Гриппа нейтрализующих антител коррелируют с защитой гриппа инфекций. Microneutralization измерения нейтрализующих антител в человеческой сыворотки и часто используются для гриппа человека серология. Мы описываем microneutralization анализа с использованием клеток MDCK-SIAT1 для измерения нейтрализующие антитела титры для современных вирусов, 3C.2a и 3C.3a A(H3N2) после вакцинации против гриппа или инфекции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерения гриппа, нейтрализуя антитело ответы на A(H3N2) вирусов в человеческой сыворотки, Microneutralization Assays клетки с помощью MDCK-SIAT1
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейтрализующие антитела против гемагглютинина (HA) вирусов гриппа, считаются основным иммунного механизма, который коррелирует с защитой для инфекции гриппа. Microneutralization (MN) анализы часто используются для измерения нейтрализующие антитела ответы в человеческой сыворотки после вакцинации против гриппа или инфекции. Клетки Madine Darby собак почек (MDCK) являются широко используемых ячеек субстрат для MN анализов. Однако в настоящее время циркулирует 3C.2a и 3C.3a A(H3N2) гриппа, которую приобрели вирусы изменена специфика связывания рецептора. MDCK-SIAT1 линия клетки с повышенной α-2,6 сиаловых галактозы постановление на поверхности оказалось обеспечить улучшение инфективности и более верным репликаций, чем обычные клетки MDCK для этих современных вирусов A(H3N2). Здесь мы описываем MN assay клетки MDCK-SIAT1, который был оптимизирован для количественного определения нейтрализации титры антител к этим современным A(H3N2) вирусов. В этом протоколе тепла инактивированная сера содержит нейтрализующие антитела являются впервые серийно разводили, затем инкубируют с 100 TCID50/хорошо A(H3N2) вирусов гриппа разрешить антител в сыворотке для привязки к вирусов. MDCK-SIAT1 клетки затем добавляется в смесь вирус антитела и инкубированы для 18-20 ч при 37 ° C, 5% CO2 разрешить A(H3N2) вирусов заразить клетки MDCK-SIAT1. После ночи инкубации, крепятся плиты и количество вируса в каждом хорошо количественно энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) с помощью противогриппозные Нуклеопротеиды (NP) моноклональные антитела. Нейтрализация титр антител определяется как взаимные высоких сыворотки разрежения, которая обеспечивает ≥50% ингибирования инфективности вируса.
Введение
Вирусы гриппа по-прежнему вызывать заболеваемость и смертность населения каждый год. ГА является основной поверхности гликопротеина вирусов гриппа. Нейтрализующие антитела против га являются основным иммунного механизма, который коррелирует с защитой гриппа инфекция1,2. Два метода, широко используется для измерения реакции антитела в человеческой сыворотки после гриппа инфекции или вакцинации3гемагглютинации ингибирование (HI) анализов и MN анализов. HI меры ингибитирование антитела вируса гемагглютинации красных кровяных клеток и считается пробирного суррогат. В отличие от Привет MN as....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все вирусы гриппа должны обрабатываться согласно требований к уровню соответствующего биобезопасности (BSL-2 или выше), определенных в области биобезопасности на микробиологические и биомедицинских лабораториях (BMBL)12.
1. Подготовка реагентов и исходного материала
-
Подготовка клетки MDCK-SIAT1 и стерильные клетки культуры среднего
- Подготовить MDCK-SIAT1 клеток культуры среднего с использованием 500 мл из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с высоким глюкозы, 10% v/v тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамин, 1 мм пирув....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Определение инфективности вируса запасов является первым шагом в MN assay. Рисунок 2 иллюстрирует структуру пластины для определения TCID50 запасов вируса. Для запасов вируса с неизвестным инфективности вирус можно титруют из нескольких предварительно разведений, например 10-2 и 10-3, чтобы захватить лучшие кривой титрования для вычисления инфективности вируса. Вирус сумма используется в MN assay должны быть стандартизированы .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
MN assay является одним из основных анализов, используемые для гриппа серология для обнаружения антител реакции после инфекции гриппа или вакцинации. Титры, созданный из MN анализов часто используются как основной результат многих исследований Сероэпидемиология гриппа. MN анализов также широко используются для серо диагностика и оценка иммуногенности вакцин. Международные Интер лаборатории исследования были проведены для сравнения MN анализов, выполненных в нескольких лабораториях14.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы доклада никакого конфликта интересов. Выводы и заключения в этой публикации являются мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды центров по контролю и профилактике заболеваний и финансирования Агентства.
Благодарности
Мы благодарим д-р Лу Xiuhua, доктор Фэн Лю и г-жа Эшли Берроуз в отделе гриппа CDC для их критического обзора и помощь в подготовке этой рукописи. Мы благодарим д-р Адриан Reber отдела гриппа CDC за его помощь в подготовке графика на рисунке 3. И наконец мы благодарим д-р M. Матросович, Марбург, Германия для обеспечения MDCK-SIAT1 клеток.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дульбекко s Модифицированная орлиная среда (DMEM) с высоким содержанием глюкозы | Life Science | 11965 | Критический компонент стерильной клеточной культуры, размножения вируса и разбавляющей вирус среды |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Гиклон | SH30070.03 | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) фракция V, свободная протаза | Сигма-Олдрич | 3117332001 | |
| L-глутамин | Life Science | 25030-081 | |
| Пируват натрия | Life Science | 11360-070 | |
| Генетин G-418 дисульфат соли | Сигма-Олдрич | А1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Life Science | 15140-122 | |
| Ацетон | VWR | 67-64-1 | Используется в 80% концентрации |
| фосфат-цитратный буфер с перборатом натрия | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-фенилендиамин дигидрохлорид таблетка | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 таблетка на 100 мл воды для клеточной культуры |
| Серная кислота | Fisher Scientific | A510-P500 | Используется 0,5М конечная концентрация |
| Этанол, денатурированный, 4 л | VWR | EM-AX0422-3 | Используется в 70% концентрации |
| Трипсин-ЭДТА | Life Science | ||
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP мышиный моноклональный | Ab Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-луночные планшеты с плоским дном | Thermo Scientific | 3455 | |
| Считыватель | пластин Молекулярное устройство | Spectromax 384 plus | |
| Колба для клеточных культур 162 см2/Вентиляционная крышка | Corning/VWR | 3151 |
Ссылки
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
