Метод альтернативной культуры для поддержания геномной Hypomethylation мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием MEK ингибитор PD0325901 и витамином С

Клетки ES возникли от ICM бластоциста¹. Клетки находятся в состоянии плюрипотентности и могут образовывать все соматические линий и микрофлорой клетки². Создание клеток ES обеспечивает возможность исследовать развитие процессов в пробирке и может генерировать клетки медицинской значимости для регенеративной медицины, основанной на их плюрипотентности³.

Seminally созданы две группы линий клетки мыши ES в 1981 году и когда клетки, полученные из раннего эмбриона мыши были культивировали в плода бычьим сывороточным (ФБС)-содержащих средний с мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) как фидер слой^1,4 . MEFs были инактивированных mitotically и предварительно были выращены в блюда до культивирования клеток ES. MEFs обеспечивают поддержку для мыши ES клеток вложения и производят факторов роста для содействия распространению и подавления дифференциация⁵, в то время как FBS предлагает основные трофических факторов и гормоны для пролиферации клеток. Последующие исследования указали, что LIF, производимые клетки фидера был ключевых цитокинов для самообновления и поддержания плюрипотентности в ES клеток мыши, и добавлением LIF в среду может подменить фидер клетки⁶. В настоящее время самообеспечение мыши ES клеток в среде FBS/LIF на кормушки-прежнему стандартный метод, принятый многими исследователями. Однако с этим подходом классической культуры возникают некоторые проблемы. Во-первых фидер клетки секретируют избыток и неконтролируемых факторов и может вызвать загрязнение патогенными⁷. Чтобы избежать этого вмешательства, покрытие поверхности блюда с желатином и добавлением LIF в сыворотке содержащих среднего, альтернативные методы для поддержания клеток мыши ES без подачи слоя клеток. Кроме того клетки ES мыши, выращенной в условиях, сыворотка/LIF экспонат морфологическая гетерогенность популяции клеток и даже уровень экспрессии факторов, связанных с плюрипотентности⁸. Последние исследования показывают, что в сыворотке/LIF условиях, связанных с плюрипотентности основных факторов транскрипции (включая SOX2, Nanog и OCT4) могут поддерживать плюрипотентности через LIF и WNT сигнализации; Однако в частности, они также активировать фибробластов фактор роста (ФБП) сигнал для запуска дифференцировки⁸. Из-за двойственной двойного действия основных факторов транскрипции мыши ES клетки культивировали в сыворотке представляют неоднородность, состоящий из двух взаимозаменяемых популяций, один похож на ICM и другой похожий загрунтовать Эпибласт государства⁸. Кроме того мышь ES клеток в сыворотке крови часто exhibit глобальной hypermethylation⁹, тогда как ICM и PGCs находятся в состоянии глобального hypomethylated, который тесно связан с их плюрипотентности^9,10.

Существует значительный спрос для разработки новых методов для культивирования клеток мыши ES. С 2003 года¹¹ были созданы несколько более протоколов, но продолжает быть некоторые ограничения и недостатки⁷. С 2008 года, комбинированного использования двух малых молекул протеинкиназы ингибиторов, PD0325901 (ингибитор Митоген активации протеинкиназы (MAPK) / внеклеточных сигналов регулируемой киназы (Эрк) (МЭК)) и CHIR99021 (ингибитора синтазы гликогена Киназа 3 (GSK3)), в N₂B₂₇ средних с LIF и без сыворотки открыло новые перспективы для культивирования мыши ES клеток¹². Это новое средство определенных характеризуется использованием двух ингибиторов (2i). Мыши ES клетки культивировали в среде 2i/LIF более однородны в клеточных популяций и выражение плюрипотентности факторов. Кроме того клетки мыши 2i/LIF-культивированный ES экспонат ДНК hypomethylation глобально, который ближе к ICM-подобных клеток^9,13. Несмотря на это 2i культура имеет свои недостатки. PD0325901 и CHIR99021 нерастворимы в воде и как правило, растворяются в диметилсульфоксида (ДМСО)-на основе фондовых решение, чтобы добавить их в питательную среду. Исследования показали, что долгосрочный и воздействия низких доз клеток ДМСО может привести к цитотоксичность¹⁴.

Здесь, мы использовали две небольшие молекулы соединений и разработали новый метод культуры клеток мыши ES. Роман культуры метод сочетает ингибитор PD0325901 Vc и MEK содействовать ДНК hypomethylation быстро и эффективно на сопоставимый уровень PGC, названный как Vc/PD0325901 культивирования протокола. Мышь ES клеток в среде Vc/PD0325901-добавлена сыворотки содержащих экспонат однородности в морфологии и выдержаны в первом состоянии. По сравнению с 2i культуры, мыши ES клетки культивировали в условиях Vc/PD0325901 выставку быстрее кинетика ДНК деметилирования и может достичь уровня hypomethylation, сопоставимую с PGC. Кроме того, использование одного ингибитора (PD0325901) уменьшает ввода ДМСО в среду по сравнению с используемой в 2i (PD0325901/CHIR99021) и уменьшает повреждения клеток.

1. Подготовка

1. Подготовить раствор 1,0 мм PD0325901 (МЭК ингибитор) и 3,0 мм CHIR99021 (ингибитор GSK3).
   1. Весят 2 мг PD0325901 и добавьте 4.15 мл ДМСО во флаконе из темного стекла.
   2. Весят 2 мг CHIR99021 и добавьте 1,43 мл ДМСО во флаконе из темного стекла.
   3. Следующие растворения, хранить аликвоты (50 мкл/трубки в 200 мкл пробирках, ПЦР) при-20 ° C и защищены от света. Удаление трубка, содержащая замороженные запасы из морозильника и разморозить при комнатной температуре перед использованием.
2. Весят 0.0176 g Vc 1 мл пластиковых пробирок и воссоздать его с 1 мл стерильной воды до конечной концентрации 100 мм до использования.
3. Инактивирует FBS: Инкубируйте 500 мл FBS в водяной бане в 56 ° C за 30 мин.
4. Подготовка 600 мл базовой среды для культивирования клеток мыши ES.
   1. Используйте бутылку DMEM/высокий средний глюкозы (500 мл) и удалить 40 мл.
   2. Дополнение 460 мл DMEM/высокий средний глюкозы с 20% инактивированная FBS (120 мл), 1000 ед/мл LIF (60 мкл 10⁷ ед/мл Стоковый раствор), 0,1 мм несущественные аминокислот (NEAA) (6 мл 10 мм раствор), пируват натрия 1 мм (6 мл Стоковый раствор 100 мм) , 2 мм L-глютамин (6 мл 200 мм раствор), 0,1 мм β-меркаптоэтанол (600 мкл Стоковый раствор 100 мм) и 33 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 33 мкг/мл (2 мл пенициллин стрептомицином смешанного раствора (10 000 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 10 000 мкг/мл)) . Определите основные среды как сыворотки среднего.
   3. Пипетка 50 мкл Стоковый раствор PD0325901 (1,0 мм) и Vc (100 мм), соответственно, в 50 мл сыворотки среды (конечная концентрация: 1.0 мкм PD0325901 и 100 мкм Vc) и определить средство как Vc/PD0325901 среды.
      Примечание: Подготовьте средних свежих Vc/PD0325901 перед использованием из-за нестабильности Vc.
   4. С помощью пипетки, передачи 50 мкл Стоковый раствор PD0325901 (1,0 мм) и CHIR99021 (3,0 мм), соответственно, в 50 мл сыворотки среды (конечная концентрация: PD0325901 1.0 мкм и CHIR99021 3,0 мкм) и определить средства как 2i среднего.
5. Готовить блюда желатин покрытием.
   1. Подготовьте 0,1% раствор желатина: растворить в 300 мл ультрачистая вода в стеклянной бутылке реагента с крышкой 0,3 г желатина и стерилизовать в автоклаве при температуре 121 ° C для хранения 20 мин стерильный раствор при комнатной температуре.
   2. Проинкубируйте блюда культуры клеток (диаметр 6 см) с 2 мл 0,1% раствора желатина для 15 мин при комнатной температуре и затем аспирационная желатин. Сухие блюда в воздухе и использовать их в течение 12 ч.
6. Подготовка 10 мл клетки мыши ES замораживания среды в пластиковых пробирок 15мл: 90% FBS (9 мл) и 10% ДМСО (1 мл). Используйте средство в течение 1 дня.
7. Подготовить заморозки контейнера: добавить 100% изопропиловый спирт до линии заполнения контейнера, замораживания и отбросить старые изопропиловый спирт. Добавьте новые изопропиловый спирт непосредственно после использования каждый пятый.
8. Сделать буфер ферментативного пищеварения: вес 1.2114 г трис порошка в 100 мл ультрачистая вода подготовить 100 мм трис раствор и добавить концентрированный раствор HCl (около 12 М) в решение трис для регулировки рН 7,6 (около 0,6 мл концентрированный раствор HCl).
9. Подготовка 50 мл буфера assay иммунопреципитации радио (Буфер RIPA): 20 мм трис, рН 7,4, 1 мм MgCl₂, 150 NaCl, 20% глицерина, 0,5% NP40, 1 мм ЭДТА, 1 мм EGTA. Дополнение с 1 мм DTT, 1 X ингибитор протеазы коктейль и 1 мм PMSF до использования. После добавления PMSF используйте буфер в течение 30 мин.

2. рост клеток ES мыши на желатин покрытием блюда

1. Предварительно теплой мыши ES клеток (дикого типа, 129 SvEv) культура среднего, трипсина и раствора фосфатного буфера (PBS) в водяной бане при температуре 37 ° C.
2. Проход клетки. Аспирационная средне полностью от блюдо и пипетки 2 мл PBS блюда для полоскания клетки.
   1. Удаление PBS с пипеткой и вымыть клетки снова с 2 мл ФСБ.
   2. Удаление PBS и добавление 0,3 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в каждое блюдо.
   3. Быстро охватывают весь блюдо с трипсина и затем удалите его сразу же.
   4. Поместите блюдо в инкубаторе при 37 ° C за 1 мин до отсоединения клетки от блюдо. Возьмите блюда из инкубатора и добавить 2 мл среды подогретым сыворотки прекратить действие трипсина.
   5. Отмежеваться колоний ячеек в одну ячейку подвеска, resuspending с пипеткой (5 мл наконечник пипетки) в 10 раз.
3. Перевести 150 мкл 2 мл раствора клеток (около 190 000 клеток путем подсчета с Горяева) в новое блюдо желатин покрытием и дополнить с 3 мл свежеприготовленной Vc/PD0325901 среды в 6 см культуры блюдо. Культура клетки в инкубаторе 37 ° C с 5% CO₂.
4. Каждые 24 часа во время инкубации, удалите старый питательной среды и добавить 3 мл свежего Vc/PD0325901-средних в культуры блюдо из-за нестабильности confluency Vc. Expect 70 – 80% после 2-3 дня.
5. После достижения 70-80% confluency, проход клетки и продолжать культура их как описано в шагах 2.2-2.4.

3. Замораживание и размораживание мыши ES клеток

1. Замораживание клеток мыши ES.
   1. Отсоедините клетки от блюда с трипсином, выполнив шаг 2.2.
   2. Перенесите клетки в 15 мл пластиковых труб и центрифуги на 800 x g и комнатной температуре 3 мин.
   3. Дамп супернатант мягко в стакан и Ресуспензируйте клетки лепешка с 1 мл раствора свежеприготовленные замораживания среднего. Подготовьте замораживание среднего 30 мин до этот шаг, чтобы убедиться, что это комнатной температуре перед использованием.
   4. Клетки в замораживания среднего к трубе microcentrifuge 1.8 мл с пипеткой 1 мл перехода и место пробки microcentrifuge в контейнер замораживания. Добавление изопропиловый спирт до линии заполнения контейнера, замораживания и держать его при комнатной температуре перед использованием.
   5. Оставьте на ночь морозильные контейнеры в морозильной камере-80 ° С.
   6. Передача microcentrifuge трубы к контейнеру жидкого азота на срок до 2-3 лет.
      Примечание: Не держите клетки в среде замораживания на долгое время и быстро передавать клетки в морозильной камере-80 ° C из-за токсичности ДМСО.
2. Размораживание мыши ES клеток.
   1. Предварительно теплой 50 мл сыворотки среды в ванну воды 37 ° C.
   2. Взять из клеток содержащих флакон из контейнера жидкого азота и погружать ограничен флакона в ванну воды 37 ° C. Быстро встряхните его в водяной бане таять. Перенесите клетки в 15 мл с пипеткой 1 мл. Добавьте 2 мл сыворотки подогретым питательной среды в пробирку для разбавления замораживание среднего и затем центрифуги на 800 x g и комнатной температуре 3 мин.
   3. Удалить супернатант и нежно ресуспензируйте клетки окатышей с 3 мл свежего Vc/PD0325901 среды с помощью пипетки 5 мл.
   4. Передать желатин покрытием блюдо клетки из 15 мл трубки и культура клетки для 24 h. Культура клетки снова, как описано в шаге 2.

4. извлечение общего белка из клетки

1. Промойте собранные клетки с 1 мл раствора PBS и затем центрифуги на 800 x g и комнатной температуре 3 мин.
2. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клетки тщательно с Буфер RIPA дополнена с DTT, ингибитор протеазы коктейль и PMSF закупорить осторожно. Объем Буфер RIPA составляет около 5 x, что ячейки Пелле.
   Примечание: Выполняют клетки ресуспендирования на льду.
3. Держите клетки в буфер RIPA 30 мин на льду и центрифуги на 13 000 x g и 4 ° C за 5 мин.
4. Супернатант передать новой трубки и хранить аликвоты-80 ° c.
5. Определите концентрацию белка с комплектом assay протеина Брэдфорд.

5. извлечь ДНК из клетки и ДНК дайджест в одном нуклеозидов, используя ферменты

1. Соберите клетки с трипсином, как описано в шагах 3.1.1 и 3.1.2.
2. Выполните экстракции ДНК с геномной ДНК очистки комплект следуя инструкциям производителя.
3. Храните ДНК в 1-мл пробирок. 100 мкл ультрачистая вода в пластиковых пробирок и распустить ДНК, закупорить около 15 раз. Определить концентрацию и оценить качество ДНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм и 280 Нм¹⁵. Концентрация ДНК составляет около 500 нг/мкл.
4. Digest 5 мкг ДНК в системе 50 мкл раствора: 5 мкл 100 мм трис-HCl раствор, рН 7,6 (конечная концентрация: 10 мм), 2 U икры кишечной фосфатазы, 1 U DNase I, 0,005 U змея яд фосфодиэстеразы, I и 5 мкг ДНК (рассчитать добавлены тома по данным измерения красный концентрации ДНК, ~ 10 мкл) в пластиковых пробирок и увеличить объем раствора до 50 мкл с ультрачистая вода. Инкубируйте смесь при 37 ° C на ночь. Центрифуга переваривается решение ДНК на 1000 g и комнатной температуре в течение 1 мин для сбора раствора в нижней части трубы.
5. Перевести переваривается решение ДНК из пробирок на ультрафильтрации трубы (вес молекулы среза: 3 кДа) и центрифуги на 13000 g и 4 ° C на 30 минут, чтобы удалить ферменты пищеварения.
6. Подготовка пробы для анализа 5мс и 5hmC.
   1. Для 5hmC анализа: Пипетки 36 мкл раствора фильтр для новых центрифуг (1 мл) и мкл 4 5'-(hydroxymethyl-d₃)-2'-Дезоксицитидин ([D₃]-5hmC) с конечной концентрации 3 Нм.
   2. Для анализа 5мс: добавить 196 мкл ультрачистая вода в новых пластиковых пробирок и пипетки 4 мкл раствора фильтр к трубе (разбавления производится), из-за высокой плотности 5мс в геномной ДНК. Перевести 36 мкл разбавленного раствора для новых пластиковых пробирок и 4 мкл (5'-(methyl-d₃)-2'-Дезоксицитидин ([D₃]-5мс) с конечной концентрации 50 Нм. Используйте [₃D]-5hmC и [D₃]-5мс как внутренний стандарт для калибровки 5hmC и 5мс, соответственно.
7. Пример решения передать измерительных трубок и хранить при 4 ° C. Анализируйте 5мс и 5hmC с ультра-высокой производительности жидкого хроматографии тройной квадрупольного масс-спектрометрии с несколькими реакция мониторинг (UHPLC-MS/MS (MRM)), как описано в предыдущем докладе¹⁵.

6. анализ 5мс и 5hmC с помощью UHPLC-MS/MS¹⁵

1. Настройка различных параметров для анализа 5мс и 5hmC с помощью программного обеспечения UHPLC-MS.
   1. Создать новый метод. Открытое программное обеспечение и нажмите кнопку «файл | Новые | Метод». Экспонат окно сообщения «Редактора метода» с содержанием «Вы хотите сохранить изменения для текущего метода» и нажмите кнопку «Нет».
   2. Создайте параметры сэмплер. Нажмите кнопку «сборники | Настройка | Инъекция». Выберите «Стандартные инъекция» и ввода «5 мкл на объем впрыска».
   3. Создание параметров насоса в UHPLC.
      1. Нажмите кнопку «BinPump2 | Установка» для создания параметров насоса. Настройка «Поток» в «0,25 мл/мин» и «Остановить время» в «15 минут».
      2. Настройка «Растворителя B 5%» и «Ограничения давления» на «Макс 600 бар».
      3. Нажмите кнопку «BinPump2 | Расписание «построить Изократические элюции параметров для анализа 5мс. Нажмите кнопку «Добавить» для добавления строки. Ввод «0.00» на «Время» и «5.0» на «B %». Нажмите кнопку «Добавить» еще раз, чтобы добавить новую строку. Ввод «15.00» на «Время» и «5.0» на «B %».
      4. Нажмите кнопку «BinPump2 | Расписание» для создания градиента элюции параметры для 5hmC анализа. Нажмите кнопку «Добавить для добавления строки. Ввод 0.00 в время и 5.0 на «B %». Нажмите кнопку «Добавить» еще раз, чтобы добавить новую строку. Ввод «3.00» на «Время» и «5.0» на «B %». Нажмите кнопку «Добавить» для другого 6 раз для добавления 6 строк. Ввод «3.01» на «Время» и «15,0» на «B %», «6.00» на «Время» и «15,0» на «B %», «6.01» на «Время» и «100» на «B %», «10.00» на «Время» и «100,0» на «B %», «10.01» на «Время» и «5.0» на «B %», «15.00» на «Время» и «5.0» на «B %» в последовательности.
         Примечание: Анализ 5мс и 5hmC индивидуально из-за разделения различных условий UHPLC.
   4. Создание параметров температуры в салоне столбца (TCC) в UHPLC.
      Нажмите кнопку «TCC | Настройка | Температура (слева)» и «30 ° C».
   5. Устанавливают параметры QQQ-МС/МС.
      1. Нажмите кнопку «MS QQQ | Остановить время | Нет предела/как насос», «источник ионов | ESI», «время фильтрации | Пик ширина: 0.07 мин». Настройка «время сегментов: время начала: 0»; «Тип сканирования: MRM»; «Div значение: МС»; «Дельта EMV (+): 200» и «Дельта EMV (-): 0».
      2. Создать параметры мониторинга переходы 5мс, Д₃-5мс, dC, 5hmC и D₃-5hmC
         1. Нажмите кнопку «MS QQQ | Приобретение | Сканировать сегменты: жить: 90"; «Fragmentor: 90»; «Энергия столкновения: 5»; «Сотовый ускоритель напряжения: 4» и «полярность: положительное».
         2. Ввод «5мс» на «Составное имя», «242» на «Прекурсор Ион», «126» на «Продукт Ион» для анализа 5мс. Щелкните правой кнопкой и выберите «Добавить строку» для добавления новой строки. Ввод «D₃-5мс» на «Составное имя», «245» на «Прекурсор Ион», «129» на «Продукт Ион» для D₃-5мс анализ.
         3. Дополнить еще три строки, используя тот же режим. Вклад «dC» в «Составное имя», «228» на «Прекурсор Ион», «112» в «Продукт Ион» для анализа dC. Ввод «5hmC» на «Составное имя», «258» на «Прекурсор Ион», «142» на «Продукт Ион» для 5hmC анализа. Вход D₃-5hmC на составное имя, «261» на «Прекурсор Ион», «145» на «Продукт Ион» для D₃-5hmC анализ.
      3. Создайте параметры источника газа. Нажмите кнопку «MS QQQ | Источник | Исходные параметры: газ температура: 300 ° C»; «Газовый поток: 11 Л/мин»; «Небулайзер: 15 psi»; «Положительные капиллярная: 3500 V».
      4. Сохраните предложенного метода. Нажмите кнопку «MS QQQ | Инструмент | Save метод как». Выберите путь для предложенного метода, «Справочник» и присвойте имя для метода путем ввода содержимого в «Метод», например: 5мс и 5hmC анализ.
2. Разделение UHPLC и МС/МС анализ mononucleosides
   1. Подготовка этапа мобильных 5мс и цитозином (C) анализ: этапа мобильные решения A и B. раствор A: 500 мл ультрачистая вода с 500 мкл муравьиной кислоты (конечная концентрация: 0.1%) и раствор B: 500 мл 100% метанола. Mix решение A и B в 95:5 (v: v) как на мобильный этапе элюировать 5мс и C (набор в шаге 6.1.3.3). Установите скорость потока в 0,25 мл/мин (набор в шаге 6.1.3.1).
   2. Подготовка этапа мобильных растворителей A и B для 5hmC анализа. Растворителем является 2,0 мм NH₄HCO₃ водный раствор (pH 9.0) (500 мл), и растворителей B является 100% метанола (500 мл). Отдельные 5hmC по оптимизированной градиента Элюирование: 0-3 мин, 5.0% B и 95% A (v: v); 3-6 мин, 15,0% B и 85% A; 6-10 мин, 100% B; 10-15 мин, 5.0% B и 95% (набор в шаге 6.1.3.4). Установите скорость потока в 0,25 мл/мин (набор в шаге 6.1.3.1).
3. Использовать электроспрей МС/МС с Записями режим (на шаге 6.1.5.1) для анализа элюции из столбца и принять режим положительный ион (набор в шаге 6.1.5.2.1).
   1. Отслеживать переходы: 5мс, m/z 242→126 (энергию столкновения, 5 eV); [D₃]-5мс, 245→129 m/z (5 eV); dC, 228→112 m/z (5 eV); 5hmC, 258→142 m/z (5 eV); [D₃]-5hmC, 261→145 m/z (5 eV) (набор в шаге 6.1.5.2.2).
   2. Установите капилляров и фрагмент напряжений в +3,500 V (набор в шаге 6.1.5.3) и 90 V (набор в шаге 6.1.5.2.1), соответственно.
   3. Объем впрыска на 5 мкл и анализировать каждый образец 3 раза (набор в шаге 6.1.2). Использовать соответствующие стандартные кривые оценить количество 5мс и 5hmC.
      1. Создание стандартной кривой 5мс: передачи 1 – 50 Нм (1, 5, 10, 20, 50 Нм, конечная концентрация) стандартный раствор 5мс в центрифуге трубки и добавить 50 Нм [₃D]-5мс труб. Дополнение общий объем до 50 мкл. анализ стандартных 5мс следуя инструкциям для 5мс образца (шаг 6).
      2. Построение калибровочной кривой 5hmC: передачи 1 – 20 Нм (1, 2, 5, 10, 20 Нм, конечная концентрация) стандартный раствор 5hmC центрифуга трубы и добавить 3 Нм [₃D]-5hmC к трубкам. Дополнение общий объем до 50 мкл. анализ стандартных 5hmC после инструкции для 5hmC образца (шаг 6).

7. анализ статистической значимости

1. Выполните статистический анализ с использованием программного обеспечения.
   1. Откройте программу и выберите «Столбец» в «Новая таблица и график». Установите параметры следующим образом: «образец данных | Начать с пустой таблицей»; «Выбрать график первый режим»; «Построение графиков реплицирует или погрешностей | Земельный участок | Значит, с SEM».
   2. Нажмите кнопку «Создать», чтобы ввести три реплицирует группы управления и Vc/PD0325901-лечение в строке «A» и «B», соответственно. Выберите шесть данные и нажмите кнопку «Анализировать» в «Анализа».
   3. В «Столбец анализа» выберите «t тесты (и непараметрических тестов)» и нажмите кнопку «ОК», чтобы войти в следующий интерфейс.
   4. Установите параметры следующим образом: «выбрать тест | Имя теста | Непарные t -тест; Параметры | 2 хвост»; «Доверительные интервалы: 95%»; «Значащих цифр | Показать 4 значащих цифр». Нажмите кнопку «ОК», чтобы получить значение p между режимом управления и Vc/PD0325901.
2. Оценка статистической значимости между элементом управления и экспериментальных групп, используя двустороннее и непарных студент t-теста¹⁶.
   Примечание: p < 0,05 означает разницу, обладающие статистической значимости. * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

VC/PD0325901 синергетически индуцированной глобальной стирания мыши ES клеток. Мышь ES клеток в сыворотке экспонат гиперметилирование ДНК, в то время как клетки pluripotent ICM и PGCs Показать глобальные стирания метилирования и состояние hypomethylated тесно связан с их плюрипотентности9,10.

Ранее мы и другие обнаружили, что Vc может усилить тет опосредованной 5мс деметилирования15,17. Тем временем 2i было также установлено, ингибируют синтез de novo 5мс. В контексте этих выводов мы далее предложил синергетический манипуляции мыши ES клеток с помощью Vc и 2i вместе. После анализа UHPLC-МС/МС мы обнаружили, что Vc и дополнены в сыворотке содержащих среднего 2i можно резко сократить 5мс содержание от 3.2 до 0,33 за 100 C (~ 90% потеря 5мс) на 11 день в клетки мыши ES (рис. 1A). В отличие от Vc или 2i-лечение только только причиной стирания 58% с устойчивый уровень в 1,4% 5мс или 61% сокращения на уровне 1,3% 5мс.

2i среда состоит из MEK ингибитор PD0325901 и ингибитора GSK3β CHIR99021. Далее мы рассмотрим, какой компонент вызывает глобальные потери 5мс во время совместного лечения Vc и 2i. Интересно, Vc/PD0325901 вызвало быстрый спад в уровень метилирования чем Vc/2i. VC/PD0325901 достигли уровня устойчивый 5мс (~0.33% 5мс) после 5 дней, в то время как Vc/2i достигли сопоставимого уровня на 11 день. В противоположность этому дополнение CHIR99021 частично подавлены деметилирования Vc срабатывает ДНК (рис. 1A). Эти данные ясно показывают, что PD0325901 в 2i способствует глобальной hypomethylation геномной ДНК в клетки мыши ES, в то время как CHIR99021 2i частично ингибирует стирание 5мс. Таким образом мы предположить, что быстрее деметилирования ДНК, вызванные Vc/PD0325901 по отношению к Vc/2i может объясняться частичной ингибитирование CHIR99021 на деметилирования.

Мы предположили, что глобальный стирание 5мс в ES клеток мыши индуцированных Vc/PD0325901 может быть частично уместным укрепление деметилирования ДНК. Таким образом мы рассмотрели геномной окисления продуктов 5мс. Сообщалось, что что 5мс могут быть преобразованы в 5hmC каталитического окисления тет семьи dioxygenases, которые являются зависимыми от Fe (II) и 2-oxoglutarate18,19. Геномной 5hmC может быть разбавлен по репликации ДНК20. Кроме того, 5hmC может далее окисляется, тет dioxygenases производить 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC), который может быть эффективно подакцизным, тимин ДНК glycosylase (TDG) для восстановления unmethylated цитозин, указанием активного ДНК деметилирования21,22.

С учетом предыдущей работы15, Vc содержащих лечения (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) резко увеличилось 5hmC частоты (5hmC/106 C) после 1 дня, а затем постепенно снизились уровни 5hmC (рис. 1B), из-за постепенное сокращение 5мс субстрата. В частности Vc/PD0325901 и Vc/2i показал быстрее кинетика 5hmC потери по сравнению с Vc и Vc/CHIR99021 благодаря быстрее сокращение 5мс. Кроме того мы также отметил, что в день 1, ВК лечение стимулировали более поколения 5hmC, по сравнению с Vc/CHIR99021, что CHIR99021 частично подавлен Vc индуцированной производства 5hmC и ингибирует ДНК деметилирования. 5hmC потери в 2i лечения следует отнести к снижению 5мс субстрата. Взятые вместе, эти результаты показали, что Vc расширение ДНК деметилирования деятельности отчасти способствовали синергетически hypomethylation совместного лечения Vc/PD0325901 и Vc/2i.

Обе Хабиби и др. 23 и фон Meyenn и др. 24 также сообщил мыши ES клеток в условиях 2i показал глобальной ДНК hypomethylation и наивно плюрипотентности. 5мс уровни показал постепенно снижаться и достиг устойчивого состояния (~ 1% 5мс) на 12 – 14 дней после реверсии от сыворотки 2i. В системе культуры Vc/PD0325901, совместное лечение вызвало быстрее ДНК деметилирования и достиг стабильного уровня (0,33% 5мс) после пополнения Vc/PD0325901 в сыворотке среде на 5 дней, за счет синергетического эффекта Vc/PD0325901. Достигнутый уровень метилированной (0,33% 5мс) был pronouncedly ниже, чем в условиях 2i, сообщает Habibi et al. и фон Meyenn et al., в то время как 5hmC уровни были выше из-за продвигаемых поколения Vc.

PD0325901 повышенных выражение Prdm14 для подавления Dnmt3b и Dnmt3l, но не Dnmt3a25. Для расследования действий PD0325901 в вызывая потери 5мс, был рассмотрен целый ряд связанных с 5мс белков, включая обслуживание (Dnmt1) и de novo (Dnmt3a и Dnmt3b) methyltransferases ДНК и их кофактор (Uhrf1 и Dnmt3l) и регулирование белка (Prdm14) 8,9,26. После Западный анализ помаркой Prdm14 pronouncedly возведен в PD0325901, в том числе культуры (рис. 2). В отличие от Dnmt3b и его кофактор Dnmt3l показал значительные вниз регуляцию экспрессии белка в PD0325901, в том числе лечения (рис. 2). CHIR99021 лечение не показал или незначительное воздействие на уровень Prdm14, Dnmt3b и Dnmt3l. Выражение Dnmt3awas не изменяет, и причиной является неясным. Кроме того поддержание ДНК метилтрансфераза Dnmt1 и его ориентации фактор Uhrf1 также показал без изменений и не были показаны данные.

Недавние исследования показали, что Prdm14 могут завербовать polycomb репрессивных комплекс 2 (PRC2) для некоторых генным стимуляторам для подавления их выражения, например de novo ДНК methyltransferases (Dnmt3a и Dnmt3b) и их кофактор (Dnmt3l) и способствует поддержание hypomethylation под 2i условия8,27. Наши данные показали, что PD0325901 повышенный уровень экспрессии Prdm14 ингибировать Dnmt3b и Dnmt3l и уменьшена механизмом геномной 5мс de novo синтеза.

Чтобы исследовать поддержания плюрипотентности мыши ES клеток в условиях Vc/PD0325901, уровни mRNA выражение нескольких основных плюрипотентности, связанных факторов были изучены, и эти факторы были подтверждены играть жизненно важную роль в плюрипотентности28. Анализ ПЦР в реальном времени обнаружили, что Oct4, SOX2, Esrrb и Sall4 показали равномерное выражение уровня через 5 дней лечения с Vc/PD0325901 в отличие от сыворотки культуры (Рисунок 3А). Nanog и Tcf3, увеличилось в 1,3 раза и 1,6 раза, соответственно. Напротив Klf4 показали 42% вниз регулирование и Rex1 только снизился примерно на 12%. Эти результаты показывают, что Vc/PD0325901 совместного лечения индуцированных различные изменения в выражении плюрипотентности факторов; Однако Oct4 и SOX2, большинство основных факторов, держал почти постоянный уровень выражения.

Далее assay щелочной фосфатазы (AP) была выполнена ли клетки мыши ES были в состоянии недифференцированная или дифференцированной. Фотографии клеток (рис. 3B и 3 C) были получены от связан с инвертированным микроскопом с десятикратного амплификации объектива камеры. После непрерывного культивирования 26 дней в среде Vc/PD0325901-добавлена сыворотки клетки мыши ES показал однородной морфологии. Кроме того почти все клетки окрашивали черно фиолетовые и выставлены мяч как государства без нарост (рис. 3 c), показаны недифференцированные государства. Напротив, в условиях сыворотки, часть клеток мыши ES на день 26 были черно фиолетовые после окрашивания и имел мяч как государства в морфологии, в то время как другие представили светлого цвета с outspreading, отмеченные белыми пунктирными линиями овальные (рис. 3B); Это свидетельствует, что клетки культивировали сыворотки мыши ES неоднородны в морфологии и в состоянии pluripotent, которая согласуется с предыдущих докладах13. Коллективно данных поддерживается, что PD0325901 в сочетании с Vc может поддерживать отличную морфология и недифференцированные государства в ES клеток мыши.

Рисунок 1: Vc/PD0325901 синергетически индуцированной глобальной стирания геномной 5mCin мыши ES клеток. (A) 5мс частоты (5мс/C) и (B) 5hmC время частоты (5hmC/C)-зависит от изменения во время 26-й день лечения непрерывное дополнение с Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 или Vc/CHIR99021 в сыворотке крови, содержащей среднего. Ошибка бар показывает стандартное отклонение (SD) из трех повторные анализы C: UHPLC-MS/г-жа цитозин. Эта цифра была изменена от Li et al. 25. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Изменения выражения протеина ДНК и Prdm14 methyltransferases (Dnmt3a, Dnmt3b и Dnmt3l). Представленные группы (слева направо) были получены через 5 день лечение сывороткой культуры (управления), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 и Vc/2i, соответственно. Выражение ПРДМ 14 был регулируется вверх и Dnmt3b и Dnmt3l снизилась после PD0325901, в том числе культуры. Dnmt3a выставлены без изменений. Β-тубулина был установлен как внутреннюю ссылку. Con: Контроль; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Эта цифра была изменена от Li et al. 25. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Vc/PD0325901-индуцированные изменения в экспрессии мРНК генов плюрипотентных и активности щелочной фосфатазы. (A) мРНК, уровень частичных плюрипотентных генов был изменен через 5 дней лечения Vc/PD0325901 по отношению к условиях сыворотки (управления). Данные были представлены как означает ± SD. Была проведена оценка статистической значимости и p < 0,05 была статистически значимой. * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < представлены незначимая 0,001 и ns. PD: PD0325901. Мышь ES клеток в сыворотке за 26 дней (B) выставлены частичной нарост, отмеченные белыми пунктирными линиями овальные, тогда как Vc/PD0325901-добавлена сыворотки средний большой морфологии и недифференцированные государства (C). Эти изображения были приобретены с инвертированным микроскопом, связанные с камерой в светлые области. Эта цифра была изменена от Li et al. 25. масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы раскрывают не потенциальные конфликты интересов.