Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мегакариоцитов дифференциации и образование тромбоцитов от человека пуповинной крови производные CD34 клетки+

19.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56420

⸱

27 декабря 2017 г.

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

В этой статье

Краткое содержание

Очень чисто населения megakaryocytes могут быть получены из пуповинной крови производные CD34+ клеток. Метод для CD34+ изоляции и мегакариоцитов дифференцировки клеток описана здесь.

Аннотация

Производство тромбоцитов происходит главным образом в костном мозге в процессе, известном как thrombopoiesis. Во время thrombopoiesis прародитель гемопоэтических клеток дифференцировать в форме прекурсоров тромбоцитов под названием megakaryocytes, которые неизлечимо дифференцировать выпустить тромбоцитов долго цитоплазматических процессов, называемых proplatelets. Megakaryocytes являются редкие клетки, ограничивается костного мозга и поэтому трудно урожай в достаточном количестве для лабораторного использования. Эффективное производство человеческого megakaryocytes может быть достигнуто в пробирке путем культивирования CD34+ клеток при подходящих условиях. Протокол, здесь подробно описывает изоляции CD34+ клеток, магнитные ячейку Сортировка от образцов пуповинной крови. Описаны необходимые шаги для получения чистой, зрелый megakaryocytes сыворотки свободных условиях. Предоставляются также детали фенотипического анализа мегакариоцитов дифференциации и определение производства proplatelet формирования и тромбоцитов. Эффекторы, влияющих мегакариоцитов дифференциации и/или proplatelet формирования, такие как антитела анти-тромбоцитарный или thrombopoietin mimetics, могут быть добавлены культивируемых клеток, чтобы изучить биологические функции.

Введение

Изоляция адекватного числа первичных человеческих megakaryocytes (MK) для использования регулярных лабораторных невозможно из-за их низкой частоты в костном мозге, где они составляют ~0.01% ядерных клеток1. Удобной альтернативой является расширение ex vivo и дифференциации кроветворных стволовых и прогениторных клеток при наличии определенных факторов роста. Количество цитокинов, включая фактор стволовых клеток (СКФ; c комплект лигандом) и интерлейкина (IL) -3 и Ил-11 были заняты в системах культуры производить МКС. Thrombopoietin (ТПО) является наиболее эффективным фактором роста и дифференцировки для мегакариоцитарная культур и является эффективным в одиночку или с другими цитокинов, таких как СКФ и Ил-3-2. ТПО может действовать на население стволовых клеток в результате распространения и созревания МКС2.

MK производят тромбоцитов от цитоплазмы выступов, называется proplatelets и, в-vivo, примерно 1 х 1011 тромбоцитов формируется ежедневно для поддержания количества тромбоцитов в 150-400 x 109выпускаться тромбоцитов производства в пробирке — до 1000 -раз ниже, чем в естественных условиях оценки3, и это породило многочисленные культуры условий с помощью CD34+ клетки гемопоэтических предшественников для улучшения МК и тромбоцитов производства в пробирке. Первоначальный источник CD34+ ячеек, используемых для дифференциации MK было4периферической крови человека. Другие мобильные источники включают в себя костный мозг5,6, эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ESC/iPSC)7и пуповинной крови (УКБ)8,9,10 . Костного мозга человека CD34+ 11 и мыши линии отрицательных костного клетки5 продукции МК и тромбоцитов в vitro; Тем не менее, отсутствие наличия костного мозга человека ограничивает его использование в качестве источника CD34+ клеток. В противоположность этому ESC и iPSC представляют неограниченный источник клеток для производства в vitro тромбоцитов. Тромбоцитов производство из этих клеток требует фидер клеток, таких как мышиных OP9 клеток и дольше культуры. Тромбоцитов, полученных в условиях свободной подачи, как представляется, менее функциональной,12. iPSC производные тромбоцитов, вероятно быть применения в клинических условиях, так как они может быть расширена в крупном масштабе. Этот процесс требует лентивирусные опосредованной трансдукции факторов транскрипции и долгосрочные культуры клеток13.

UCB является доступным источником CD34+ клетки, которые могут быть легко использованы в исследования параметров. ТПО только может способствовать дифференциации шнура крови производные CD34+ клеток и это приводит к очень чистый, Зрелые МКС без необходимости в сыворотке добавок или совместного культуры с клетки фидера. Другие цитокины такие как СКФ может уменьшить дифференциации от UCB CD34+ клеток, в то время как лиганд Flt-3 и Ил-11 содействовать производству незрелых megakaryocytes14. Этот протокол описывает производства высоко чистых культур МК из пуповинной крови CD34+ клеток в условиях свободной от сыворотки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен Юго Восточный Сидней человека Комитет по этике исследований и ратифицирован человека Комитет по этике исследований в Университете Нового Южного Уэльса. Пуповинная кровь, полученные от здоровых доноров была представлена в Сиднее банк пуповинной крови (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия). Для этой процедуры были использованы томов приблизительно 100 мл.

Примечание: Работа в класс II биобезопасности, кабинет с помощью асептической техники. Обеззараживанию экстерьер пуповинной крови мешок с 70% этиловом спирте. Для этой процедуры используйте стерильные инструменты (ножницы, пинцеты).

1. кабель подготовка клетки крови и изоляции CD34 клетки+

  1. Подготовьте стерильные разделения буфера (SB) с-фосфатный буфер (PBS), pH 7.2 и содержащий 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мм ЭДТА.
  2. Обойтись 10 мл SB в 50 мл Конические трубки (1 тюбик 10 мл крови не требуется). С помощью G18 тупой иглой, монтируется на 10 мл шприц, привлечь 10 мл крови из мешка и обойтись в 50 мл пробирки с 10 мл SB.
  3. Добавьте 15 мл лимфоцитов разделения средств массовой информации (см. Таблицу материалы) в нижней части трубки, содержащий разбавленной крови, создавая два слоя.
    Примечание: Отказаться от СМИ медленно в нижней части трубки, чтобы избежать смешивания различных уровней.
  4. Центрифуга трубы на 1200 × г за 30 мин при комнатной температуре (RT) без перерыва и без ускорения.
  5. Передача слой вблизи центра трубка, содержащая мононуклеарных клеток (приблизительно 5-10 мл от каждой трубы) в новый Тюбик 50 мл с помощью пипетки Пастера. Добавьте SB в каждую пробирку с общим объемом 50 мл.
  6. Центрифуга на 400 g × 10 мин на RT. удалить супернатант.
  7. Ресуспензируйте клеток гранулы тщательно с пипетка Пастера в 5-10 мл SB. комбината подвесной клетки и довести объем до 50 мл с SB.
  8. Подсчет ячеек с помощью окрашивания Трипановый синий и Горяева или автоматизированных мобильных счетчика (см. Таблицу материалы). Чтобы определить процент CD34+ клеток в образце, Ресуспензируйте 2,5 × 105 клеток в 100 мкл SB и пятно, добавив 10 мкл антител анти CD34-PE для 15-30 мин при 4 ° C. Анализировать проточной цитометрии (рис. 1A).
  9. Пробирок на 400 g × 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    Примечание: если они не требуются немедленно, мононуклеарных клеток могут быть заморожены на данном этапе.
  10. Ресуспензируйте клетки в 300 мкл SB за 108 клеток. 100 мкл IgG человека FcR (блокирование реагента, смотрите Таблицу материалы) и 100 мкл CD34 магнитные шарики за 108 клеток. Осторожно перемешать и Инкубируйте на 4 ° C на 30-40 мин.
    Примечание: Одна ячейка подвеска не требуется (при необходимости, пройти клетки хотя 30 мкм фильтр перед добавлением реагенты). Используйте реагент томов, описанные здесь 108 клеток или меньше. Для более чем 108 клеток масштабирование реагентов (SB, блокирования решения и CD34 магнитной бусины), соответственно.
  11. Подготовьте LS разделения столбцов во время инкубационного периода, поместив столбец LS в магнитный держатель и мойки с 3 мл SB. удаления стоков.
    Примечание: LS разделения столбцов могут быть загружены с до 2 × 108 всего клеток. Меньшие и большие столбцы доступны.
  12. Добавить 5-10 мл SB в ячейку смесь и центрифуги на 400 × g 10 мин удалить супернатант.
  13. Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл SB и загрузить суспензию клеток (1,5 мл) на столбце LS. Соберите поток через содержащие немеченого ячеек в коллекции 15 мл (отрицательный фракция #1). Пусть жидкость слейте воду и промойте колонку с 1,5 мл SB.
  14. Загрузить через (3 мл) собранных поток обратно в столбце и собирать через поток в же коллекции 15 мл трубки (отрицательный фракция #1). Промойте колонку LS 3 раза с 3 мл SB.
    Примечание: Если требуется, клетки в отрицательных фракции (12 мл) смогите быть запятнано с анти CD34 антитела для выяснения захвата CD34+ ячеек в столбце LS.
  15. Удалите столбец из магнитного сепаратора и очистить клетки медленно с поршень шприца в новой трубки 15 мл 2 мл SB.
  16. Место столбец обратно на магнитный сепаратор и нагрузки по 2 мл клеток обратно в столбце. Сбор через поток и мыть с 2 мл SB. Это негативное часть #2 (4 мл).
  17. Удалить столбец LS с магнитным сепаратором и добавить 2 мл SB. Flush клеток неуклонно и твердо с поршень шприца для сбора CD34+ клеток дроби. Подсчет количества ячеек, с помощью окрашивания Трипановый синий и Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
  18. Пластиковых пробирок с позитивным дроби на 400 g × 15 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант. Ресуспензируйте клеток в сыворотке свободных СМИ для CD34+ клетки (УЛП, смотрите Таблицу материалы).
    Примечание: если они не требуются немедленно, клетки могут быть заморожены в жидком азоте на данном этапе.

2. чистоту проверка изолированных CD34 клетки+

  1. Пятно 2 х 104 клетки от положительных фракции с 10 антитела анти CD34-PE мкл и 20 мкл антител анти CD45-PerCP 15 мин при температуре 4 ° C (используйте отдельные трубки для управления изотипа) (рис. 1B).
  2. Добавьте 1 mL SB мыть. Центрифуга на 400 g × 10 мин Ресуспензируйте Пелле в 200 мкл SB.
  3. Выполнить анализ потока гранулярных и строба живой клетки населения исключить мусора (рис. 1B). Ворота для PE и PerCP положительных населения, с использованием элементов управления изотипа PE и PerCP (рис. 1B) и определить процент CD34+/CD45+ клеток.

3. мегакариоцитов дифференциация

  1. Семена 5 × 105 клеток/мл CD34+ клеток в 2 мл УЛП, дополнена 50 нг/мл рекомбинантного человеческого thrombopoietin (rhTPO) за хорошо в пластине 12-хорошо. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2 в атмосфере увлажненной. Если клетки вырожденная, прежде чем они требуются для анализа, сбора клеток и разделены на несколько скважин с свежими СМИ и rhTPO.
    Примечание: Две или три скважины должны быть готовы специально отслеживать дифференциации в разное время точках (например, дни, 7, 9 и 10).
  2. Урожай клетки из скважин, отложите в сторону для мониторинга дифференциация не нарушая ячеек в других скважин.
  3. Пятно клетки с 20 мкл антител анти GPIIb/CD41-FITC и 10 мкл анти GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 антитела в окончательный объем 100 мкл. Настройка элемента управления трубки, с использованием соответствующих isotype антитела управления. Инкубируйте 15-30 мин при 4 ° C.
  4. Добавьте 1 mL SB мыть.
Центрифуга на 400 g × 10 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 200-300 мкл SB. Analyze подачей cytometry.
  • Для каждого Флюорофор анализировать изотипа элементы управления для задания стробирования FITC и Alexa муки 647 положительных групп населения. Анализировать образцами окрашенных клеток, чтобы определить процент CD41+/CD42a+ двойной положительный клетки, которые представляют собой Зрелые MK (рис. 1 c).
  • Для микроскопических визуализации ячейки поверхностных маркеров пятно клетки, как описано в 3.3.
    1. Добавьте 1 mL SB мыть. Центрифуга на 400 g × 10 мин Ресуспензируйте Пелле в 100 мкл SB и спина на стеклянное скольжение на 1000 x g для 5 минут исправить клетки на слайде путем погружения в метаноле за 30 с. воздух сухой, 20 мкл монтажа СМИ, содержащие DAPI (см. Таблицу материалы) , крышка с coverslip и визуализировать с помощью флуоресцентный микроскоп (рис. 2A).
  • Для визуализации Внутриклеточные антигены Ресуспензируйте клетки в PBS и исправить с параформальдегида (1% конечная концентрация) для 15 мин при комнатной температуре. Для разрушения клеток, добавить Тритон X 100 (0,1%) и Инкубируйте 15 минут вымыть клетки с 2 мл PBS/0.1% тритон X 100. Ресуспензируйте в 100 мкл PBS/0.1% тритон-x 100, добавить анти vWf и анти CD62p антител (разбавления 1: 200) и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
    1. Вымойте с 2 мл PBS/0.1% тритон X 100 и центрифуги на 400 g × 10 мин, Ресуспензируйте в 100 мкл же буфера и добавить анти мыши IgG-Alexa 594 и анти кролик IgG-Alexa 488 (1: 100). Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре, мыть с 2 мл PBS/0.1% тритон X 100, Ресуспензируйте в 100 мкл же буфера и добавить 20 мкл анти CD42b-APC. Затем спина клетки на стеклянных вставках, как описано в шаге 3.6.1 и подготовить образцы для микроскопических визуализации, как описано в шаге 3.6.1.
  • Для определения плоидности урожай клетки в дни 12 или 13 дифференциации. Добавьте 1 mL SB мыть. Центрифуга на 400 × g 10 мин и пятно с 20 мкл антител анти GPIIb/CD41-FITC в окончательный объем 100 мкл. инкубировать на 4 ° C на 30 мин.
    1. Один раз мыть с 1 мл раствора SB и Ресуспензируйте Пелле в 300 мкл гипотонический цитрат буфера (1,25 мм цитрат натрия, хлорид натрия 2,5 мм, 3,5 мм декстроза) содержащий 20 мкг/мл пропидий йодидом и 0,05% Тритон-X 100. Инкубируйте 15 мин при 4 ° C, защищать от света.
    2. Добавить РНКазы в конечной концентрации 20 мкг/мл и Инкубируйте 30 мин при 4 ° C, защищать от света. Определите интенсивность пропидий йодидом проточной цитометрии, собирая 30000 до 50000 событий CD41-FITC+ населения (рис. 2 c).

    • 4. proplatelet подсчет тромбоцитов перечисления и активации тромбоцитов

    1. Урожай клетки (из шага 3.1) в дни 8 или 9 дифференциации и семян на 1 × 104 клетки/колодец в 48-ну пластины в 200 мкл свежих УЛП, дополнена 50 нг/мл rhTPO. Культура на 5 дней при 37 ° C, 5% CO2.
      Примечание: Для целей количественный, семя колодцы в трех экземплярах. Эта низкая плотность требуется для визуализации и подсчета proplatelet подшипника MK. Proplatelets обычно начинают появляться после 2 дней культуры. Пик-между 4 и 5 дней.
    2. Подсчитать количество proplatelet подшипник МК в целом хорошо на Перевернутый световой микроскоп, используя 10 X или 20 X целей.
      Примечание: С подогревом (37 ° C) микроскопа является предпочтительным, так как сохранение клеток при комнатной температуре для длительных периодов вызывает усадки proplatelet расширений. Proplatelets наблюдаются как долго расширения от MK тела. Каждый MK могут иметь несколько proplatelet выступов. Как proplatelets развиваются, тело MK уменьшается в размерах.
    3. Урожай клетки и центрифуги на g 400 x 10 мин при комнатной температуре. Пятно клетки с 20 мкл антител анти человека CD41-FITC, как описано в шагах 3.3 и 3.4. Рассчитать процент MK proplatelet подшипник (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet подшипник МКС/хорошо) / (всего CD41+ клеток / хорошо)] x 100
    4. Для подсчета тромбоцитов, выпущен в питательной среды, осторожно смешать клетки с пипетка Пастера и собирать 100 мкл в дни 14 или 15 культуры.
      1. Пятно с 20 мкл антинародным CD41-FITC антитела для 20-30 мин при 4 ° C. Настройка управления трубку с помощью соответствующих isotype антитела управления.
      2. Добавьте 150 мкл SB и 50 мкл подсчета бусины.
      3. Для анализа потока гранулярных установите FSC и SSC для входа масштаба. Использование нормальной крови тромбоцитов человека из тромбоцитов богатые плазмы витражи с CD41-FITC, как описано в разделе 4.4.1, чтобы задать ограничение для тромбоцитов (рис. 3A).
      4. Анализируйте окрашенных тромбоцитов с подсчета бусины проточной цитометрии. Соберите 1000 событий подсчета бусины с использованием FSC по сравнению SSC точечной диаграмме (рис. 3A). Рассчитайте количество тромбоцитов, основанные на CD41-FITC позитивные события (рис. 3B) по формуле:
        Тромбоциты за мкл = [(количество CD41-FITC позитивные события)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/объем пробы)]
    5. Для анализа активации тромбоцитов, осторожно смешать клетки с пипетка Пастера и собирать 100 мкл в дни 14 или 15 культуры. Добавьте 1 mL Tyrode в буфер (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, MgCl 1 мм2, 1.8 мм CaCl2, 0,2 мм Na2HPO4, 12 мм NaHCO3, 5,5 мм D-глюкоза, рН 6,5) и центрифуги на 200 x g за 5 мин до Пелле клетки.
      1. Собирайте супернатант и центрифуги на 800 x g на 10 минут, чтобы гранулы тромбоцитов размера частиц.
      2. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 100 мкл буфера в Tyrode. 20 мкл антител PAC1-FITC и аденозиндифосфат (ADP) до конечной концентрации 20 мкм. инкубировать при комнатной температуре 20 мин анализ подачей cytometry определить процент FITC позитивные события. Используйте свежие тромбоцитов человека, относились так же, как положительный контроль (рис. 3 c).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Этот протокол позволяет подготовки высоко чистых культур МК из пуповинной крови производные CD34+ клеток. Процент CD34+ клеток в пуповинной крови составляет примерно 1,3%15 (рис. 1A) и общее количество мононуклеарных клеток (шаг 1.8) колеблется от 90-300 x 106 единицу UCB. Чистота CD34 +/ CD45 + клеток после изоляции колеблется от 90 до 99% (рис. 1B). MK (определяется как C...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Протокол, описанные здесь подходит для последовательного производства МК и тромбоцитов в культуре из пуповинной крови. Эти клетки могут использоваться для изучения различных процессов, таких как воздействие наркотиков или биологической деятельности на МК распространения, дифференциация, proplatelet формирования и тромбоцитов производства.

    В литературе были представлены разнообразные культуры средств массовой информации и цитокина комбинаций. Добавление цитокинов, таких как фактор стволовых кле...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Благодарности

    Авторы признают поддержке здравоохранения Австралии и Совет медицинских исследований (проект Грант 1012409 связан с БХК).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Cell Culture Reagents
    Рекомбинантный человеческий TPOMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605Бессывороточная среда для CD34+ клеток
    Название<strong>Company<strong>Каталожный номерComments
    >CD34 Isolation Reagents
    CD34 MicroBead kit ultrapureMiltenyi Biotec130-100-453Этот набор включает в себя реагент, блокирующий IgG человека FcR, и микрогранулы CD34. Эти шарики содержат клон антител к CD34 QBEND/10. Используйте другой клон анти-CD34 для проверки чистоты (например, клон 8G12).
    LymphoprepAlere Technologies1114545Среда для разделения лимфоцитов (плотность 1,077 г/мл)
    Стерильный разделительный буфер (SB)Miltenyi Biotec130-091-221Этот буфер содержит фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2, содержащий 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ ЭДТА. Его можно готовить с использованием стерильных компонентов клеточной культуры. Дегазируйте перед использованием, потому что пузырьки воздуха могут блокировать колонку.
    NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
    <>Проточная цитометрия и реагенты для окрашивания клеток
    PE Мышиный античеловеческий CD34BD Biosciences340669клон 8G12. Это может быть использовано для проверки чистоты CD34. Конечная концентрация антител 1:10 разведение.
    PerCP мышиный античеловеческий CD45BD Biosciences3474641:10 разведение
    PerCP контроль изотипаBD Biosciences3490441:10 разведение
    FITC мышиный античеловеческий CD41aBD Biosciences340929Конечная концентрация антител 1:5 разведение.
    APC Mouse anti-Human CD42bBD Biosciences551061Это антитело также может быть использовано для обнаружения зрелых MK (процент положительных клеток обычно ниже, чем при использовании анти-CD42a). Конечная концентрация антител 1:10 разведение.
    Alexa Fluor 647 Мышиный античеловеческий CD42aAbD SerotecMCA1227A647Tв настоящее время распространяется компанией Bio-Rad. Конечная концентрация антител 1:10 разведение.
    Alexa Fluor 647 Mouse Negative ControlAbD SerotecMCA928A647настоящее время распространяется компанией Bio-Rad. Контроль изотипа антитела
    Анти фон Виллебранд фактор кролика поликлональныйAbcamAB69941:200 разведение
    V450 мышь анти-humna CD41aBD Biosciences584251:20 разведение
    V450 контроль изотипаBD Biosciences5803731:20 разведение
    PAC1-FITC антителоBD Biosciences3405071:10 разведение
    Anti CD62p мышь моноклональныйAbcamAB66321:200 разведение
    Alexa Fluor 488 козий анти-кролик IgGInvitrogenA110081:100 разведение
    Alexa Fluor 594 козий анти-мышиный IgGInvitrogenA110201:100 разведение
    Ig Isotype Control коктейль-CBD Biosciences558659Isotype Control антитело
    Пропидиум йодидSigma AldrichP4864
    CountBright Абсолютные счетные бусиныМолекулярные зонды, InvitrogenC36950Счетные бусины
    НазваниеCompanyНомер в каталоге>Комментарии
    Материалы
    LS колонкиMiltenyi Biotec130-042-401Меньшие и большие колонны также коммерчески доступны
    MidiMACS Сепаратормагнит Miltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5mL круглое дно полипропиленовые трубки FACS, с защелкивающейся крышкой, стерильныетехнологии in vitro352063
    стеклянные стеклаMenzel-GlaserJ3800AMNZ
    Монтажный материал с DAPIVector LaboratoriesH-1200Монтажный материал Antifade с DAPI
    strong>Название><>Каталожный номер>Комментарии
    >Оборудование
    Инвертированный микроскопLeicaDMIRB инвертированный микроскоп
    Флуоресцентный микроскопZeissVert.A1
    Анализатор клетокBD BiosciencesFACS Canto II
    Цитоспиновая центрифугаThermoScientificCytospin 4
    НазваниеCompanyCatalog NumberКомментарии
    Software
    Программное обеспечение для анализа клетокBD BiosciencesFACS Программное обеспечение Diva Программное обеспечение
    анализа одиночных клетокTree StarFlowJo
    Программное обеспечение для флуоресцентного микроскопаZeissZen 2 blue edition
    <strongCompany для

    Ссылки

    1. Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
    2. Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
    3. Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
    4. Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
    5. Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
    6. Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
    7. Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
    8. Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
    9. Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
    10. Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
    11. Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
    12. Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
    13. Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208(2016).
    14. De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
    15. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
    16. Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
    17. Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
    18. Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
    19. Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
    20. Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
    21. Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
    22. Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    CD34
    Мегакариоцитов дифференциации и образование тромбоцитов от человека пуповинной крови производные CD34 клетки+
    Свяжитесь с нами
    Рекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.