Method Article

Альтернативные в Vitro методы для определения вирусного капсида структурной целостности

DOI:

10.3791/56444

⸱

November 16th, 2017

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычные методы использование вирусного генома амплификации ограничены, их неспособность различать инфекционных от неинфекционных частиц. Цель этой статьи — предоставить подробные протоколы для альтернативных методов для оказания помощи в дискриминации инфекционных норовирус частиц с помощью привязки aptamer, Динамическое рассеяние света и просвечивающей электронной микроскопии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека норовирус виктимизацией значительного общественного здравоохранения и экономических потерь во всем мире. Возникающие в vitro успехи выращивания еще не применимы для рутинной обнаружения вируса. Текущий обнаружения и количественного определения методов, которые полагаются главным образом на амплификации нуклеиновых кислот, не допускали дискриминации инфекционных от неинфекционных вирусных частиц. Цель этой статьи – представить конкретные сведения о последних достижениях в методы, используемые вместе, для того чтобы получить также информацию о статусе инфективности вирусных частиц. Один метод предполагает оценки привязки норовирус ssDNA aptamer к capsids. Аптамеры имеют преимущество быть легко синтезируется и изменения и недорогой и стабильной. Другой метод, динамического рассеяния света (DLS), имеет преимущество наблюдения за поведением капсида в растворе. Электронная микроскопия позволяет для визуализации структурной целостности вирусных capsids. Хотя перспективные, есть некоторые недостатки каждого метода, например неспецифические aptamer привязку положительно заряженные молекулы из Образец матрицы, требование очищенный капсид для DLS и плохой чувствительностью для электронной микроскопии. Тем не менее когда эти методы используются в сочетании, тело получаемых данных обеспечивает более полную информацию о целостности норовирус капсида, который может использоваться для выведения инфективности, информация, которая имеет важное значение для точной оценки методы инактивации или интерпретации обнаружения вирусов. Эта статья обеспечивает протоколы для использования этих методов дискриминации инфекционных человека норовирус частиц.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека норовирус отвечает за бремя значительного общественного здравоохранения во всем мире, вызывая около 685 миллионов заболеваний и 212 000 смертей ежегодно1, стоимостью в миллиарды долларов2,3. Сегодня норовирус обнаружения и количественного определения включает амплификацию генома и/или лиганд-платформ. Первый обычно предпочтительным, как он является более чувствительным, обеспечивает количественную информацию и имеет обычно более низкий риск4ложных положительных результатов. Наиболее распространенными норовирус обнаружения и количественного определения генома усиления техники является обратной транскриптазы количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР). Потому что она направлена и усиливает небольшой сегмент генома человека норовирус, RT-ПЦР в одиночку не способны проводить дискриминацию между инфекционных и неинфекционных частицы, как свободный геномной РНК, повреждения capsids, содержащие геномов и capsids с смертельно мутировал/усечен геномов могут по-прежнему усиливается RT-ПЦР. Хотя недавно поступили два новых в vitro культивирования методов для человека норовирус5,6 , оба по-прежнему полагаются на RT-ПЦР для количественного определения вирусов и еще не являются возможные методы для рутинных клинических и экологические тестирование для человека норовирусы. Таким образом RT-ПЦР остается золотым стандартом для клинических/окружающей среды тестирования.

В попытке лучше оценить состояние инфективности норовирус частиц были разработаны другие методы в пробирке . Эти методы могут быть вообще отнесены те, которые касаются целостность норовирус капсида и те оценки целостности генома. Первый подход является более популярным. Часто используемым методом является РНКазы предварительной обработки до извлечения вирусного геномной РНК, однако это не учитывает вирусные частицы, которые остаются нетронутыми, но не имеют возможности привязки узла рецепторов/co факторов, а также вирусные частицы, которые мутировали смертельно или обрезать или незначительно повреждены геномов7. Капсид целостность может также оцениваться основано на способности вируса для привязки к человека норовирус co-receptor/co факторов, которые являются углеводы известен как группа крови histo антигены (HBGAs). HBGAs присутствуют в кишечной эпителиальных клеток хозяина в составе гликопротеинов или гликолипидов (среди нескольких других тканях) и может быть сделано секретным в телесных жидкостей, таких как слюна. Также было показано кишечные бактерии, содержащие HBGA-подобных веществ на их поверхности, привязать человека норовирус8,9,10, и такого взаимодействия может способствовать норовирус инфекции5. Основная концепция использования HBGA привязки является, что только вирусные частицы способны привязки предполагаемого рецептор/co-factor будет способен заражать клетки. Множественные исследования показывают, что шарик-привязку на основе HBGA предшествующего амплификация нуклеиновой кислоты является перспективным методом инфективности дискриминации11,12,13,14, 15,16. Одной из основных задач относительно HBGAs является, что без одного HBGA типа можно привязать все человеческие норовирус генотипов. Для решения этой проблемы, свиного желудка муцина, который содержит HBGAs, был использован вместо очищенный HBGA углеводы в интересах простоты синтеза, последовательность и снижение стоимости.

В недавно опубликованном Мур и др. 17 представил набор новых методов для оценки целостности человека норовирус капсида. Вместо HBGAs, Мур и др. 17 расследование привязки широко реактивной нуклеиновой кислоты aptamer (M6-2)18 и19 широко реактивной моноклональных антител (NS14) – термически capsids GII.4 Сидней норовирус (вирус типа частиц или VLP) и сравнил это для привязки к синтетическим HBGAs. Нуклеиновые кислоты аптамеры являются короткие (~ 20-80 nt) одного мель нуклеиновые кислоты (ssDNA или РНК), сложить в уникальных трехмерных структур вследствие их последовательности и связывающие цели. Потому что они нуклеиновых кислот, они являются менее дорогостоящими; легко химически синтезированных, очищенная и изменение; и стабильной для тепла. Существует несколько сообщений о аптамеры генерируется против норовирусов, с некоторыми из них показаны широкий реактивности в различных штаммов18,20,21,22. В качестве примера, Мур и др. 17 показали что aptamer M6-2 привязан к capsids очищенный, собранных человека норовирус (VLP) и аналогичным образом относились к HBGA в зависимость от вирусного капсида поддерживать высшего порядка (например, среднее и высшее) структуры белков для Привязка к произойти. С другой стороны значительная доля норовирус VLP Связывание антитела к NS14 остались после того, как были полностью денатурированный capsids. Оценка норовирус привязки в исследовании Мур и др. 17 было сделано с помощью простой, основанного на пластину метода аналогичны ELISA, за исключением, что вместо антитела используются аптамеры (отсюда был вызван метод ELASA). Этот экспериментальный метод высокой пропускной способности использовался для оценки влияния различных методов лечения на норовирус капсида, работу, которая является ценной для понимания механизма вирусной инактивации после воздействия на физические или химические раздражители. Однако один из недостатков этого метода является нижней чувствительность и отсутствие терпимости для матрицы связанные загрязняющих веществ на более высоких уровнях, которые вызывают неспецифической привязки путем аптамеры.

Мур и др. 17 используется другой метод, динамического рассеяния света (DLS), для мониторинга агрегации вирусных частиц в ответ термической обработки. DLS часто используется для оценки размера наночастиц суспензий и был продлен до23,белки вирусов и24 26,-25,27. Интенсивность света, рассеянного частиц в растворе колеблется в зависимости от размера частиц, позволяя для расчета коэффициента диффузии и затем диаметр частиц, устоявшихся формулам. DLS технику можно отличить гидродинамические диаметр дисперсных частиц вплоть до наноразмерных, который позволяет обнаружения рассредоточенных вирусов, отдельных капсульных белков или димеры и вирус статистическими выражениями, основанными на размер27. Вирус агрегации, представленный увеличение размера частиц, свидетельствует о потери целостности капсида. Как денатурировано капсида и нарушается его структуры, гидрофобные остатки подвергаются и вызывают частицы слипаются и образуют агрегаты. DLS может использоваться для измерения размера частиц после указанного обращения или кинетика агрегации в реальном времени17,28. Этот метод имеет преимущество, позволяя наблюдения поведения капсида в растворе, но требует высокой концентрации очищенный капсида, которые не могут быть полностью представительным вируса в своем естественном состоянии.

Последний метод, используемые Мур и др. 17 был просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Хотя этот метод не хватает чувствительности и не производят количественных данных, он позволяет для визуализации эффектов различных обработок вирусного капсида структуры. Хотя не еще идеально подходит для клинических и экологические параметры, использование этих методов в сочетании ценные в понимании человека норовирус инактивации. Цель этой статьи — предоставить углубленные протоколы для привязки на основе плиты assay (ELASA), DLS, и методы подготовки ТЕА используется для исследовать влияние термообработки на норовирус капсида в контексте лечения последствий капсид целостность, представленные в Moore et al. 17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. основанного на пластину Assay привязки для оценки потери выше порядок норовирус капсид структура

Примечание: весьма аналогичный протокол ELASA к тому, что представленные здесь был Опубликовано 29, и аналогичные ELASA анализов ранее сообщалось как часть исследования других статьях 17 , 18 , 22.

  1. Термической обработки человека норовирус Сидней GII.4 capsids
    1. получения очищенного человека норовирус основных капсид белка (VP1) GII.4 Сидней (присоединение: JX459908) собрались в capsids.
      Примечание: Capsids в исследовании были получены любезно Атмар р. (колледж Бейлор, Хьюстон, TX).
      2. Capsids
    2. развести в 50 мкг/мл в 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,2) максимальный объем 15 мкл в отдельных ограничен пробирках, ПЦР. Убедитесь, что трубка содержит по крайней мере 600 нг капсида. Убедитесь, что 600 нг капсида в сочетании лечения лиганд.
    3. Разогреть тепловой cycler для желаемого термообработки.
      Примечание: для целей настоящего Протокола, лечение на 68 ° C для разных времен (0 - 25 мин) был выбран.
    4. Разогреть дополнительной тепловой циклователь до 4 ° C для немедленного охлаждения. Добавьте трубы с решением капсид тепловой циклователь на требуемое время. Немедленно передать циклователь предварительно охлажденным 4 ° C за 5 мин после нагрева. Лечение
      1. включают 95 ° C за 5 мин как элемент денатурированного капсида. Включают необработанные (23 ° C) капсид решение как позитивный элемент управления. Включать PBS с не капсид как элемент дополнительные негативные.
    5. Кратко вращаться вниз в центрифуге получить все капельки в нижней части трубки и разбавить обработанных капсид решения в PBS 3 мкг/мл. Убедитесь, что имеется по крайней мере 200 мкл разбавленным, обработанного капсид (100 мкл/а).
  2. Применить 100 мкл капсид решения для каждой скважины, обеспечение, есть по крайней мере две скважины за лечение. Кроме того включают в себя 2 контроль скважины с 100 мкл PBS для каждого лиганда; Это обеспечивает фон поглощения assay. Крышка с крышкой, уплотнение края с парафином фильм для уменьшения испарения и оставить на ночь на тряску инкубатор на 4 ° C или за 2 ч при комнатной температуре.
  3. Подготовить блокирующий буфер, сделав 5% обезжиренное молоко твердых (w/v) в PBS с 0,05% 20 анимации (PBST).
  4. Удалять обработанные капсид решения от пластины. Добавьте 200 мкл/хорошо блокировки буфера. Проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре или на ночь, опечатали на 4 ° C.
  5. Подготовка лигандом привязки решения для биотинилированным aptamer M6-2 18 , 29 и биотинилированным синтетических HBGA крови типа A или биотинилированным типа H.
    1. Развести биотинилированным aptamer до 1 мкм в нуклеиназы свободной воды. Убедитесь, что имеется достаточно решение для 200 мкл суммарной величины для каждого обращения. Разбавьте выбранной биотинилированным HBGA 30 мкг/мл в блокирующем буфере. Убедитесь, что есть достаточно решение для 200 мкл суммарный объем для каждого лечения.
      Примечание: Чтобы использовать меньше HBGA, может быть заменен 10 мкг/мл HBGA в 0,25% обезжиренное молоко PBST. Концентрации для биотинилированным M6-2 и HBGA были ранее оптимизированы и сообщил.
  6. Удалить блокирующий буфер и мыть тарелки 3 раза с 200 мкл в хорошо PBST. ПЭТ пластину вниз на стерильную бумажные полотенца для сухой остаточной влаги.
  7. Добавить 100 мкл/колодец лигандом привязки решения, обеспечивая, что есть 2 скважин в сочетании термической обработки лиганд. Инкубировать пластину покрытый крышкой на орбитальный шейкер на около 60 об/мин за 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Не забудьте включить 2 скважины необработанных capsids и полностью денатурированного capsids для каждого лиганда как позитивные и негативные элементы управления, соответственно. Кроме того, включают в себя 2 " не капсид " скважин для каждого лиганда как пластины фон управления.
  8. Удалять решения лиганда и Промыть лунки 3 раза с 200 мкл в хорошо PBST. ПЭТ пластину вниз на стерильную бумажные полотенца для просушки остаточной влаги.
  9. Добавить 100 мкл/хорошо раствора 0,2 мкг/мл стрептавидина-пероксидаза в PBS. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре с нежным встряхивания на орбитальный шейкер.
    Примечание: Различные стрептавидина хрен пероксидазных конъюгатов будет иметь различные концентрации. Консультации пользователя ' руководство для идеального диапазон концентраций для ELISA приложений фермента и убедитесь, что это оптимальное.
  10. Удалить раствор конъюгата. Вымойте 3 раза с 200 мкл в хорошо PBST. ПЭТ пластину вниз на стерильную бумажные полотенца для просушки остаточной влаги.
  11. Добавить 100 мкл/хорошо 3,3 ', 5,5 '-тетраметилбензидина (ТМБ) субстрат и разрешить цвет развивать в 5-15 мин наблюдать отрицательный контроль скважины для любого цвета и не забудьте последовательно развивать за то же время между реплицировать пластинами. Помните, спектра поглощения читателя пластины, используемые, а также.
    Примечание: Развивающихся раз могут различаться в зависимости от качество лигандов/реагенты используемые.
  12. Остановить развитие реакции с 100 мкл/ну 1M фосфорной кислоты. Сразу читать пластины на 450 Нм. Сохранить данные.
    Примечание: Введение кислоты обычно замедляется реакция резко, но не полностью остановить его. Не оставляйте остановился пластины для расширенной количество времени перед чтением поглощения.

2. Анализ результатов на основе плиты Assay

  1. сохранить сырье поглощения данные в программу электронных таблиц. Производят средняя absorbances для каждой пары хорошо с специфического лечения и лиганда. Используйте эти средние показатели для всех последующих анализов.
    Примечание: Сравнить оба хорошо absorbances, чтобы убедиться, что не пар скважин имеют значительно значения.
  2. Для анализа абсолютного капсид целостности (все привязки), вычесть сырья поглощения из " не капсид " управления от всех других значения поглощения образцов.
    Примечание: в качестве альтернативы, потере привязки из-за потери структуры высшего порядка (среднего, высшего, четвертичные) могут непосредственно быть проанализированы. Вместо вычитания поглощения отрицательный (не капсид) управления, вычтите значение элемента управления полностью денатурированного капсида. Это удаляет все привязки сигнала за счет неспецифического привязки к аппарату, а также обязательную силу из-за последовательности капсида. HBGA и aptamer M6-2 дисплей мало привязки полностью денатурированного капсида, поэтому либо метод дает аналогичные результаты. Ложных положительный сигнал, приписываемых aptamer неспецифического связывания необходимо учитывать при выборе какой анализ использования.
  3. С отрицательным или денатурированного регулировать absorbances деления для лечения absorbances, их соответствующие положительные (без лечения) управления absorbances и умножить на 100. Это обеспечивает процент сигнала обработанных капсид относительно управления необработанными.
  4. Для оценки степени связывания сигнала для каждого лиганда объясняется к капсидному последовательности, вычесть " не капсид " отрицательный контроль от первоначального absorbances и принять скорректированные поглощения денатурированного капсида. Разделите это на скорректированные поглощения позитивный сигнал и умножить его на 100. Это дает явное процент сигнала благодаря лигандом привязки к последовательности денатурированного капсид/капсида.

3. DLS для обнаружения вируса агрегации после термической обработки

Примечание: Ниже шаги могут быть специфическими для программного обеспечения и инструмент используется, но могут быть адаптированы и аналогичных устройств.

  1. Создать новый размер СОП в DLS инструмент программного обеспечения с помощью: материал = белка, диспергаторы = PBS, температура = 25 ° C, время уравновешивания = 0 сек, тип ячейки = одноразовых кювет (малый объем, ZEN0040), измерение угла = 173° обратного рассеяния, Длительность измерения = автоматический, количество измерений = 3, задержка между измерениями = 0 сек, обработка данных: модель анализа = общего назначения (нормальный режим). Использовать параметры по умолчанию для всех остальных параметров.
  2. Выберите зеленую стрелку запуска в рамках программного обеспечения и имя образца.
  3. Выполните шаги 1.1.1 через 1.1.4 для термической обработки VLP.
  4. Развести тепло относились VLP 1:10 в 1 x PBS для конечной концентрации 5 мкг/мл. (Необязательно) Фильтр образец с размером пор 1 мкм, чтобы удалить частицы пыли; DLS очень чувствителен к пыли, как крупные частицы рассеивают гораздо больше света, чем небольшие частицы.
  5. Передачи 50 мкл разбавленного VLP в небольшом объеме одноразовые кюветы. Вставьте кювета в палате образец документа.
  6. Запустить запустить и использовать ' Correlogram ', ' кумулянтов Fit ', и ' эксперт советы ' вкладки для оценки качества данных.
    1. Во время выполнения, убедитесь, что значение индекса полиизопрена меньше чем 0,3, представляющие качества измерения. В ‘ нескольких ’ вкладка, убедитесь, что коэффициент корреляции является постоянная и близко к, но не более чем 1, на короткое время, и капель покинуть резко 0 на более позднее время, характерные для размера частиц. Использование ‘ эксперт советы ’ вкладка для обратной связи по вопросам качества данных во время измерений.
    2. После завершения измерения снова проверьте, что значение индекса полиизопрена меньше чем 0,3. Убедитесь, что кумулянтов подходят следующие линии, точки данных тесно в ‘ кумулянтов подходят ’ таб
  7. Взять среднее Z-средний диаметр частиц для каждого измерения, как размер частиц каждого образца. Участок диаметром в Нм против температура в ° C.

4. DLS для обнаружения вируса агрегата в режиме реального времени

Примечание: следующие действия могут быть специфическими для программного обеспечения и инструмент используется, но могут быть адаптированы и аналогичных устройств.

  1. Создать новый размер СОП в DLS инструмент программного обеспечения с помощью: материал = белка, диспергаторы = PBS, температура = как желаемое, время уравновешивания = 0 сек, тип ячейки = кварцевые кюветы, измерения угла = 173° обратного рассеяния, продолжительность измерения = автоматический, Количество измерений = 50 (возможно увеличение или уменьшение зависимости агрегации ставка), задержка между измерениями = 0 сек, обработка данных: модель анализа = несколько узких режимов (высокое разрешение). Использовать параметры по умолчанию для всех остальных параметров.
  2. Выберите стрелку запуска в программное обеспечение для открытия и имя нового образца и позволить инструмент для достижения равновесной температуры.
  3. Приостановить VLP ПБС в пробки microcentrifuge в концентрации 5 мкг/мл и тома между 200-500 мкл. Vortex подвеска.
  4. Спина вниз VLP подвеска для 5-10 s в настольная центрифуга для удаления газа. Это помогает предотвратить образование пузыря во время термической обработки, что мешает размеры.
  5. Передачи VLP подвеска для небольшой объем кварц кювет избежать пузырей и Пипетка медленно к стене кювет. После того, как инструмент достигла температуры равновесия, вставьте в камеру образец кювета.
  6. Ждать 10 s для температуры образца сбалансировать, затем начать запуск. Запуск таймера в начале выполнения. Остановка таймера в конце первого измерения. Возьмите этот раз в качестве первой точки время. Получить точек последующее время от времени измерения, записано программное обеспечение.
  7. Начать запуск и контролировать некотором, распределение подходят и экспертные консультации для оценки качества данных.
    Примечание: PDI не будет обязательно, что меньше чем 0,3 для этих измерений как образца предполагается полидисперсных во время агрегации.
    1. Убедитесь, что коэффициент корреляции является постоянная и близко к, но не более чем 1 на короткое время и резко падает в один или более позднее время, характерный размер частиц.
    2. Убедитесь, что распределение подходят следующие линии, точки данных тесно.
  8. Анализ данных размер.
    1. Определить каждый раз, когда точка от разницы во времени между каждым измерением и точкой начальное время. Измерения длительности являются не все ровно то же самое.
    2. С помощью распределения интенсивности, запишите размер вершины с крупнейших областей для каждой точки времени измерения.
    3. Участок пик диаметров в Нм против раз в мин.

5. Подготовка образца ТЕА

  1. получить углерода поддержки фильм (никель) сетки для ТЕА.
    Примечание: Консультации с Фондом основные рекомендованные реагентов и их обработки для использования с микроскопом объекта. Будьте уверены, чтобы хранить сетки в поле, содержащее влагопоглотителя или вакуумной камере для сведения к минимуму воздействия влаги.
  2. Слезу примерно 5 х 5 см кусочки фильтровальной бумаги. Получения стекла Петри и надлежащего самозакрывающиеся обратный пинцет предназначен для использования в микроскопии.
  3. Сократить примерно 2,5 см х 5 см кусок парафина фильма. Место на benchtop.
  4. Термообработки норовирус Сидней GII.4 capsids
    1. процедура термической обработки точно так, как описано выше 1.1.1 - 1.1.5 за исключением: 10 мм HEPES (рН 7,4) для лечения вместо PBS и далее не разбавить capsids После лечения (держать раствор в 50 мкг/мл). Пипетка падение всего ~ 15 мкл лечение капсид раствор на парафин фильм.
  5. Захватить край сетки с помощью пинцета, позволяя им закрыть на краю провести сетки и место сетки углерода сторона вниз поверх падение лечение решения. Пусть Проинкубируйте втечение 10 мин позволить капсид приложить к сетке.
    1. В зависимости от чистоты подготовки капсида, моет 10 мм HEPES раствора при необходимости добавить в виде 10-15 капель мкл помещены в линии после обработанных капсид капелька.
    2. После 10 мин, Подберите сетку с капли. Место сетки почти перпендикулярно кусок фильтровальной бумаги, чтобы фитиль от капли. Подобрать капли 10-15 мкл HEPES буфера с сеткой, провести 30 s, то фитиль прочь с другой кусок фильтровальной бумаги в Вашингтон
  6. Место капельку 15 мкл раствора ацетата 2% уранила на пленке парафина в пустой области.
    1. Подобрать капли уранила винилацетата с сеткой и удерживайте 45 s. фитиль от уранила ацетат, будучи уверенным, чтобы удалить большую часть решения. Поместите сетку углеродные стороне вверх на кусок фильтровальной бумаги, стараясь, чтобы сетка не " палку " влаги на пинцетом. Место фильтр бумага с сеткой на него в открытой стеклянной чашке Петри.
      Примечание: Не используйте пластиковые чашки Петри, как сетки будет электростатически привлекли к ним и стать застрял блюдо.
  7. Повторить для всех процедур. Поместите половинки Петри с сетками в эксикатор ночь высохнуть до наблюдения с ТЕА.
  8. Консультации микроскопии фонда в соответствующие учреждения в отношении наблюдения за подготовленный сетки. Некоторые объекты позволяют пользователю пройти подготовку по эксплуатации их объекта ' s инструмент. Конкретные подробности, касающиеся установки и наблюдение за конкретным микроскопа-bсферу действия этой статьи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Структурная целостность человека норовирус Сидней GII.4 capsids (VLP) была оценена с помощью нескольких новых методов, представленный Moore et al. 17. Во-первых, эксперимент было сделано в котором целостности capsids как функция их способности связать предполагаемого рецептор/co-factor (HBGA) или на ssDNA aptamer (M6-2) были сравнению (рис. 1). Отобразятся результаты были ранее представлены Мур и др.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол и описанные здесь методы предоставляют средства оценки человека норовирус капсид целостности/функциональность. Эти методы могут быть использованы для получения механистический понимание последствий инактивации препаратов против вируса и потенциально могут дополнять более традиционные методы оценки инактивации например RT-ПЦР или доска пробирного. Например оценки химических или физических инактивации, assay металлической пластинкы только обеспечивает определенную степень инактивации вирусов, но не основной механи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана сельского хозяйства и продовольствия исследований инициатива конкурентных Грант № 2011-68003-30395 из Департамента сельского хозяйства Соединенных Штатов, национального института продовольствия и сельского хозяйства в рамках проекта NoroCORE. Финансирование для открытого доступа заряда была предоставлена Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов Америки. Мы хотели бы поблагодарить Роберт Атмар (колледж Бейлор, Хьюстон, Техас) за любезно предоставленную нам очищенный capsids и Валери Lapham за помощь с изображениями ТЕА. Мы также хотели бы поблагодарить Франк н. Барри за помощь нам начать эксперименты представил.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
plate-based Binding Analysis для оценки потери структуры капсида норовируса высшего порядка
96-луночный, среднесвязывающий полистирол EIA планшетFisher (Costar)07-200-36
Крышка для 96-луночного планшетаThermo Fisher3098
Парафиновая пленка (Парапленка)Thermo FisherPM999
1x PBS (рН 7,2)Life Technologies20012-050
Полисорбат 20Сигма-ОлдричP9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Полисорбат 20н/д/д
Очищенный, собранный норовирус человека GII.4 капсидын/д н/д
Индивидуальные 0,2 мл ПЦР-пробиркиGenesee Scientific22-154G
2 термоамплификатораBio-Rad
Настольная мини центрифугаFisher Scientific12-006-901
Обезжиренные сухие молочные веществаThermo FisherLP0031B
Синтетический гисто-группа крови тип А дисахарид, биотинилированныйGlycotech01-017
Биотинилированный аптамер M6-2 (исходная концентрация 100 &; M в воде, не содержащей нуклеаз): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'Интегрированная DNA TechnologiesН/А
Стрептавидин-хренпероксидаза конъюгат (класс ИФА), Мы используем Life Technologies SNN2004Life TechnologiesSNN2004
субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB), комнатная температураThermo Fisher50-76-00
1 М фосфорная кислотаН/ДН/А
Микропланшетный ридер способный считывать 450 нмTecanInfinite m200 Pro
Название<strong>Company>Каталожный номерКомментарии
Анализ результатов анализа на основе планшетов
Microsoft Excel или аналогичная программаН/ДН/Д
NameCompanyНомер в каталоге>Комментарии
>Эксперименты по динамическому рассеянию света
Zetasizer ZSP, или аналогичный инструмент для анализа размера частицMalvern InstrumentsN/A
VortexFisher Scientifc02-215-365
Кварцевая кюветаHellma104-002-10-40
Одноразовая кювета малого объема (для уменьшения использования VLP)Malvern InstrumentsZEN0040
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
<Сильная>Просвечивающая электронная микроскопия Подготовка образцов
Никелевые сетки для электронной микроскопии с углеродной пленкой-подложкойLadd Research10880-100
Самозамыкающийся пинцет для обратной электронной микроскопииТед Пелла5372-NM
Качественная фильтровальная бумагаSigma-Aldrich (Whatman)WHA1002055
Стекло чашкиПетри Сигма-ОлдричBR455743
100 мМ стоковый раствор HEPES (pH 7,2)Н/ДН/Д
2% уранилацетатН/Д/Д
н1861096 Н

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770(2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124(2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586(2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087(2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805(2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human NorovirusViral CapsidLigand BindingDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAptamer BindingCapsid IntegrityHeat TreatmentVirus InactivationCapsid Aggregation

Related Articles