпереди от зрительных нервов6,7. Железы обладает удлиненной овальной формы с его длинной оси, перпендикулярной, головы. На спинной поверхности neurohypophysis и adenohypophysis можно легко быть разграничены, с бывших оккупирующих спинной медиальной региона и последнего расширения боков и вентрально. Во время послеродового развития размер гипофиза увеличивается быстро, в первый месяц после рождения8,9. Тем не менее гипофиза мыши все еще очень маленький в размер, средний вес 1,9 мг и Лонг ось диаметром ~ 3 мм в взрослых10, длинные оси диаметром 2-2,5 мм на послеродовой день 21 (P21) и только 1-1,5 мм на P0.

Корональных разделе предпочтителен для отображения adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши. Однако некоторые технические навыки требуются для получения удовлетворяющих коронковой части гипофиза из развивающихся мышей из-за его исключительно небольшой размер и собственный анатомии. В этом видео статьи мы демонстрируем как вскрыть гипофиза мыши и подготовить гипофиза корональных секции на различных этапах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

мышей C57BL/6 разводят в конкретных условиях возбудителя бесплатно. Всех животных экспериментальные методы в соответствии с руководящими принципами, утвержденными животное уход и Комитета по этике на второй военный медицинский университет.

1. рассечение из послеродового развития гипофиза

  1. выполнения анестезии: состоится дробленый лед, чтобы побудить гипотермии новорожденных мышей (P0 - P5). Для мышей старше 5 дней возраста придать 5% уретана (30 мкл/г веса тела) внутрибрюшинно побудить анестезии. Оценка ответов на хвост/мыс щепотки. Только после того, как мышь не реагирует на раздражители вредных.
  2. Обеспечения мыши в лежачем положении (лежа на спине с лицом вверх), осторожно лентой передних лапах и hindpaws к рабочей поверхности, которая может быть закреплена (т.е., пенопласт) внутри Химический вытяжной шкаф.
  3. Выполнения transcardial перфузии.
    1. Разрезать грудную клетку мыши с Ножницы хирургические подвергать сердца (и других органах грудной клетки).
    2. Безопасный бьющееся сердце с тупым щипцами и вставьте иголку 26G (0,45 мм) левого желудочка. Игла крепится к 10 мл шприц, наполненный гепаринизированным фосфатный буфер (PBS; дополнена нитрит натрия 5 мг/мл и 10 ед/мл гепарина, рН 7,4, нагреть до 37 ° C перед использованием). Немедленно сократить правое предсердие с тонкой ножницы и приступить к perfuse тела с теплым PBS, до тех пор, пока жидкость, выход из правого предсердия ясно.
      Примечание: Приблизительно 5-10 мл, PBS требуется для новорожденных мышей и 10-20 мл PBS для взрослых мышей.
    3. Храните иглу в месте и изменить на другой шприц, наполненный параформальдегида 4% (PFA; рН 7,4). Perfuse 10 мл и 20 мл фиксатором для новорожденных и P21 мышь, соответственно.
      Предупреждение: PFA является токсичным. Это может вызвать кожи и раздражения дыхательных путей и повреждение глаз. Надевайте перчатки и работают под капотом химического.
  4. Обезглавить PFA-Исправлена мыши и разрезали кости черепа с ножницами.
    1. Аккуратно снять задний мозг от основания черепа с небольшой щипцами. При первых признаках турецкого седла отмены остановки, но держите задний мозг, вырезать гипофиза стебля и нервных волокон, подключение к основанию мозга с тонкой ножницами. Этот шаг очень важен для обеспечения что гипофиза не ликвидируется прочь с мозгом.
    2. Затем держать подъема мозга и удалите весь мозг полностью подвергать гипофиза. Вырезать весь sella региона, в том числе гипофиза, боковые тройничного нервов и под клиновидной кости с ножницами (примерно 3 x 5 мм 2).
  5. Положить Иссеченную ткань в блюдо 35 мм или одной скважиной 6-ну пластины, содержащий 2 мл холодной 4% PFA (рН 7,4). Исправить ткани на 4 ° C для 40 мин для P0 - P7 pituitaries, 1 ч для P14 pituitaries, 1,5 ч за P21 - P28 pituitaries и 3 h для взрослых pituitaries.
  6. Дальнейшее диссоциации гипофиза
    1. мыть фиксированной ткани с 10 мл PBS, 5 изменения, 15 мин. Новорожденных гипофиза вместе с его окружающих тканей и под клиновидной кости могут быть обработаны непосредственно к обезвоживанию. Однако, следует отделить гипофиза от мышей старше 5 дней далее под микроскопом стерео.
    2. Поместить фиксированный ткани в блюдо 35 мм, содержащие 1 мл PBS. Для P5 - P14 pituitaries, удалите соединительной оболочки между нервов и костей с тонкой щипцами и ножницы и тщательно изолировать гипофиза вместе с боковыми тройничного нервов в целом, но оставляя турецкого седла. Изолированные железы и нервов связаны соединительной оболочки с " H "-нравится внешний вид ( рис. 1B).
      3. Pituitaries
    3. за P21 и взрослых, удалить нервы и соединительной мембраны вокруг гипофиза и свободного железа от окружающих тканей. Оберните гипофиза ткани с объективом, очистка папиросной бумаги и положить его в внедрения кассету.
      Примечание: Упаковка крошечные гипофиза с объективом, очистка папиросной бумаги помогает предотвратить любые потенциальные потери образцов и сохранения целостности тканей в следующей процедуре парафин встраивание. Это не может быть необходимо обернуть гипофиза, если оно обрабатывается в маленькую бутылку в процедуре крио встраивание.

2. Парафин встраивание и Sectioning

  1. дигидрат образцов в встраивание кассеты с 50%, 65%, 75% и 95% растворы этанола за 15 мин. Впоследствии обезвоживает с 3 изменения чистого этанола, 3 мин для P0 - P4 желез, 4 мин для P5 - P14 желез и 5 мин за P21 и старше желез. Снимите с ксилол 3 изменения, 3 мин для P0 - P4 желез, 4 мин для P5 - P14 желез и 5 мин за P21 и старше желез. Проникнуть в расплавленный парафин, 3 изменения, 7 мин для P0 - P4 желез, и 8 мин дважды следуют 6 мин один раз для P5 и старше желез.
    Примечание: Оптимальные параметры для обработки ткани может быть эмпирически скорректирована. Для получения высокого качества разделы, следует избегать недостаточно или более обезвоживания. То же самое верно для очистки ткани, используя ксилол.
  2. Ориентация при внедрении
    1. на ткани, встраивание консоль системы, удалить образцы из кассеты и поместить его в базовой формы наполовину заполненный с расплавленного парафина. Правильной ориентации внедрения гипофиза имеет важное значение для удовлетворения корональных секций.
    2. За P21 и взрослых гипофиза, позиция гипофиза с ее короткой оси перпендикулярно нижней поверхности базовой формы (плоскости сечения). Используйте клиновидной кости и тройничного нервов анатомические ориентиры для P0 - P4 и P5 - P14 pituitaries, соответственно. Ориент образцов с их тройничного нервов или поперечные пластинки клиновидной кости перпендикулярно нижней поверхности базы плесень.
    3. Аккуратно прижмите ткани в нужном положении с утепленным тонкой щипцами, до тех пор, пока воск становится полутвердых на охлаждения пластины. Долейте плесень с расплавленного парафина. Разрешить блок парафином остыть до тех пор, пока воск полностью затвердевшим.
      Примечание: Гипофиза в эмбриональных день 18,5 (E18.5) могут рассматриваться таким же образом как новорожденных гипофиза. Но pituitaries (Ратке ' s Чехлы) моложе E16.5 должны быть внедрены с всю голову и ориентированы с сагиттальной оси (от устья до затылка) перпендикулярно нижней поверхности базы плесень.
  3. Chill блоком парафина в-20 ° C для 10-20 мин и затем сократить его на тонкие ломтики (4 мкм толщина предпочтительнее) с микротома. Чтобы получить удовлетворительный корональных секции, тонкой настройки позиции парафиновых блоков при резании. Смонтировать фрагменты тканей на polylysine покрытием стекла слайды для предотвращения отряд срезов в следующих процедурах.
    Примечание: Кроме того, образцы могут быть обезвоженной в 15%, 30% (W/V) сахарозы решения (PBS) при 4 ° C до тех пор, пока они опускаться на дно, встроенных в крио встраивание соединение, используя тот же метод ориентации и быстро заморожены на сухой лед. Затем нарежьте ломтиками 8-10 мкм, с помощью криостата блоков замороженные ткани. Морфология крио секции, однако, уступает часто парафин секций.

3. H & E окрашивание и Этикетировочный иммунофлуоресценции

  1. теплый слайды на огне блокировать при 55 ° C и dewax ксилол, 2 изменения, 4 мин. Обезвоживает образцы с дважды этанола 95% и 75% этанола дважды, 3 мин. Вымойте слайды с дистиллированной водой для 5 мин на шейкере.
  2. Для H & E окрашивание, краситель разделы в раствор квасцов гематоксилином 6 мин, промойте в РаннING водопроводной воды для 2 мин, дифференцировать с 0,2% аммиачной воды для 45 s и повторно промыть в проточной воде в течение 2 мин. Затем обезвоживает секции с 95% этиловом спирте, за 1 мин и окрашиваются эозином на 2 мин последовательно обезвоживать, очистить и смонтировать.
  3. , Этикетировочный иммунофлуоресценции
    1. лечения разделы с метанолом, содержащие 3% H 2 O 2 и 0,01% НАН 3 20 мин при комнатной температуре для инактивации эндогенной пероксидазы. Извлечение антигены путем кипячения секций в буфере извлечения (ЭДТА 1 мм и 1 мм трис-HCl, рН 7,4) в скороварку на 2 мин инкубировать в разделах с блокирующий буфер (5% козьего сыворотки в PBS) за 30 мин при 37 ° с.
    2. Инкубировать секции с кролик гормон против роста (GH) антитела (1:2, 000) или антител анти глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) Кролик (1:2, 000) разводят в блокирующем буфере на ночь в отеле 4 ° C.
    3. Секции с вторичное антитело (коза анти кролик IgG-ПХ, 1: 300 в блокирующем буфере) Инкубируйте 35 мин 37 ° C.
    4. Усилить сигналов с помощью Biotinyl Tyramide (1:50 в буфер Tris физиологического раствора, содержащего 0,3% H 2 O 2) для 15 мин при комнатной температуре и визуализировать стрептавидина-Alexa594 или 488 (1: 300 в блокирующем буфере, 30 мин, 37 ° C).
    5. Counterstain ядер с DAPI (50 мг/Л в PBS) за 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Это не может быть необходимо усилить сигнал с помощью системы Tyramide усиления сигнала (TSA). Кроме того, вторичное антитело проспряганное флуоресценции может использоваться для визуализации сигнала.
  4. Получить изображения с помощью микроскопа флуоресценции оснащены × 4/0,13 DAPI, Техас красный и FITC наборы фильтров, чтобы × 40/0,75 цели и 5,0 мегапиксельной камерой. Используйте 360, 488 и 594 Нм лазер длиной волны для визуализации DAPI, Alexa 488 - и Alexa 594-окрашенных участков, соответственно. Оптимизировать мощность лазера (0,8 был использован как правило) и время экспозиции для желаемого уровня для каждого канала. Захватить изображение под контролем образ приобретение программного обеспечения и наложения изображений флуоресценции, впоследствии с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет метод для того чтобы рассечь гипофиза из развивающихся мышей. Для новорожденных мыши, регионов всей Селла, содержащей гипофиза, тройничного нервов и под клиновидной кости были расчленены от основания черепа. Крошечные и деликатный гипофиза остались нетронутыми во время процесса (рис. 1A). Для мышей старше 5 дней, гипофиза, прилагается к боковой тройничного нервов затем были изолированы. Валового структура гипофиза, изолированы от P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для разработки мышиных pituitaries, он был технически трудно получить правильное корональных секции из-за их маленькие и хрупкие особенности и уникальные анатомические характеристики6,8. Таким образом, некоторые исследовательские группы выбрал середине сагиттальной разделы для анализа морфологии гипофиза эмбрионов и новорожденных в11,12. Хотя в середине сагиттальной части гипофиза способен также показаны ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана субсидии от национального естественных наук фонд Китая (31201086, 31470759 и 31671219) и Шанхай фонда естественных наук (12ZR1436900).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
инструменты/оборудование
Хирургические ножницы-прямыеJinZhongJ21010можно приобрести у других продавцов
Тонкие ножницы-стрейнгтJinZhongWA1010можно приобрести у других продавцов
Тупые щипцыJinZhongJD1020можно приобрести у других продавцов
Тонкие щипцыDumontRS-5015для выделения гипофиза
26G (0,45 мм) иглаHongDaдля транскардиальной перфузии
Шприц (1 мл)BD300841можно приобрести у других производителей
Шприц (10 мл)BDможно приобрести у других производителей
Чашка 35 ммCorning430165можно приобрести у других продавцов
Бумага для чистки линзShuangQuanможно приобрести у других производителей
Анатомический микроскопOLYMPUSSZX-ILLB2-200можно приобрести у других производителей
Встраиваемая кассетаThermo Fisher22-272423можно приобрести у других производителей
Система встраивания салфетокKEDEEKD-BM11можно приобрести у других производителей
МикротомThermo FisherHM315Rможно приобрести у других производителей
Горки Superfrost-PlusThermo Fisher22-037-246можно приобрести у других производителей
Защитное стеклоThermo Fisher12-543можно приобрести у других производителей
Флуоресцентный микроскопOLYMPUSBH2-RFCAможно приобрести у других
<производителей>Название>CompanyНомер в каталогеКомментарии<
strong>Реагенты
УретанBBIEB0448
NaClSigmaS9625для PBS
KClSigmaP9541для PBS
Na2HPO4.12H2OSigma71650для PBS
K2HPO4SigmaP2222для PBS
NaNO2Sigma237213
гепарин натрия для инъекцийSPHH31022051для перфузии физиологического раствора
параформальдегида (PFA)SigmaP6148
ЭтанолSCR10009218
КсилолSCR10023418
парафинThermo Fisher8330
ГематоксилинSigmaH9627для H& E окрашивание
Eosin YSigmaE4009for H& E окрашивание
кролика против гормона роста (GH)Национальный гормондля иммуноокрашивания
антителПрограмма гипофиза
Кролик против мышей GFAP антителаSigmaG9269для иммуноокрашивания
Козий антикролик IgG, HRPJackson111-035-003для иммуноокрашивания
TSA системаNEN Life Science ProductsNEL700для иммуноокрашивания
стрептавидин, Alexa Fluor 594Thermo FisherS32356для иммуноокрашивания
Anti-FITC Alexa Fluor 488Thermo FisherA11090для иммуноокрашивания

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
  2. Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
  3. Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
  4. Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
  5. Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
  6. Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
  7. Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
  8. Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
  9. Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
  10. Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
  11. Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
  12. Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
  13. Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
  14. Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pituitary Gland DissectionCoronal Section PreparationMouse Pituitary DevelopmentTissue Embedding TechniqueSellar Region IsolationTrigeminal Nerve OrientationParaffin Wax SectioningHistological Analysis MethodImmunolabeling CompatibilityDeveloping Mouse Pituitaries

Related Articles