Точная оценка болевой реакции в нейропатической животной модели имеет решающее значение для изучения патофизиологии боли заболеваний и разработки новых анальгетиков. Мы представляем чувствительных и объективный метод определения сенсорные функции грызунов, которые задние лапы системой автоматизированной походка анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ автоматизированной походки в мышей с хроническим сужение травмы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фон Frey тест является классическим методом, который широко использовался для изучения сенсорные функции невропатической боли животных. Однако она имеет некоторые недостатки, такие как субъективных данных и требование о квалифицированных, опытных экспериментатора. На сегодняшний день, различные изменения улучшили фон Frey метод, но он все еще имеет несколько ограничений. Недавние сообщения предложили, что походка анализа производит более точных и объективных данных от нейропатической животных. Этот протокол демонстрирует выполнение автоматизированных походка анализа для определения степени невропатической боли у мышей. После нескольких дней acclimation мышей разрешалось свободно ходить на стеклянный пол, чтобы осветить следы. Затем количественного определения следы и походка выполнялись через видео-клипы с автоматическим анализом различных пешеходных параметров, как площадь лапу печати, свинг времени, угол лапы и т.д.
Основная цель этого исследования заключается в описания методологии анализа автоматизированных походки и кратко сравнить его с данными из классических сенсорный тест, с помощью фон Frey накаливания.
Введение
Патологические изменения нервной системы, вызванного ишемии, травмы, воспаления, инфекции, метаболической дисфункцией, или аутоиммунное заболевание иногда приводят к невропатической боли, которая определяется как боли, возникающие как прямое следствие поражения или болезни затрагивающих Соматосенсорная система1. Невропатическая боль обычно невыносимой и к сожалению, обычные анальгетики обычно не производят достаточно боль помощи2. Главной особенностью невропатической боли содержит спонтанное и evoked стимуляции (то есть, аллодиния и Гипералгезия) боли. Аллодиния — ноцицептивных ответ, что происходит обычно болезненные стимулы, например легкого прикосновения или теплый стимуляции. Гипералгезия указывает расширение боль ответ на раздражители вредных механических и/или тепловой3. Хотя эти два симптомы критически ухудшить качество жизни пациента, механические аллодиния, вызываемые нежный тактильной стимуляции является наиболее отягчающих симптомов, потому что мягкий контакт трудно избежать в повседневной жизни.
Основной механизм и расследовать новые анальгетиков для лечения нейропатической боли, точное измерение болевой реакции имеет важное значение. Были разработаны многочисленные невропатической боли животных моделей ноцицептивных реакций на задние лапы области из-за его высокой доступности4,5,6,7. Таким образом большинство боли ответ оценки были проведены на подошвенной или дорсальной поверхности задние лапы путем применения механических раздражителей, с помощью специальных инструментов, таких как фон Frey нитей. Одним из наиболее часто используемым методом является вверх и вниз, описанный Диксон8 и более поздних изменение версии9,10. Однако очень квалифицированные, опытные экспериментаторы требуются для выполнения теста фон Frey, и результаты могут быть субъективным.
Система автоматизированного походка анализа может расследовать неврологические и нервно-мышечных расстройств путем измерения различных параметров ходьбы в свободно перемещающихся грызунов. В различные нервные травмы животных моделей степень Ноцицепция и антиноцицептивной эффект несколько методов лечения может быть оценена без добавления боль стимуляции11,12,13, 14. Эта система анализа может обнаружить походка статических и динамических параметров, таких как: лапу печати площадь (площадь полной лапу печати, что контакты с полом), лапа интенсивности (средняя интенсивность области контактирующих лапу), длина (шага Расстояние между последовательными размещения же лапу), позицию фазы (продолжительность контакта земли для одного задние лапы), шаг последовательности (порядок, в котором четыре лапы размещены на полу), качели (продолжительность фазой) и качели скорость (вычисляется от длина шага и качели продолжительность и выраженный пикселей в секунду). Этот документ демонстрирует использование системы анализа и предоставляет краткое сравнение данных с фон Frey тест, с помощью сужения хронической травмы (CCI) нейропатической мышей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
все эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами этики Международной ассоциации для изучения боли и были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом на Чхуннам национального университета ( Тэджон, Южная Корея).
1. индукция ТПП на седалищный нерв
- дом самцов ICR мышей весом 20-25 g под свет/темно цикла 12 ч при контролируемой комнатной температуре (на уровне 20-25 ° C) и влажности (40-60%), с свободный доступ к продовольствию и воды. Разрешить адаптационного периода для мышей в зале животных ухода по крайней мере за 1 неделю до операции.
- Во время жилищного строительства, наблюдать за внешний вид и поведение мышей и не использовать мышей, показаны ненормальной двигательной активности.
Примечание: Один день до операции CCI, измерения механических чувствительность задние лапы, применяя фон Frey нитей и выполнять анализ автоматизированной походки для получения нормальных исходных значений. Затем, мышей случайным образом назначать управления и экспериментальных групп.
- Во время жилищного строительства, наблюдать за внешний вид и поведение мышей и не использовать мышей, показаны ненормальной двигательной активности.
- В день операции, анестезировать мышей путем инъекций 2,2,2-tribromoethanol (250 мг/кг, внутрибрюшинного (ИС)).
Примечание: Носить личного защитного снаряжения, например хирургические платье, перчатки и маски.- Весят 2,5 g 2,2,2-tribromoethanol и добавить 2-метил-2-бутанол окончательный объем 5 мл. Держите решение от света (например, используйте контейнер темные или заверните в фольгу).
- Разрешить реагенты раствориться полностью путем нагрева при 40 ° C и перемешивания на 10-30 мин
- Добавить дистиллированной воды на окончательный объем 200 мл и перемешать, пока хорошо не смешано.
- Хранить аликвоты на 4 ° C и хранить в темноте. После двух недель, анестезии должны быть заменены новым аликвоты.
- Придать объем 20 мкл на 1 g массы тела. Например если вес тела мыши 25 g, дают 500 мкл раствора. Типичная продолжительность этой анестезии-1 ч.
Примечание: Это решение станет токсичных при воздействии света или тепла, так что будьте осторожны избежать воздействия тепла и света. Настоятельно рекомендуется использовать IP-инъекции маршрут.
- Когда указатель мыши попадает в глубокий наркоз, поместите его на операционном столе с спинной стороне вверх (то есть, лёжа) и стерилизовать внешней области середины бедра с правой стороны с 70% спиртом.
Примечание: Подтвердить глубокую анестезии, установив отсутствие реакции на щепотку или давления стимул на задние лапы или хвост. - Побудить ТПП на седалищный нерв правый мыши.
- Сделать надрез на коже вокруг области середины бедра 1,0-1,5 см длины с лезвием скальпеля.
- Тупо рассечь мышцы бедра с микро комаров кровоостанавливающий подвергать седалищного нерва.
- Перевязать подвергаются седалищного нерва 3 раза с промежутками 1,0-1,5 мм, с помощью швов Хромовой Кетгуд 4-0.
Примечание: Сделать свободные перешнуровок, связывая от седалищного нерва до мягкий встряхивания появляется на ипсилатеральной задние лапы. Шам группе мышей получил же хирургическое открытие в аналогичных условиях за исключением без перевязки нерва.
- Закрыть хирургическое открытие с 3-4 простых Прерванный швы с помощью 5-0 шелк и стерилизовать с повидон-йода для дезинфекции наружной области хирургии.
- После операции, поместите курсор мыши в чистой клетке на грелку. Когда животные оправился от наркоза, их возвращения в их дома Кейдж.
Примечание: В этом исследовании, антибиотики не использовались. Габапентин IP группа получила CCI + GBP (GBP), в дозе 50 мг/кг один раз в день как позитивный элемент.
2. Измерение механических аллодиния (тест фон Frey)
Примечание: оценить частоту вывода ответа на механические раздражители, используя 1 g фон Frey нити на подошвенной поверхности ипсилатеральные задние лапы.
- На каждый день испытаний, принести мышей в поведенческих экзаменационную комнату и акклиматизироваться мышей в их собственные дома клетке для по крайней мере 30 минут до test.
Примечание: Носить личного защитного снаряжения, например хирургические платье, перчатки и маску. - Поместите мышь в прозрачные акриловые окна на этаже металлической сетки и акклиматизироваться мышь для 30 мин.
- Осторожно применять 1 g фон Frey нити на подошвенной поверхности задние лапы, до тех пор, пока нити изгибов.
- Накаливания стимуляции применить к ипсилатеральной Хинд лапу 10 раз с интервалом по крайней мере 10 s и записывать результат.
Примечание: В этом исследовании, количество ответов вывод лапы от 10 испытаний указаны как процент частоты вывода лапы (PWF, %). Каждые два дня после операции CCI была выполнена проверка фон Frey.
3. Автоматизированный анализ походки
Примечание: система анализа походки визуализирует каждый лапу печати в то время как животное ходит и анализирует автоматически различные походки параметры, такие как лапу печати, лапа интенсивности, длина шага, позиция фазы, шаг последовательности, качели, качели скорость, и т.д. В этом исследовании, мы показали, лапу печати области и одну позицию после преобразования данных в процентах изменения между контралатеральной слева против ипсилатеральные прямо задние лапы. Таким образом результат 50% означает, что размер лапу печати и продолжительность района Лапа контакт с полом, между левой и правой стороны же. Кроме того, более низкие значения данных приближается к 0% указывают, что размер и продолжительность контакта уменьшаются в ипсилатеральные задние лапы по сравнению с контралатеральной стороны (см. Группа B Рисунок 2 и Рисунок 3).
- Для адаптационного, держать мыши внутри устройства анализа походки для 10 мин один раз в день, начиная за 5 дней до операции CCI.
Примечание: Тест анализа походки, включая адаптационного должна быть выполнена в темноте. - Принесите мышей в экзаменационную комнату для анализа походки и акклиматизироваться в их дома клетке для по крайней мере 30 минут до test.
- На вкладке Настройка меню программы, установите " длина аллея " до 30 см и набор " максимальная длительность выполнения " до 5 s и " максимального выполнения вариации " до 50%.
- Выберите зарегистрированные камеру от ' установки ' на вкладке ' программа ' меню.
- Выберите " открыть приобретение " от ' приобрести ' закладка ' программа ' меню.
- После сообщения о состоянии, нажмите кнопку ' оснастки фон ' кнопку, чтобы сфотографировать фон пустым (т.е., пустой) дорожка.
- Нажмите ' начать приобретение ' кнопку и поместите мышь на дорожку; запись начинается автоматически согласно движения мыши.
Примечание: Когда мышь явно прогулки по дорожке, программа автоматически классифицирует этот шаг как " запустить совместимый " с зеленым значком. Если программное обеспечение не удалось обнаружить печать ноги, экспериментатор увидите значок красного цвета и необходимо повторить запись. Для анализа необходимы по крайней мере пять успешных совместимый работает. - После теста, выберите ' классифицировать бежит ' из вкладки приобретать ' программа ' меню.
- Выбор запусков для анализа и нажмите кнопку ' auto классифицировать ' кнопку.
Примечание: После классификации, все параметры статистики автоматически сохраняются и экспериментатор можно найти результаты, нажав " вид запуска статистики " на меню analyze.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы провели тест фон Frey и автоматизированный анализ походки в ТПП мышей до 10 дней после операции ТПП. Для статистического анализа неоднократные меры двустороннего дисперсионный анализ (ANOVA) определяет общее воздействие, и был проведен анализ столб hoc Дуннетт чтобы определить p значение среди экспериментальных групп.
Результаты, показанные на рисунке 1 показывают время курс классической...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В настоящее время измерение механических аллодиния, используя фон Frey нитей является наиболее широко используется метод боли животных моделей для демонстрации тактильная гиперчувствительность. Как животных моделей для невропатической боли продолжали разрабатываться, методологии оценки для сенсорные функции был также более8,9,10,15. В этих докладах было предложено, что эти изменения могут обесп...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Чхуннам национального университета, Корейский институт Восточной медицины (KIOM) и Грант R технологии здравоохранения Кореи & D проекта через Корея здравоохранения промышленности развития института (ХИДИ), финансируемая министерством здравоохранения & Благосостояния, Республика Корея (номер гранта: HI15C0007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,9% физиологический раствор | JW Pharmaceutical | N/A | Носитель для лекарств |
| 1мл шприц | BD Plastipak | 300013 | Инъекционное устройство |
| 2, 2, 2-трибромэтанол (чистота 97%) | Sigma | T48402 | Анестетик |
| 2-метил-2-бутанол (чистота 99%) | Sigma | 152463 | Растворитель для 2, 2, 2-трибромэтанола |
| Catwalk Автоматизированная система анализа походки | Noldus | N/A | Программное обеспечение для автоматического анализа аниамольной походки |
| Хромовый кетгут (толщина 4-0) | AILEE | C442 | Лигатура для выполнения хронического сужительного повреждения седалищного нерва |
| Габапентин | Сигма | Y0001280 | анальгейском, используется в качестве положительного контрольного препарата в этом исследовании |
| Graefe Щипцы | F.S.T | 11051-10 | Хирургический инструмент |
| Грелка | DAESHIN ELECTRONICS | M-303AT | Регулирование температуры тела |
| ICR Mouse | Samtaco | N/A | Экспериментальное животное |
| Mersilk (толщина 3-0) | ETHICON | W598H | Шовный материал для хирургического закрытия кожи |
| Micro-Mosquito | F.S.T | 13010-12 | Хирургический инструмент |
| Микроножницы | F.S.T | 14090-09 | Хирургический |
| инструмент Иглодержатель | F.S.T | 12002-12 | Хирургический инструмент |
| Повидон Йод | Фирсон | Н/А | Дезинфицирующее средство для предотвращения инфекции после операции |
| Лезвие скальпеля | F.S.T | 10010-00 (#10) | Хирургический инструмент для разреза |
| Ручка скальпеля | F.S.T | 10003-12 (#3) | Хирургический инструмент для выполнения разреза |
| Von-Frey filaments | North Coast | NC12775-99 | Измерительное устройство для проверки сенсорной функции для механической стимуляции |
Ссылки
- Loeser, J. D., Treede, R. D. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain. 137 (3), 473-477 (2008).
- Colloca, L., et al. Neuropathic pain. Nat Rev Dis Primers. 3, 17002(2017).
- Vranken, J. H. Mechanisms and treatment of neuropathic pain. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 9 (1), 71-78 (2009).
- DeLeo, J. A., et al. Characterization of a neuropathic pain model: sciatic cryoneurolysis in the rat. Pain. 56 (1), 9-16 (1994).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 20, 441-462 (1980).
- Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Mol Pain. 10, 26(2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. J Neurosci Methods. , (2017).
- Kang, D. W., et al. Antinociceptive Profile of Levo-tetrahydropalmatine in Acute and Chronic Pain Mice Models: Role of spinal sigma-1 receptor. Sci Rep. 6, 37850(2016).
- Huehnchen, P., Boehmerle, W., Endres, M. Assessment of paclitaxel induced sensory polyneuropathy with "Catwalk" automated gait analysis in mice. PLoS One. 8 (10), e76772(2013).
- Vrinten, D. H., Hamers, F. F. 'CatWalk' automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. J Vis Exp. (82), e51212(2013).
- Ferland, C. E., Laverty, S., Beaudry, F., Vachon, P. Gait analysis and pain response of two rodent models of osteoarthritis. Pharmacol Biochem Behav. 97 (3), 603-610 (2011).
- Mogil, J. S., et al. Hypolocomotion, asymmetrically directed behaviors (licking, lifting, flinching, and shaking) and dynamic weight bearing (gait) changes are not measures of neuropathic pain in mice. Mol Pain. 6, 34(2010).
- Ferreira-Gomes, J., Adaes, S., Castro-Lopes, J. M. Assessment of movement-evoked pain in osteoarthritis by the knee-bend and CatWalk tests: a clinically relevant study. J Pain. 9 (10), 945-954 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
