На основе массива сравнительной геномной гибридизации платформа для эффективного обнаружения копии номер вариации в быстро нейтрон-индуцированной Люцерна truncatula мутантов

Summary

Этот протокол обеспечивает экспериментальные шаги и информацию о реагентов, оборудования и инструменты анализа для исследователей, которые заинтересованы в проведении анализа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (CGH) всего генома копировать количество вариаций в растения.

Abstract

Мутантов являются бесценным генетических ресурсов для исследования функции гена. Для создания коллекции мутантов, могут использоваться три типа мутагенов, включая биологических например T-ДНК или transposon, химическая как этиловый метансульфонат (EMS) или физической например ИИИ. Тип мутации наблюдается варьируется в зависимости от мутаген используется. Для ионизации индуцированного излучения мутантов мутации включают, удаления, дублирования или перегруппировки. В то время как T-ДНК или на основе transposon мутагенеза ограничен видов, которые восприимчивы к трансформации, химические или физические мутагенеза может применяться к широкому спектру видов. Однако характеристика мутаций, производный от химических или физических мутагенеза традиционно опирается на карта на основе клонирования подход, который является труд интенсивной и много времени. Здесь мы покажем, что платформа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (aCGH) с высокой плотностью генома может применяться к эффективно обнаруживать и определять характеристики копии номер вариаций (CNVs) в мутантов, производный от быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ) мутагенеза в Truncatula Люцерна, бобовых видов. Весь геном последовательности анализ показывает, что существует более чем 50 000 генов или гена модели в . м. truncatula. В настоящее время, ФНБ индуцированной мутантов в . м. truncatula являются производными от более чем 150.000 линий M1, представляют собой бесценный генетические ресурсы для функциональных исследований генов в геноме. Платформа aCGH, описанные здесь является эффективным инструментом для характеризующие FNB-индуцированной мутантов в . м. truncatula.

Introduction

Бобовые (Fabaceae) — третий по величине семейство цветковых растений, с много экономически важных видов, таких как сои (Glycine max) и Люцерна (Medicago sativa). Бобовых растений может взаимодействовать с азотфиксирующих бактерий почвы, как правило, называют Rhizobia для разработки корневого узелки, в которых атмосферного азота уменьшено до аммиака для использования растения-хозяина. Таким образом выращивания бобовых культур требует мало ввода азотных удобрений и таким образом способствует устойчивому развитию сельского хозяйства. Бобовых производства, листья и семена с высоким содержанием белка, служит отличным кормом и зерновых ку....

Protocol

Примечание: на рисунке 1 показано пять шагов для массива CGH протокол. Они являются: 1) подготовка растительных материалов; 2) изоляции высокого качества образцов ДНК; 3) обозначать и очистки образцов ДНК; 4) гибридизации, мойки и сканирование всего генома массивов; и 5) анализа данных CGH. М. truncatula весь геном черепица массивы содержат в общей сложности 971,041 уникальный oligo зонды, нацеленных на более чем 50 000 генов или модели гена в геном (см. таблицу материалов). Уникальный зонды находились на расстоянии приблизительно каждые 150 пар оснований (ВР) в exonic регионах и 261 bp в intronic регионах гено....

Results

Рисунок 2 показывает распределение коэффициентов₂ нормализованных журнала мутант против WT сигналы через весь геном. Анализ данных CGH показал примерное удаление 22 КБ на хромосоме 4, которая охватывает весь ген SUNN ³³ и несколько других Аннотированная генов в FN6191 мутанта (рис. 2, рис. 3). Кандидат удаленные региона была покрыта 73 последовательных прео.......

Discussion

Мы разработали платформу на основе массива CGH для обнаружения и определения характеристик быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ)-индуцированной мутантов в . м. truncatula cv. Jemalong A17. Чтобы продемонстрировать использование массива CGH метод выявления мутаций гена, мы провели анализ aCGH мутант FN6191, который exhibited фенотип гипер узелки в отличие от дикого типа растений, когда прививки с S. meliloti Sm1021. Для анализа сегментации сегмент было сочтено значительным, если коэффициент₂ ж.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula массив генома, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (мутантный)	В доме	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (референс)	В доме	A17
Серная кислота	Sigma-Aldrich	320501
заводе DNeasy Мини Kit	Qiagen	69104
Нанокапельный спектрофотометр	Thermo Scientific	1000D
SureTag Набор для маркировки ДНК	Agilent	5190-3400
Случайный праймер	Agilent	5190-3399
Ацетонитрил	Sigma-Aldrich	271004-1L
Термоамплификатор	MJ исследовательский	PTC-200
Центрифуга	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Решение для стабилизации и сушки	Agilent	5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Комплект для гибридизации	Agilent	5188-5380
Прокладка камеры гибридизации	Agilent	G2505
Человеческая кроватка 1 DNA	Agilent	5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Буфер промывки 1 и 2	Камера	Agilent 5188-5221
, нержавеющая сталь	Agilent	G2534A
Печь для гибридизации	Agilent	G2545A
Очистительные колонны	Agilent	5190-3391
Лазерный сканер	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Nimblegen	5225035001
Сигнальная карта 1.9	Roche Nimblegen	Сигнальная карта1.9