Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка сапротрофные discoideum реагирования на острые механической стимуляции

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56411

⸱

9 ноября 2017 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем методы для оценки клеточного ответа на острый механической стимуляции. В основе микроскопии assay осматриваем локализации дневно меченых биодатчиков, после краткого стимуляции с потоком ножниц. Мы также тест активации различных протеинов интереса в ответ на острые механической стимуляции биохимически.

Аннотация

Хемотаксис, или миграции вверх градиент хемотаксического, это лучше понимать режим режиссер миграции. Исследования с использованием социальных амебы сапротрофные discoideum показали, что сложный сигнал сети трансдукции параллельных путей усиливает ответ на chemoattractants и приводит к предвзятым актина полимеризации и протрузии pseudopod в направление градиента. В противоположность этому молекулярные механизмы, вождение другие виды миграции направлены, например, из-за воздействия сдвига потока или электрического поля, не известны. Многие регуляторы хемотаксис экспонат локализации на ведущих или отставание края миграции клеток, а также показать временные изменения в локализации или активации после глобальной стимуляции с хемотаксического. Чтобы понять молекулярных механизмов других видов направленного миграции мы разработали метод, который позволяет изучение клеточного ответа на острый механической стимуляции, основанные на краткое (2-5 сек) воздействия сдвига потока. Этот стимуляции могут быть доставлены в канале при визуализации ячеек, выражая дневно меченых биодатчики изучить поведение отдельных клеток. Кроме того можно стимулировать популяции клеток в тарелку, анализироваться и immunoblotted, с использованием антител, которые признают активных версий протеинов интереса. Объединив оба анализов, можно изучать широкий спектр молекул, активированную изменения субцеллюлярные локализации и/или фосфорилирования. С помощью этого метода мы определили, что острый механической стимуляции триггеры активации эозинофилов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей. Возможность изучения клеточных реакций на острый механической стимуляции имеет важное значение для понимания инициатора события, необходимые для потока индуцированного сдвига подвижности. Этот подход также предоставляет инструмент для изучения сети трансдукции эозинофилов сигнала без смешанных влияние хемотаксического рецептора.

Введение

Миграции эукариотических клеток является предвзятым, различные химические и физические сигналы в окружающей среде, включая градиенты растворимые или привязанных к подложке chemoattractants, переменной жесткости субстратов, электрические поля, или сдвига потока. Несмотря на многие достижения в наше понимание молекулярных механизмов вождения хемотаксис, меньше известно о других типах режиссер миграции и интеграции этих разнообразных сигналов на клеточном уровне для получения единой мигрирующих ответ.

Режиссер, миграция к растущей концентрации хемотаксического включает три поведенческих компонентов: подвижность, направленного зондирования и полярность1. Подвижность относится к случайное движение клеток достигается pseudopod выступа. Направленного зондирования является способность обнаружить источник хемотаксического ячейки, который может произойти даже в прикол клетки. Полярности относится к более стабильной асимметричные распределения внутриклеточных компонентов между ведущие и отстающие края клетки, что приводит к увеличению сохраняемости в движении.

Клеточный ответ хемотаксического зависит деятельность четырех концептуально определены нормативные сетей: рецептор / белок G, сигнальной трансдукции, Цитоскелет актина и полярность1. Хемотаксического связывание с рецепторами сочетании белок G передаёт сигнал через гетеротримерные G белки α и βγ к течению сигнала трансдукции сеть, которая усиливает сигнал направленности. Несколько путей в рамках сети трансдукции сигнала действовать параллельно и кормить в сеть Цитоскелет актина смещения актина полимеризации, и последующего pseudopod выступа, в направлении градиента. Среди важных регуляторов хемотаксис являются Ras ГТФазы, TorC2, phosphoinositide 3-киназы (PI3K), фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN) и что циклазы. Механизмы обратной связи в рамках сети трансдукции сигнала и между сигнала и Цитоскелет актина сетей далее усиливать ответа. Наконец плохо определенной полярности сети получает входные данные из цитоскелет актина и далее отклонений сети трансдукции сигнала для содействия постоянные миграции в направлении градиента.

Большая часть наших механистического понимания хемотаксис стало возможным из-за развития биодатчики дневно тегами для различных компонентов систем регулирования. Многие хемотаксис регуляторы имеют асимметричные распределения, либо самой молекулы регулирования или его деятельности. Например биосенсоры, которые признают активации версии небольших ран GTPases и Rap1 – рас связывания доменов Raf1 (именуемый RBD здесь) и RalGDS, соответственно — локализации до переднего края ячейки2,chemotaxing3. Аналогично, PI3K и ее продукта фосфатидилинозитол (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), признанные pleckstrin гомологии (PH) домена, также показывают локализации в передней части клетки4,5. В отличие от 3-фосфатазы PTEN, который преобразует PIP3 обратно в фосфатидилинозитол (4,5)-Бисфосфат, локализует отстающие края ячейки6. Важно отметить, что эти биодатчики изменить их локализация в ответ на глобальные стимуляции с хемотаксического. Передний край маркеры, которые цитозольной или на советы выступы в ячейке отдых, relocalize кору, тогда как отставание края маркеров, которые корковых локализации и отсутствуют от кончиков выступы в ячейке отдых, стать цитозольной после стимуляция. Анализ распределения биосенсор в ответ на глобальные стимуляции с хемотаксического минимизирует вклад моторики и полярность, которые часто посрамить замечания. Глобальные или единообразных стимуляции суспензию клеток с хемотаксического также используется как инструмент для оценки всего населения изменения в активации белка, часто определяется белка фосфорилирование7,8,9 . Этот assay биохимических используется главным образом для получения временной информации, тогда как микроскопии используется для сбора во временной и пространственной информации о поведении различных компонентов систем регулирования.

В сети трансдукции сигнала включает в себя черты возбудимых системы10,11. Ответы на выше порогового уровня эозинофилов стимулы «логики» и отображать огнеупорных периодов. Ответы также активируются ковшах и может показать колебательной поведение. События трансдукции сигнала локализованы в регионы коры, которые распространяются как волны12,13,14,15. Спереди назад, маркеры набираются для, или отмежеваться от, активные зоны распространения волн. Благодаря огнеупорных региона трейлинг активной зоны противоположно направленных волн уничтожить как они встречаются. Распространение волн трансдукции сигнала лежат в основе сотовой выступов, которые посредником миграции клеток10.

Большая часть вышеупомянутой информации о хемотаксис пришли из исследований на социальной амеба сапротрофные discoideum, хотя аналогичные механизмы регулирования, также применимы к нейтрофилов и других клеток млекопитающих типы16 . Сапротрофные устоявшиеся модели организм, который имеет надежную эозинофилов ответ во время голодания, когда тысячи одной клетки мигрируют к агрегации центр, сформировав многоклеточные плодовые тела, содержащие споры. Хемотаксис также важно во время стадии одноклеточных роста этого организма для нахождения бактериальных пищевых источников. Важно отметить, что миграция одиночных клеток сапротрофные удивительно похож на миграции млекопитающих нейтрофилов или метастатического рака клеток, все из которых проходят очень быстро Саркодовые типа миграции. В самом деле общая топология регулирования сети, а также многие из отдельных сигнальных путей участвующих в хемотаксис сохраняются между сапротрофные и млекопитающих лейкоциты17. Кроме того другие клетки, такие как фибробластов, используйте рецепторов тирозин киназ (РТК) вместо GPCR; Однако RTKs может учитываться в подобных сетей.

В отличие от хемотаксис отсутствует глубокое понимание сигнальных механизмов, определяющих различные другие виды режиссер миграции. Аналогичным образом клетки мигрируют в градиенте хемотаксического несколько исследований сообщили активации и/или локализация типичных передовые маркеров, в том числе актина полимеризации, PIP3 и/или внеклеточная сигнала регулируется киназы (Эрк) 1/2, в передней части клеток происходят направлены миграции в ответ на сдвиг потока или изменения электрического поля18,19,,2021. Однако в этих исследованиях непрерывного воздействия на раздражитель также привело к миграции клеток, оставляя открытым вопрос ли, например, маркеры передовые локализовать специально в ответ на раздражитель, или если они просто локализовать на переднем крае из-за увеличения числа ложноножки в передней части миграции клеток.

Мы разработали анализов, которые позволяют нам наблюдать ответ клетки на острый механические возмущения, доставлены как сдвиг потока как на уровне всего населения и как отдельные клетки22. Похож на глобальные стимуляции с хемотаксического, острый stimulaции с потоком ножниц позволяет исследование клеточного ответа на механических стимул без вклада со смешанным от подвижности или полярности. Сочетание этих биохимических и микроскопических анализов с генетических или фармакологических возмущений позволяет нам, чтобы узнать о как механические раздражители воспринимаются и половым путем. Кроме того этот подход также обеспечивает новый метод для задействования системы по течению хемотаксического рецептора в отсутствие хемотаксического, тем самым изолируя сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей от рецепторов/G белка сети.

С помощью методов, описанных ниже мы недавно продемонстрировал, что острый сдвига стресс приводит к активации нескольких компонентов эозинофилов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей22. Применяя острый механические стимул различные промежутки времени, мы продемонстрировали, что, аналогично chemoattractants, ответ на механических раздражителей также экспонаты особенности возбудимых системы, включая обновляющие поведение ответ под насыщая условия и наличие рефракторного периода. Наконец сочетанием механических и химических стимуляции мы показали, что два стимула разделяют сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей, которые скорее всего позволит для интеграции нескольких стимулы для защиты клеток миграции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка решения

  1. подготовку гл-5 средства массовой информации, используя следующее: глюкоза 10 г/Л, 10 г/Л proteose Пептон, 5 г/Л дрожжевой экстракт, 0.965 г/Л Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 г/Л х 2 PO 4 и, если не указано иное, стрептомицина 0,03 г/Л в деионизированной воде. Автоклав среднего и хранить при комнатной температуре.
    Примечание: Из-за различий между proteose Пептон и дрожжевой экстракт, полученных от разных поставщиков, а также между отдельными партиями, рН средства массовой информации может потребоваться корректироваться на типичный спектр 6,4 до 6,7.
  2. Подготовить SM пластины, используя следующее: 10 г/Л декстрозы, Пептон 10 г/Л, 1 г/Л дрожжевой экстракт, 2,31 г/Л х 2 PO 4, 1 г/Л K 2 HPO 4 и 20 г/Л агар в деионизированной воде. Автоклав, охладить и залить 30 мл раствора агар на 10см Петри. После того, как агар затвердевает, хранить пластины на 4 ° C до 1 месяца.
  3. Подготовка 10 x фосфатного буфера (PB) с помощью 13,4 г/Л Na 2 HPO 4 ·7H 2 O и 6,8 г/Л х 2 PO 4 в деионизированной воде. Хранить запас 10 x на 4 ° C. развести 1 x с дейонизированной воды для использования в.
  4. Подготовить DB буфера путем дополнения 1 X PB с 2 мм MgSO 4 и 0,2 мм CaCl 2.
  5. Подготовка 100 мм кофеин в деионизированной воде. Хранить в − 20 ° с.
  6. Подготовить 100 мм лагеря Стоковый раствор путем растворения соли моногидрата лагеря натрия в деионизированной воде. Подготовьте работы Фонда в дейонизированной воде 1 мм. Хранить оба акций решения на − 20 ° C. подготовить окончательный лагеря решение на желаемой концентрации в дБ на день эксперимента.
    Примечание: Фондовая решения могут быть замораживания размораживания в несколько раз.
  7. Подготовка 25 мм фолиевой кислоты в 1 x PB. Добавьте несколько капель 1 N NaOH до тех пор, пока порошок полностью растворяется. Хранить в − 20 ° с.
  8. Подготовить 3 x буфер образца, используя следующее: 187.5 мм трис-HCl pH 6.8, 6% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS), 30% глицерина, 126 мм Дитиотреитол и 0,03% (w/v) бромфеноловый синий. Алиготе и хранить в − 20 ° C.
    1. Предварительного использования, растопить на водяной бане 37 ° C и приступить к подготовке буфер образца с ингибиторы протеазы и фосфатазы, разбавляя 3 x буфер образца до 1 x и добавляя 50 мм NaF, 2 мм Na 3 VO 4, Пирофосфат натрия 25 мм и 1 x Полная Бесплатная ЭДТА ингибитор протеазы коктейль в деионизированной воде. Добавьте ингибиторы непосредственно перед началом процедуры, описанные в шагах 3.1.2-3.1.3.
  9. Подготовить 5 мм A Латрункулин раствор в ДМСО. Алиготе и хранить в − 20 ° C.

2. Подготовка клеток D. discoideum

Примечание: поддерживать D. discoideum клеток HL-5 средства массовой информации либо в культуре ткани пластины или в суспензии культуры как описано ранее 23. При необходимости, преобразование клетки с дневно меченых биодатчики согласно стандартным электропорации протоколы 24. Различные D. discoideum штаммы, а также плазмид кодирования биодатчики или другие гены интереса могут быть получены из центра фондовая Dicty (dictybase.org).

  1. Роста и сбор растительного D. discoideum клеток
    1. для анализа растительной клетки, рост клеток присутствии бактерий, чтобы уменьшить количество macropinosomes, которые обычно наблюдаются в 25 axenically выращенные клетки.
      1. Подготовить культуры нейтрофилов исследовании путем прививки небольшое количество клеток из запаса глицерина или от предыдущей культуры в желаемый объем HL-5 средних без антибиотиков. Инкубировать бактериальной культуры на орбитальный шейкер на 200 об/мин (0,42 x g) при комнатной температуре (20-22 ° C) для 16-18 ч.
        Примечание: K. штамм исследовании использованы здесь является непатогенные (см. Таблицу материалы).
    2. Собирать D. discoideum фазы экспоненциального роста культуры ткани пластины или из подвеска культуры и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева согласно данным производителя ' s инструкции. Распространение 1 х 10 5 D. discoideum клетки с 260 мкл K. исследовании подвеска на плите SM. Поверните пластину вверх вниз следующий день. Рост клеток при комнатной температуре до тех пор, пока клетки D. discoideum начать очистку бактериальных газон, но прежде чем они начинают сбор (~ 36-48 h).
    3. Сбор D. discoideum клетки в 5 мл DB буфера соскабливания их с стекла распространитель. Клетки перехода к 50 мл полипропиленовые трубы. Промойте пластины с другой 5 мл DB буфера и бассейн с оригинальной подвеска. Заполнения трубки 50 мл с буфером DB.
    4. Центрифуги D. discoideum подвеска на 360 x g для 3-4 мин аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 50 мл DB буфера. Повторяйте Стиральная шаги до тех пор, пока это супернатант ясно (~ 3-4 автомойки). Ресуспензируйте Пелле окончательный ячейки в буфер DB к окончательной плотности ~ 5 x 10 6 клеток/мл.
  2. Подготовка агрегации-компетентные D. discoideum клетки
    1. Разработка D. discoideum клеток путем голодания 1 h, следуют 4 h голода и пульсирует с 50 Нм лагерь каждые 6 мин согласно стандарту протоколы 23.
    2. После развития, оценить окончательный объем суспензии клеток.
    3. Основе начальное количество ячеек, которые используются для разработки, рассчитать плотность клеток окончательного подвески.
      Примечание: Если лагерь доставляется в 100 томах мкл каждые 6 мин, объем ячейки увеличивается на 1 мл за каждый час лагеря пульсирующей. Таким образом, для стандартных условий, с помощью 8 x 10 7 клеток в 4 мл DB, после 4 h развития окончательный объем-7 мл и плотность окончательный клеток ~1.1 x 10 7 кл/мл.

3. Биохимический анализ клеток ответ на механические или химические стимуляции

  1. , Острой механической стимуляции клеток следуют Lysis клетки
    1. пластины 2 x 10 6 агрегации компетентных клеток (от шага 2.2) после 4 h Разработка в 35-мм блюда с 2 мл DB. Позволяют клеткам прикрепить 10 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки дважды с 1 мл DB. Инкубировать клетки в БД с кофеином 2,5 мм для 30 мин без каких-либо нарушений плит.
      Примечание: Если клетки нужно относиться с фармакологическими ингибитор, добавьте желаемой концентрации ингибитора или же объем соответствующего транспортного средства во время basalation с кофеином.
    2. Применить механическую стимуляцию, установите пластину (по одному) на орбитальный шейкер и немедленно включите его на 150 об/мин (0.24 x g) для 5 s.
      Примечание: Пластину можно также вручную стимулировать движение в крест-накрест манере для приблизительно 5 s.
    3. Аспирата буфера в указанный раза после начала стимуляции. Сразу же Лизируйте клетки, добавив 100 мкл пример буфера с ингибиторы протеазы и фосфатазы.
    4. Место пластину на льду и собирать lysate в 1,5 мл. Для ' время 0 ', Лизируйте клетки без встряхивания. Передавать трубы блока 95 ° C тепла для 10 мин сразу же после лизиса. Продолжить с immunoblotting или хранить лизатов при -20 ° с.
  2. Стимуляции клеток с хемотаксического
    1. Basalate агрегации компетентных клеток после 4 h развития, быстро встряхивая их присутствии кофеин 5 мм на 200 об/мин (0,42 x g) на орбитальный шейкер для 30 мин.
      1. Центрифуг суспензию клеток на 360 x g для 3-4 мин аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл ледяной DB буфера. Повторите шаг стиральная.
    2. Ресуспензируйте Пелле окончательный клеток в ледяной DB буфер для окончательной плотности 4 x 10 7 кл/мл на основе первоначального ячейки номер, используемый для разработки клетки (см. шаг 2.2). Держите суспензию клеток на льду до стимулдругим опасным последствиям.
      1. Пипеткой 50 мкл 10 мкм лагерь или транспортного средства в чашку полистирола размещены на орбитальный шейкер.
    3. Стимулировать клетки, 450 мкл суспензии ледяной клеток в чашке же и немедленно включите шейкер на 200 об/мин (0,42 x g). В разное время после начала стимуляции (например 10, 30, 45, 60, 120 s), кратко остановить шейкер, взять 50 мкл аликвоты суспензию клеток и лизировать клетки, добавляя их в 1,5 мл пробирки, содержащие 25 мкл 3 X буфер образца.
      1. Для ' время 0 ', используйте клетки из суспензии кератоз ледяной клеток.
        Примечание: Конечная температура суспензию клеток во время стимуляции составляет ~ 9 ° C 26. В этих условиях пик ответ происходит несколько позже, чем пик, наблюдается для стимуляции, выполненных при комнатной температуре (например, стимуляции хемотаксического адэрентных клеток на микроскопе или механической стимуляции адэрентных клеток).
    4. Передачи трубы до 95 ° C тепла блок 10 мин сразу же после лизиса. Продолжить с immunoblotting или хранить лизатов при -20 ° с.
  3. Анализ клеток ответ по Immunoblotting
    1. лизатов (от шагов 3.1.3 или 3.2.4) на геле полиакриламида трис-HCl 4-15%, передать винилидена фторида мембраны, блок и immunoblot с фосфо Петропавловск Ζ Thr410 (для выявления фосфо PKBR1 и фосфо PKBA). Обнаружить сигнал по инкубации с хреном, конъюгированных с пероксидазой анти кролик вторичное антитело, следуют хемилюминесценции с использованием увеличенная хемолюминесценция субстрата.
    2. Для обнаружения нескольких белков, Стрип блот с зачистки буфера и повторно зонд с основного антитела против фосфо p42/44 MAPK Thr302/304 (для выявления фосфо ERK2). Подтвердить равные белка загрузки путем пятнать винилидена фторида мембраны с Кумасси синим.

4. Острый механической стимуляции и жить изображений из одной клетки на микроскопе

    1. оценки реагирования на острые механической стимуляции, с помощью потока устройства собирают и разбавить растительного или агрегирования компетентным клетки для ~ 1 х 10 6 клеток/мл в DB, как описано в шагах 2.1 и 2.2, соответственно. Загрузить ~ 600 мкл в слайд с каналом (см. Таблицу материал для деталей). Позволяют клеткам для присоединения 10 мин убедитесь, что все входы в слайд полностью заполнены. Пополнить с дополнительный буфер при необходимости.
      Примечание: Особое слайд, используемый для анализа имеет трех входов, которые питаются в узких, 1 мм каналы, но затем слить в один канал широкий, 3 мм. Высота канала составляет 0,4 мм. Хотя клетки покрыты всей канал, только часть широкого отображаемого.
    2. Пройти одну из линий, которые прикреплены к 50 мл водохранилища через фронт правый клапан аэрогидродинамических подразделения (см. Таблицу материалов для деталей). Используя программное обеспечение для насоса, убедитесь, что клапан закрыт (т.е. слева). Заполните резервуар с DB.
      1. Установить давление на 50 мбар и включите его. Заполните и промойте линии с DB путем нажатия на клапан, чтобы открыть его. Давление до 0 и закрыть клапан после ~ 30 s.
    3. Подключения линии к одному из трех входов на одной стороне слайда без захвата воздушные пузыри. Подключите два отверстия. Подключите линии из умов в спиральном на второй стороне слайда.
      Примечание: Труб, используемых для ввода и сливной линии в этой установки имеет внутренний диаметр 1.6 mm.
    4. Место слайда на Микроскоп 20 X воздушные цели. Для полоскания канал, переключатель клапана, чтобы открыть строку и нажмите " давление на ", начиная при высоком давлении (~ 50 мбар или ~ 40 дин/см 2), чтобы протолкнуть жидкости в канализацию.
      1. После того, как жидкость выходит из умов, уменьшить внешнее давление к нулю (т.е. тяжести потока только, ~ 15 Дин/см 2) и продолжать полоскание для ~ 30 s. переключатель клапан в противоположное положение, чтобы остановить поток.
    5. Получить изображения с ППП или GFP подсветки на Перевернутый флуоресцентным микроскопом под 40 X нефти цель интервалом 3 s. Клапана в закрытом положении, включите давление на требуемое давление, как правило, между 15 и 40 дин/см 2 (0 - 50 мбар).
    6. После приобретения 5 кадров, доставить стимул, переключающий клапан для " открыть " позиции. Отключить поток после 2-5 сек, переключающий клапан в противоположном направлении.
      Примечание: Для некоторых слабее биодатчики (например PTEN, CynA и RalGDS) оно может быть необходимо изображение клетки используя Конфокальный микроскоп оснащен 40 X нефти цель.
  2. Тестирования эффекты ингибиторов фармакологических на ответ на острый механической стимуляции с помощью потока устройства
    1. плиты клетки в слайд с каналом, как описано в пункте 4.1.1. Созданы две линии: пройти одну линию через фронт правый клапан как шаг 4.1.2, и второй через заднюю покинул клапан. Зажмите левую линию и поставьте клапан " закрытой " (левой) позиции. Заполнить одну строку с DB, содержащий соответствующие транспортного средства и второй с раствор, содержащий ингибитор фармакологический интерес (например 5 мкм Латрункулин A).
      Примечание: Это необходимо физически зажать левую линию, потому что " закрытой " левое положение открывает клапан для этой линии.
    2. Заполнения и промыть право линии путем включения давление на 50 мбар и переключающий клапан для " открыть " (справа) положение. Переключитесь в клапан слева после ~ 30 s. заливки и промойте левой линии, удалив зажим для ~ 30 s. Connect обе линии до двух вводов на одной стороне слайда с каналом, подключите остальные входе и подключить утечка в спиральном на второй стороне. < / л я >
    3. мыть слайд с буфером в правой линии и выполнять стимуляции в тот же буфер, как описано в шагах 4.1.3 и выше 4.1.4.
      Примечание: Хотя правой линии был выбран как первый в этой установки, можно поменять местами.
    4. После стимуляции, переключатель клапана, чтобы открыть правой линии при нулевом давлении (т.е. самотечный поток только, ~ 15 Дин/см 2). Удаление Клещи от левой линии и переключения клапан слева, чтобы открыть эту линию. Зажим первой строки.
    5. После запуска с ингибитором через 3-5 мл буфера, переключение клапан справа, чтобы остановить поток и инкубировать клетки с ингибитором за требуемый период времени (например 15 мин). Включите поток, переключающий клапан каждые ~ 10 мин ~ 15 s, чтобы предотвратить дефицит кислорода. Повторите стимуляции с второй линии.
  3. Альтернативный метод оценить ответ на острый механической стимуляции с помощью микропипеткой
    1. создана микропипеткой, заполнены с DB согласно стандартным протоколом 23. Держите компенсации давления на 1,500 собаки.
    2. Собирать и разбавить растительной клетки, как описано в шаге 2.1. Место 25 мкл капель ~7.5 x 10 5 клеток/мл в 1-ну камере, позволяют присоединиться по крайней мере 10 минут, и крышка с 3 мл DB.
    3. Место камеры на Перевернутый флуоресценции микроскоп оснащен 40 X нефти цели. Найдите клетки. Аккуратно опустите микропипеткой в середине поля зрения до тех пор, пока он впервые касается нижней палаты.
      Примечание: Поскольку компенсации давления был установлен на 1,500 собаки, клетки будут постоянно подвергаться очень медленным потоком DB от микропипеткой.
    4. Начать импорт изображений с ППП или GFP подсветкой интервалы 3 s. Применить ' чистый ' функцию для освобождения струйное вливание жидкости из микропипеткой. Далее я изображенийn наличие потока за счет компенсации давления одиночку.
  4. Альтернативный метод оценить ответ острой механической стимуляции с помощью массового добавления буфера
    1. собирать и разбавленных растительной клетки, как описано в шаге 2.1. Место 20 мкл капель клеток на ~ 1 х 10 6 клеток/мл в DB в середине колодец из камеры 8-хорошо. Позволяют клеткам присоединиться для по крайней мере 10 мин
    2. Начать импорт изображений с освещением конкретных предложений или GFP на Перевернутый флуоресценции микроскоп оснащен 40 X цель интервалом 3 s. Сосредоточиться на области ближе к краю падение.
    3. Быстро мкл 430 DB в одну сторону скважины. Продолжить томографии.
    4. Для анализа взаимодействия между механических и химических раздражителей, 12 или 45 s после механической стимуляции, аккуратно 50 мкл фолиевой кислоты (конечная концентрация 20 Нм) или транспортного средства (DB) не вызывая механических ответ. Продолжить томографии.
  5. Количественная оценка ответ
    1. открыть 32-битный TIFF изображений в программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов) 27.
    2. Под ' анализ ' вкладку, перейти к " набор измерений ". Установите флажок в поле ' значение означает серый '. Убедитесь, что другие коробки не проверяются. Нажмите кнопку " ОК ".
    3. Под ' процесс ' щелкните " вычесть фон ". Держите мяч радиусу качения на 50 пикселей и сделать не проверить любой из вариантов, перечисленных в меню. Увеличить на одну ячейку с помощью ' увеличительного стекла ' инструмент.
    4. Использование ' прямоугольник ' инструмента, нарисуйте рамку (~2.5 x 2,5 мкм 2) в цитозоле, убедившись, что не нарисовать его над ядром или плазматической мембраны. Пресс " Ctrl " + " М " ключи или перейдите на ' анализ ' вкладке и нажмите на " мера " чтобы определить среднее значение серого окна. Аванс для последующих кадрах и мера снова, убедившись, что поле остается в цитозоль.
      Примечание: Так как D. discoideum клетки движутся очень быстро поле могут быть перемещены из одного кадра к следующему держать его в цитозоль.
    5. После всех фреймов были проанализированы, скопировать значения в таблицу. Для учета в ячейке изменения в уровнях выражения различных биодатчиков, нормализовать значения для среднее значение серого, наблюдается в момент времени 0. Вычислить обратную величину значения, чтобы отразить накопление сигнала на коре.

5. Непрерывная механической стимуляции и жить изображений из одной клетки на микроскопе

  1. точно так, как описано выше для анализа острого механических раздражений в шагах 4.1.1 - 4.1.3 Настройка клетки. Откройте вилку покрытия резервуара с буфером, так что объем могут пополняться если ответ анализируется дольше, чем несколько минут за один раз.
    Примечание: Потому что водохранилище остается открытым в течение всего эксперимента, этот assay проводится в отсутствие внешнего давления и опирается на самотечные потоки только. Чтобы увеличить скорость потока на гравитации, сливной могут быть размещены на столе под микроскопом.
  2. Начать визуализации ячейки с освещением конкретных предложений или GFP на Перевернутый флуоресценции микроскоп оснащен 40 X цель интервалом 3 s для анализа ответов биодатчик. Кроме того, изображение с Фазовый контраст с помощью объектив 20 X 10 s интервалом для анализа миграции клеток в.
  3. Включите потока после нескольких кадров в параметре нулевого давления (т.е. поток является из-за тяжести одиночку или ~ 15 Дин/см 2) путем переключения клапана в открытое положение. Когда уровень жидкости падает на 5-10 мл в водохранилище, Топ с более буфера. Убедитесь в том добавить жидкость тщательно, чтобы пузырьки воздуха не попасть в ловушку в строках.
    Примечание: Важно добавить жидкость той же температуре, чтобы избежать удара ответ в клетках.
  4. Подсчитать ячейки скорость и сохраняемости с помощью программного обеспечения для анализа миграции (см. Таблицу материалов для деталей) согласно данным производителя ' s инструкции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Височной ответ регуляторов хемотаксис острой механической стимуляции

Для оценки реакции клеток D. discoideum механическим раздражением, сторонником агрегации компетентных клеток были подвержены краткий импульс потока сдвига. Агрегата компетентных D. discoideum клетки секретируют лагерь, который может быть почувствовал соседних клеток. Чтобы преодолеть вклад ячеек сигнализации, клетки лечили кофеин, который подавля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, описанные здесь предлагают удобный способ оценить как населения, так и поведение отдельных клеток в ответ для наклона потока. Важно отметить, что в то время как предыдущие исследования анализируются локализации ведущих и отставание края маркеры во время миграции, нынешний подход позволяет исследование непосредственных эффектов, применяя сдвига поток остро. С помощью этого метода мы продемонстрировали, что, в самом деле, первоначальная реакция клеток для наклона потока не требует миграции клеток. Вместо этого быст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант R35 GM118177 НПР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты
ДекстрозаFisherD16-1Использовать для приготовления сред HL-5 и планшетов SM (шаги 1.1, 1.2)
Пептон протеозыFisherDF0120-17-6Использовать для приготовления сред HL-5 (шаг 1.1)
Экстракт дрожжейFisher50-550-445Использовать для приготовления сред HL-5 и планшетов SM (шаги 1.1, 1.2)
Na2HPO4· 7H2OFisherS373-500Используется для приготовления среды HL-5 и 10X фосфатного буфера (этапы 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500Используется для приготовления среды HL-5, SM-планшетов и 10X фосфатного буфера (шаги 1.1-1.3)
Стрептомицин (дигидрострептомицина сульфат)FisherICN10040525Используется для приготовления среды HL-5 (шаг 1.1)
Peptone (Bacto)FisherDF0118-17-0Использовать для подготовки пластин SM (шаг 1.2)
K2HPO4FisherP288-100Использовать для подготовки пластин SM (шаг 1.2)
AgarFisherBP1423-500Использовать для подготовки пластин SM (шаг 1.2)
MgSO4FisherM65-500Использовать для приготовления буфера DB (шаг 1.4)
CaCl2FisherC79-500Использовать для приготовления буфера DB (шаг 1.4)
КофеинFisherO1728-500Использовать для приготовления кофеина (шаг 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-циклический монофосфат, соль натрия)Fisher11-680-1100MGИспользовать для приготовления cAMP (шаг 1.6)
Фолиевая кислотаSigmaF7876Использовать для приготовления фолиевой кислоты кислота (шаг 1.7)
Основание трисаFisherBP152-500Использование для приготовления 3X буфера для образцов (шаг 1.8)
Додецилсульфат натрия (SDS)FisherBP166-500Использование для приготовления 3X буфера для образцов (шаг 1.8)
ГлицеринFisherG33-500Использование для приготовления 3X буфера для образцов (шаг 1.8)
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad1610610Использование для приготовления 3X буфера для образцов (шаг 1.8)
Бромфенол синийBio-Rad1610404Использовать для приготовления 3X буфера для образца (шаг 1.8)
NaFFisherS299-100Использовать для приготовления образца буфера с ингибиторами протеазы и фосфатазы (шаг 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Использовать для приготовления образца буфера с ингибиторами протеазы и фосфатазы (шаг 1.8)
Декагидрат пирофосфата натрияFisherS390-500Используйте для приготовления буфера образца с ингибиторами протеазы и фосфатазы (шаг 1.8)
Полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА (Roche)Sigma11873580001Используйте для приготовления образца буфера с ингибиторами протеазы и фосфатазы (шаг 1.8)
Латрункулин АEnzo Life SciencesBML-T119-0100Используйте для приготовления латрункулина А (шаг 1.9)
4-15% полиакриламидный гель Tris-HClBio-Rad3450029Использование для иммуноблоттинга (шаг 3.3)
Мембрана из поливинилиденфторидаBio-Rad1620177Использование для иммуноблоттинга (шаг 3.3)
Фосфо-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Антитело кроликаCell Signaling2060Первичное антитело для использования в иммуноблоттинге (шаг 3.3)
Фосфо-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) XP антителоCell Signaling4370Первичное антитело для использования в иммуноблоттинге (шаг 3.3)
Кролик IgG HRP Linked Whole Ab (от осла)GE HealthcareNA934-100ULВторичное антитело для использования в иммуноблоттинге (шаг 3.3)
Усиленный хемилюминесцентный субстрат (Clarity Western ECL Substrate)Bio-Rad1705060использование для иммуноблоттинга (шаг 3.3)
Стриппинг-буфер (Restore Plus Western blot stripping buffer)ПирсPI46430Использование для иммуноблоттинга (шаг 3.3)
Кумасси Бриллиант БлюФишерPI20278Использование для иммуноблоттинга (шаг 3.3)
Штамм K. aerogenes (непатогенный)Dicty Stock Center (dictybase.org
NameCompanyКаталожный номерКомментарии
Материалы и оборудование
Orbital Shaker (модель G-33 или аналогичная альтернатива)New Brunswick ScientificИспользование для выращивания K. aerogenes (шаг 2.1.1), а также для базалирования и стимуляции D. discoideum клеток (шаг 3). Радиус вращения для этого шейкера составляет 9,5 мм.
Чашка Петри 10 смFisherFB0875712Использовать для приготовления пластин SM (шаг 1.2)
ГемоцитометрFisher02-671-51BИспользовать для подсчета клеток D. discoideum (шаг 2.1.2)
Чашка 35 мм (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)Fisher08-772AИспользовать для подсчета D. discoideumклеток для механической стимуляции с последующим лизисом клеток (шаг 3.1.1)
Полистирольная чашка (5 мл)VWR13915-985Использование для стимуляции суспензии клеток D. discoideum с помощью хемоаттрактанта (шаг 3.2.2)
Жидкостная установка с насосом (система насоса ibidi)Ibidi10902Используется для механической стимуляции клеток D. discoideum в канале (шаги 4.1, 4.2 и 5)
Слайд с каналом (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 полимерное покровное стекло, обработанная культура тканей, стерилизованная)Ibidi80316Используйте для пластинчатых D. discoideum клеток для механической стимуляции, доставляемой с помощью жидкостного устройства (шаги 4.1, 4.2 и 5)
50 мл резервуаров (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)Ibidi10978Используйте для настройки жидкостного устройства для подачи механической стимуляции на клетки D. discoideum в канале (шаги 4.1, 4.2 и 5)
Линии для жидкостного блока (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)Ibidi10964Используйте для настройки жидкостного устройства для подачи механической стимуляции D. discoideum клеток в канале (шаги 4.1, пункты 4.2 и 5). Примечание: две линии также могут быть вырезаны из трубки диаметром 1,6 мм (каталожный номер 10842).
Трубопровод для дренажа (трубка с внутренним диаметром 1,6 мм)Ibidi10842Используется для настройки жидкостного устройства для подачи механической стимуляции на клетки D. discoideum в канал (шаги 4.1, 4.2 и 5).
Инвертированный микроскоп Zeiss Observer.Z1, оснащенный масляным объективом 40X/1.3 и воздушным объективом 20X/0.3 (или сопоставимой альтернативой)ZeissИспользуется для изображения D. discoideum с фазово-контрастным или флуоресцентным освещением (шаги 4 и 5)
Конфокальный микроскоп UltraView с вращающимся диском, оснащенный 40&/1,25– 0,75 масляный объектив (или аналогичная альтернатива)Perkin-ElmerDM 16000Альтернатива, используемая для визуализации клеток D. discoideum (шаг 4.1.4)
Микроинъектор FemtoJet (Eppendorf; модель 5247, или аналогичная альтернатива) с Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D и 5192000027Используйте для механической стимуляции клеток D. discoideum с помощью микропипетки (шаг 4.3). Примечание: каталожный номер указан для самой новой версии оборудования (4i).
Микропипетка (Femtotip; 1 μ наружный диаметр м, 0,5 мкм; m внутренний диаметр )Eppendorf930000035Используется для механической стимуляции клеток D. discoideum с помощью микропипетки (шаг 4.3)
Наконечники микрозагрузчика (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)Eppendorf5242956.003Используйте для заполнения микропипетки (фемтотип) буфером (шаг 4.3.1)
1-луночная камера (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)Fisher12-565-472Используйте для тарелирования клеток D. discoideum для механической стимуляции, доставляемой микропипеткой (шаг 4.3.2)
8-луночная камера (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)Fisher12-565-338Используйте для пластинирования клеток D. discoideum для механической стимуляции, доставляемой путем добавления объемного буфера (шаг 4.4.1)
NameCompanyНомер в каталогеComments
>Software
Image Analysis Software (Fiji)NIHhttps://fiji.sc/Используется для количественной оценки реакции на механическую стимуляцию (шаг 4.5)
Программное обеспечение для анализа миграции (Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/Используйте для количественной оценки скорости и персистентности клеток (шаг 5.4)
)

Ссылки

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сдвиговый потокпередача сигналаактиновый цитоскелетфлуоресцентные биосенсорыорбитальный шейкермикрофлюидная камеравестерн-блоттингмиграция клеток
Оценка сапротрофные discoideum реагирования на острые механической стимуляции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.