Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56508

⸱

6 февраля 2018 г.

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Мы описываем метод для производства человеческих антител специфических для антигена интереса, начиная от редких B-клетки, циркулирующие в крови человека. Поколение этих естественных антител является эффективным и быстрым, и полученные антитела могут различать высоки родствены антигены.

Аннотация

Моноклональные антитела (mAbs) являются мощными инструментами, полезны для обеих фундаментальных исследований и в биомедицине. Их высокая специфичность незаменима, когда антитела необходимо различать высоко соответствующих структур (например, нормальный белок и мутировавших версии их). Текущий способ генерации такие дискриминационные mAbs включает в себя обширный показ нескольких Ab продуцирующих клеток, который является дорогостоящим и трудоемким. Мы предлагаем здесь быстрый и рентабельный метод для генерации дискриминационный, полностью человека mAbs, начиная от циркулирующих лимфоцитов крови человека. Оригинальность этой стратегии объясняется выбор специфического антигена привязки B клеток в сочетании с борьбе с выбором всех остальных ячеек, с помощью легко доступных периферической крови одноядерных клеток (КСДОР). После того, как конкретные клетки B изолированы, cDNA (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) последовательности кодирования для соответствующего МАБ получаются с помощью технологии отдельной ячейки обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и впоследствии выразил в человека клетки. В течение всего за 1 месяц можно производить миллиграммов весьма дискриминационный человека mAbs, направленных против практически любого желаемого антигена, естественно обнаружены клетки B репертуар.

Введение

Метод, описанный здесь позволяет быстрый и универсальный производства полностью человеческих моноклональных антител (mAbs) против желаемого антигена (Ag). mAbs являются важнейшими инструментами во многих фундаментальных исследований приложений в пробирке и в естественных условиях: поток цитометрии, гистология, Западный blotting и блокирования эксперименты, например. Кроме того mAbs используются более в медицине для лечения аутоиммунных заболеваний, рака и для управления трансплантации отклонение1. Например анти CTLA-4 и анти PD-1 (или анти PD-L1) mAbs недавно использовались как ингибиторы иммунной контрольно-пропускной пункт в рака лечение2.

Первый mAbs были произведены иммуноглобулина (Ig)-секретирующих hybridomas полученные из клеток splenic иммунизированной мыши или крысы. Однако сильный иммунный ответ против мышиных или крыса mAbs препятствует их терапевтического использования в людей, из-за их быстрое разминирование и вероятных индукции реакций гиперчувствительности3. Для решения этой проблемы, животного белка последовательности mAbs были частично заменены на человека для создания так называемых химерных мыши человека или гуманизированные антитела. Однако эта стратегия лишь частично уменьшается иммуногенность, существенно увеличивая стоимость и сроки производства. Лучшее решение заключается в создании человека mAbs непосредственно из клеток человека B и несколько стратегий для этого. Один из них является использование фага или дрожжи дисплея. Это включает отображение переменной доменов из библиотеки комбинаторной случайных человеческий Ig тяжелых и легких цепей на бактериофаги или дрожжей и проведение отбора шаг, используя специфический антиген интереса. Основным недостатком данной стратегии является случайным образом связаны, приводит к очень большое увеличение в разнообразии сгенерированный антител тяжелых и легких цепей. Антитела, которые получены вряд ли соответствуют тем, которые возникнут в результате естественной иммунный ответ против особенно Ag. Кроме того сворачивание белков человека и столб-поступательные изменения не воспроизводятся систематически в прокариотах или даже дрожжей. Второй метод производства человека МАБ-увековечении естественных человеческих клеток B инфекции вирусом Эпштейна - Барр или выражением анти apoptotic факторов BCL-6 и BCL-XL4. Однако этот метод применим только к ячейкам памяти B и является неэффективным, требующие проверки многочисленных МАБ производители увековечен клеток B определить несколько (если таковые имеются) МАБ клоны с желаемой антигенной специфичности. Таким образом, этот метод является дорогостоящим и трудоемким.

Недавно был описан новый протокол для производства человеческого mAbs от изолированных одной клетки B5. Он полагается на оптимизированной одноклеточных обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для усиления из обоих тяжелых - и свет цепи кодирования сегменты из одной клетки B сортировки. Это сопровождается клонирования и выражение этих сегментов в системе эукариотических выражения, таким образом позволяя реконструкция полностью человека МАБ. Этот протокол был использован успешно начиная с B клеток от вакцинированных доноров. Клетки были собраны через несколько недель после вакцинации для получения высоких частот клеток B, направленных против желаемого Ag и таким образом ограничить время, необходимое для скрининга6. Были также подготовлены другие полностью человека mAbs от инфицированных ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)+ больных7 и меланома пациентов8. Несмотря на эти успехи до сих пор не существует процедуры доступны, что позволяет изоляции Ag специфические клетки независимо от их памяти фенотип или частоты.

Процедура описана здесь приводит к изоляции эффективным ex vivo человека циркулирующих клеток B, основанный на специфике их BCR, следуют производство полностью человека антиген специфические mAbs высокой урожайности и с низкой скрининга время. Метод не ограничивается ячеек памяти B или антител секретирующие клетки B индуцированных после иммунного ответа, но может также применяться к Справочнику B клеток человека наивными. Что он работает даже начиная с B Ag специфические клетки присутствуют на очень низких частотах является хорошим показателем эффективности его работы. Принцип метода является следующим: мононуклеарных клеток периферической крови (КСДОР) окрашенных с двумя тетрамера, представляя антигена интереса, каждый обозначен с различными флюрохром (например, фикоэритрин (PE) и аллофикоцианин (APC)), и третий Тетрамер, представляя тесно связанных антигена проспряганное с третьего флюрохром (например, Brillant фиолетовый 421 (BV421)). Для обогащения для антиген связывая клетки, клетки затем инкубируют с бисером, с анти PE покрытием и анти APC Abs и отсортированных в ячейке разделения столбцов. Фракция клеток БТР PE+ + выбран, окрашенных с различными mAbs конкретные для различных типов клеток КСДОР для идентификации клеток B и подвергли течь цитометрии сортировки клеток. B-клетки, которые являются PE+ и APC+, но блестящий фиолетовый-, являются изолированными. Этот шаг выбирает часовой клетки, которые не являются клетки B или не связывайте к tetramerized антигену, но связывать PE или APC (эти клетки будет PE+ APC– или PE– APC+) или часть-антигена тетрамера используется (эти клетки будут BV421+). B не весьма специфический для эпитопов интерес также часовой выбраны ячейки на этом шаге (эти клетки также будут BV421+). Таким образом этот метод может очистить весьма специфические клетки B, выражая B-клеточные рецепторы (БКРС) способны различать два очень тесно связанных антигены. Отдельные конкретные ячейки B собираются в трубы и их усиленный ПЦР Ig cDNAs (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) клонирован и выразил линией клеток человека как секретируемые mAbs IgG.

Как доказательство концепции, это исследование описывает эффективным поколения человека mAbs, которые признают пептид представлены классом комплекс гистосовместимости I (MHC-I) молекулы и может различать этот пептид и других пептидов, загружены на том же MHC-I аллеля. Хотя уровень сложности этого Ag имеет важное значение, этот метод позволяет (i) высокодоходных восстановления Ag конкретных mAbs; (ii) производство mAbs состоянии различать между двумя структурно закрыть Ags. Этот подход может быть расширен для прививки или зараженных пациентов без каких-либо изменений в протокол, а также уже успешно реализованы в системе гуманизированные крыса9. Таким образом это исследование описывает универсальный и эффективный подход к генерации mAbs полностью человеком, который может быть использован в фундаментальные исследования и иммунотерапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все образцы периферической крови человека были получены от анонимных взрослых доноров после обоснованного согласия, в соответствии с местными Этический Комитет (Etablissement Français du пел, EFS, Нант, процедура PLER NTS-2016-08).

1. изоляция мононуклеаров периферической крови человека

Примечание: Начиная материал может быть всего периферической крови человека или cytapheresis образцов. Образцы должны быть не старше 8 h и дополнены с антикоагулянтами (например, гепарин).

  1. Разбавьте кровь с 2 тома (периферической крови человека) или 5 томов (cytapheresis образцов) среды RPMI (Розвелл парк Мемориальный институт).
  2. Тщательно слой 35 мл суспензии разреженных клеток на 15 мл градиента плотности среды в 50-мл Конические трубки. Сделайте столько трубы при необходимости распространить все разбавленной крови. Центрифуга в 1290 x g 25 мин при комнатной температуре в ротор размахивая ведро с тормозом выкл.
  3. Тщательно аспирационная слоя мононуклеарных клеток на стыке среднего градиента плотности и плазменный слой и клетки перехода к новой 50 мл Конические трубки.
  4. Заполнить трубу с RPMI среднего, смешать и центрифуги в 1290 x g 10 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант.
  5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл RPMI среднего и центрифуги на 200 x g 10 мин для удаления тромбоцитов. Осторожно удалите супернатант. Повторите этот шаг один раз.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в среду RPMI с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС).
    Примечание: Перейти непосредственно к Тетрамер маркировки или сохранить клетки на 4 ° C на ночь в концентрации 107 кл/мл.

2. Тетрамер связанные магнитного обогащения Ag специфических клеток

  1. Подготовить АГ тетрамера, добавляя либо PE или APC-меченых премиум класса стрептавидина или BV421-меченых стрептавидина на молярное соотношение 1:4 до биотинилированным антигена мономеров. Добавьте соответствующее количество стрептавидина конъюгата в трех отдельных частей, добавив один Алиготе каждые 10 мин при комнатной температуре.
  2. Распределить клетки (8 до 3 x 10 в трубку) в 15 мл конические трубы и центрифуги на 460 x g за 5 мин.
    Примечание: Следующий протокол предназначен для одной трубы.
  3. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл PBS (фосфат буфер солевой) с 2% FBS. Добавьте PE-, APC и конъюгированных BV421 тетрамера, каждый в конечной концентрации 10 мкг/мл. Хорошо перемешайте и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
  4. Подготовить ледяной клетки разделения буфера (SB) с помощью PBS с 0,5% BSA (бычий сывороточный альбумин) и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) 2 мм.
  5. Добавьте 10 мл SB. Пелле клетки центрифугированием в 460 x g за 5 мин.
  6. Ресуспензируйте клетки в 500 мкл ледяной SB. Добавьте 50 мкл анти PE и 50 мкл магнитные микрошарики анти APC.
  7. Хорошо перемешайте и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C.
  8. Повторите шаг 2,5 дважды.
  9. Ликвидировать супернатант тщательно andresuspend клетки Пелле в концентрации 2 x 108 клеток/мл в лед холодной SB.
  10. Сбалансировать большой магнитной столбец позиционируется на магнит с 3 мл SB.
  11. Передача суспензию клеток с 2,9 на вершину столбце уравновешенной и позволить ему стечь полностью. ВАЖНЫЙ шаг: Во избежание слипания столбца, пройти 70 мкм нейлоновая сетка клетки.
  12. Промойте трубку, которая содержит ячейки с 3 мл холодного льда SB и передачи буфера непосредственно на столбце (в случае фильтрации, промыть 70 мкм нейлоновая сетка).
  13. Когда буфер полностью осушенных в столбец, добавьте еще 3 мл холодной SB льда в столбец.
  14. Повторите шаг 2.13 для другой 3 мл мыть.
  15. Удалите столбец из магнита и место над 15 мл конические собирая трубки.
  16. Добавьте 5 мл холодного льда SB на верхней части колонны и немедленно промойте клетки из столбца с помощью плунжера. Повторите этот шаг один раз.
  17. Центрифуга собранных клетки (обогащенный соответствующих Тетрамер положительный клеточный фракция) на 460 x g 5 мин и приступить к пятнать дополнительные антитела.
    Примечание: Бассейн собранные клетки из всех труб, если это уместно.

3. Окрашивание Ag конкретного человека B клеток и сортировки клеток

  1. Ресуспензируйте клетки лепешка с коктейлем античеловеческие антител против CD3 (окончательного растворения: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50) и 7AAD (1: 1000) в конечный объем 100 мкл PBS с 2% FBS. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
  2. Добавление в ячейки, центрифуги на 460 x g за 5 мин, 10 мл PBS и ликвидации супернатант. Повторите этот шаг один раз. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл PBS, фильтр на 70 мкм нейлоновая сетка.
  3. Перейти к сортировки конкретные клетки B на уровне одной ячейки на сортировщик цитометр ячейки с насадкой 100 мкм и давлении 20 psi не превышает 1000 событий/s9.
    Примечание: Стробирования стратегия используется показан на рис. 1. Клетки были впервые воротами на CD14–CD16 7AAD–– клетки, чтобы исключить моноцитов, НК и мертвые клетки (не показан на рис. 1). Затем CD19+ B клетки были выбраны перед стробирования на двойной окрашенных клеток PE и APC соответствующих Ag тетрамера. Неспецифическая B клетки были исключены от стробирования на отрицательные клетки BV421 (незапятнанное нерелевантных Ag Тетрамер).
  4. Сбор одной клетки B в 8-газа ПЦР трубы ранее заполнены с 10 мкл ПБС и 10 единиц АБС битор РНКазы и помещены на стойке для 96 пробирок. Немедленно заморозить трубы ПЦР-80 ° c.
    Примечание: Маски сортировки, выбранного на инструменте цитометр являются урожайность маска: 0, чистоты маска: 32 и маска фаза: 0. Этот депозит одноклеточных могут быть скорректированы на тарелку ПЦР 96 - или 384-ну при необходимости. Одноместный B клетки должны быть заморожены как можно быстрее и можно оставить на-80 ° C в течение нескольких недель, в случае необходимости.

4. одну ячейку RT-PCR

  1. Лизируйте клетки непосредственно нагрев замороженной образцы в PCR полос при 70 ° C за 5 мин в сухом Бате.
  2. Передача полоски лед и приступить к обратный транскрипции (RT), добавив 10 мкл на трубку 2 x мастер смесь буфер, содержащий dNTP 1 мм, 25 мкг/мл oligod(T) грунты, 5 мкм случайных hexamers, 20 единиц АБС битор РНКазы и 400 единиц обратной транскриптазы.
    Примечание: После отогрева клетки, RT должны выполняться быстро чтобы избежать деградации РНК.
  3. Инкубируйте при 25 ° C за 5 минут позволить случайных hexamers гибридизируйте, затем инкубировать 1 час при температуре 50 ° C, и закончить с инкубации на 95 ° C в течение 3 мин до остановки реакции.
  4. Продолжите с двух раундов вложенных амплификации PCR для каждого из регионов, кодирование для переменной тяжелых (vH) и Каппа (vLκ) или лямбда легкие цепи (vLλ).
    Примечание: в качестве альтернативы, RT образцы могут быть заморожены при-20 ° C и хранится на одну неделю.
    1. Для первого раунда PCR, добавить 3 мкл cDNA для 40 мкл заключительного тома, содержащего 1,5 мм MgCl2, дНТФ 0,25 мм, 2,5 единиц ДНК-полимеразы и 200 Нм внешних грунтовки (см. рис. 2 и Таблица материалов для последовательностей праймера).
      Примечание: Состав внешних грунтовки смеси. Для усиления тяжелые цепи: 4 вперед грунтовки (5' ГЛЖ микс) и 2 назад грунтовки (3' CµCγ mix). Для усиления света Каппа цепи, 3 вперед грунтовки (5' LV | смесь) и 1 обратный грунтовки (3' Cκ543-566). Для усиления лямбда легкие цепи 7 вперед грунтовки (5' LVl микс) и 1 назад грунтовки (3' Cl).
      Примечание: Грунтовки были разработаны et al. культиватор для усиления всех семейных генов тяжелой и легкой цепи5.
    2. Применяются следующие условия Велоспорт: 94 ° C для 4 мин, после чего 40 циклов 30 s на 94 ° C, 30 s на 58 ° C для VH и VLκ (60 ° C VLλ) и 55 s при 72 ° C, с удлинением окончательный шаг в 72 ° C для 7 мин.
    3. Для второго раунда PCR, используйте 3 мкл первого продукта Усилители для окончательный объем 40 мкл, содержащего 1,5 мм MgCl2, дНТФ 0,25 мм, 2,5 единиц ДНК-полимеразы и 200 Нм праймеров внутреннего, содержащие сайты энзима ограничения для клонирования в выражение векторы (см. рис. 2 и Таблица материалов для последовательностей праймера).
      Примечание: Состав смеси внутренней грунтовки. Для усиления тяжелые цепи: 9 вперед грунтовки (5' AgeIVH микс) и 3 назад грунтовки (3' SalIJH микс). Для усиления света Каппа цепи, 9 вперед грунтовки (5' AgeIV | смесь) и 3 вспять грунтовки (3' BsiWIJκ микс). Для усиления лямбда легкие цепи 6 вперед грунтовки (5' AgeIVl микс) и 1 назад грунтовки (3' XhoICl).
      Примечание: Грунтовки были разработаны культиватор et al., для усиления всех семейных генов тяжелой и легкой цепи5.
    4. Применяются следующие условия Велоспорт: 94 ° C для 4 мин, после чего 40 циклов 30 s на 94° C, 30 s на 58 ° C для VH и LCκ (60 ° C LCλ) и 45 s при 72 ° C с окончательной удлинение шаг в 72 ° C для 7 мин.
  5. Определите положительные скважин, перенос 5 мкл продуктов ПЦР vH, vLκ и vLλ на 1,5% агарозном геле (500 bp продукты для кодирования сегментов переменной тяжелые цепи) и 350 bp продукт для переменной лёгкие цепи кодирования сегментов.
  6. Очищайте оставшиеся 35 продуктов ПЦР мкл, оставшиеся от положительных скважин с использованием ультрафильтрационных мембран для очистки продуктов ПЦР.
  7. Элюировать продуктов ПЦР с 60 мкл H2O.

5. выражение клонирования

  1. Подготовить вставок
    Примечание: Дайджест 60 мкл каждого очищенного ПЦР продукта в окончательный объем 100 мкл, содержащие соответствующие энзима ограничения буфера.
    1. Для продуктов ПЦР vH добавить 50 единиц АИОД и 50 единиц Сали и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
    2. Для vLλ продуктов ПЦР добавить 50 единиц АИОД и 50 единиц XhoI и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
    3. Для vLκ продуктов ПЦР добавить 50 единиц АИОД и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Очистить дайджесты, используя 96 мембран PCR и элюировать с 60 мкл H2O. дайджест 60 мкл элюата в окончательный объем 100 мкл буфера энзима ограничения BsiWI, добавить 50 единиц BsiWI и инкубировать 1 час при температуре 55 ° C.
    4. Инактивации ферментов путем нагрева при 80 ° C в течение 15 мин.
  2. Подготовка выражения векторов
    Примечание: продукты PCR vH клонируются в вектора выражения (HCγ1), содержащий постоянной тяжелой цепи Cγ1 IgG1. vLκ продукты PCR клонируются в вектор выражения (LCκ), содержащий постоянные лёгкие цепи Cκ. vLλ продукты PCR клонируются в вектор выражения (LCλ), содержащий постоянные лёгкие цепи Cλ.
    1. Выполните следующие пищеварения.
      1. Смешайте 1 мкг выражения вектор HCγ1 с 10 единиц АИОД и 10 единиц Сали эндонуклеазами в общем объеме 20 мкл ограничение буфера, рекомендованный производителем и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
      2. Смешайте 1 мкг вектора выражения LCκ с 10 единиц АИОД энзима ограничения в общем объеме 20 мкл ограничение буфера рекомендованный производителем и инкубировать 1 час при температуре 37° C. Добавить 10 единиц BsiWI энзима ограничения и инкубировать 1 час при температуре 55 ° C.
      3. Смешайте 1 мкг вектора выражения LCλ с 10 единиц АИОД и 10 единиц эндонуклеазами XhoI в общем объеме 20 мкл ограничение буфера рекомендованный производителем и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C
    2. Тепло каждый пищеварение смесь при 65 ° C для 10 мин для инактивации ферментов ограничение.
    3. Выполняют лигирование 5 мкл переваривается продукта PCR с 2 мкл (100 нг) соответствующего выражение линеаризованного вектора в общем объеме 20 мкл 1 x ДНК лигаза буфер с 1 величины T4 ДНК-лигаза инкубации на ночь при 4 ° C.
      Примечание: в качестве альтернативы, перевязка выполняется за 3 ч при 4° C.
  3. Клонирование
    1. Electroporate 1 мкл 20 мкл лигирование смесь в 45 мкл домашнее electrocompetent TOP10 E. coli (текущие протоколы в молекулярной биологии, раздел 1.8.4-1.8.8). Сразу же 500 мкл 2 X YT средних и инкубировать в водяной бане при 37 ° C на 30 мин превращается распространение бактерий на 2 x YT ампициллин пластины. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Для каждого преобразования экран восемь колоний методом ПЦР.
      1. Настройка реакции премикс следующим на льду: 45 мкл 5 x буфер ПЦР, 12 мкл MgCl2 (25 мм), 4 мкл дНТФ (от запасов содержащий 10 мм каждого), 10 мкл вперед праймера (фондовая 10 мкм) гибридизировать вектор последовательности (праймер Ab-vec чувство) и 10 мкл обратного праймера (фондовая 10 мкм) ориентация региона постоянно тяжелые или легкие цепи (см. Таблицу материалы для последовательностей праймера). Составляют окончательный объем 200 мкл с H2O. Затем 4 мкл фермента ДНК-полимеразы (5 U/мкл).
      2. Распространите 25 мкл реакции премикса на ПЦР-пробирки 8-полосы на льду.
      3. Используйте стерильные зубочистку, чтобы забрать отдельных колоний. Полоска зубочистку на 2 x TY пластину ампициллин составляют реплицировать тарелку и затем окуните его в пробирку реакции PCR.
      4. Выполнять PCR скрининг при следующих условиях Велоспорт: 94 ° C в течение 10 мин, после чего 25 циклов 30 s на 94 ° C, 30 сек при 55 ° C и 50 s при 72 ° C.
      5. Выявление положительных бактерий путем переноса 5 мкл продуктов ПЦР на 1,5% агарозном геле.
        Примечание: Срабатываний колоний дают продукт PCR около 850 bp для векторных тяжелые цепи и 600 bp для легкой цепи вектора.
    3. Прививок четыре положительных колоний от реплицировать пластины в 2 мл среды LB и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
    4. Экстракт плазмид из жидкого культур, используя набор для очищения плазмиды, как указано заводом-изготовителем.
    5. Проверьте правильность подсоединения переменной доменов Сэнгером секвенирования плазмид грунтом Ab-vec смысл.
      Примечание: Плазмид с правильной вставки (кодирование HC и соответствующие LC) должны быть cotransfected в 293A клетки для секреции. Специфика малого масштаба производства mAbs assayed по ELISA. Затем крупномасштабное производство выполняется, если применимо.

6. производство mAbs

  1. Малосерийное производство для специфичности проверять
    1. За день до трансфекции, семян 15 000 человеческих эмбриональных почек 293A (ГЭС 293A) клетки в 200 мкл из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% FBS в скважину в 96-луночных пластины. Инкубируйте на ночь в CO2 инкубатора (5% CO2) при 37 ° C.
    2. Cotransfect 293A клеток в среде DMEM, содержащие 10% FBS с помощью линейной polyethylenimine производная как трансфекции реагента.
      Примечание: Выполните transfection triplicates. Следующий протокол предназначен для одной скважиной плиты 96-луночных плоское дно.
      1. Разбавьте 0.5 мкл Реагента трансфекции ДНК в 10 мкл 150 мм NaCl. Разбавьте 0,125 мкг vH и 0,125 мкг vL выражая векторов в 10 мкл 150 мм NaCl. Вихревой каждого разведения 10 s.
      2. Добавьте 10 мкл разбавленный ДНК трансфекции реагента в 10 мкл раствора ДНК. Вихревой 15 s и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Добавьте в смесь 20 мкл каплям на 293A клетки и смешайте нежно закрученного пластину.
    3. Замените средний 16 h после transfection и культуры клеток на 5 дней, в среде свободной от сыворотки.
      Примечание: Используйте сыворотки свободной среде, чтобы избежать сыворотки Igs, загрязняя производства антител.
    4. Ликвидации клеток и мусора центрифугированием в 460 x g за 5 мин.
    5. Урожай supernatants стремление с многоканальным пипетки и передавать их в V-дно 96-луночных плиту.
    6. Соответствующих Ag пальто на ночь при 4 ° C 100 мкл на хорошо восстановленный ELISA/ELISPOT покрытия буфера 1 x в конечной концентрации 2 мкг/мл в 96-луночных ELISA пластины. Смотрите примеры в 9.
    7. Уэллс блок с 10% среднего FBS DMEM втечение 2 ч при 37 ° C
    8. 50 мкл supernatants transfected 293A клеток из шага 6.1.5 и проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
    9. Добавьте 100 мкл против человека, который IgG Ab конъюгированных фермента пероксидазы (ПХ) хрен на 1 мкг/мл и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Добавьте 50 мкл Хромогенный субстрат (ТМБ) и проинкубируйте втечение 20 мин.
    10. Прочитано оптических плотностей на 450 Нм на спектрофотометре.
      Примечание: Конкретные mAbs выявили Пробирной ELISA Далее производится в крупных масштабах и очищается на протеине столбца представления сродство к IgG человека.
  2. Крупномасштабное производство и очищения конкретных mAbs
    1. За день до трансфекции, семян 6 x 106 человеческих эмбриональных почек 293A (ГЭС 293A) клетки в 175 см2 фляги, содержащих 25 мл DMEM дополнена 10% FBS. Инкубируйте на ночь в CO2 инкубатора (5% CO2) при 37 ° C.
      Примечание: Клетки должна быть 70% притока когда transfected.
    2. Cotransfect 293A клеток в среде DMEM, содержащие 10% FBS с помощью линейной polyethylenimine производная как трансфекции реагента.
      1. Развести 50 мкл Реагента трансфекции ДНК в 450 мкл 150 мм NaCl. Развести 10 мкг vH и 10 мкг vL выражая векторов в 500 мкл 150 мм NaCl. Вихревой 10 s каждого разведения.
      2. Добавьте разбавленные ДНК трансфекции реагента в ДНК решение. Вихревой 15 s и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Добавьте в смесь 1 мл каплям клетки и смешайте нежно закрученного колбу.
    3. Замените средний 16 h после transfection и культуры клеток на 5 дней, в среде свободной от сыворотки.
    4. Средний урожай, аспирационных с пипеткой 25 мл.
    5. Ликвидации клеток и мусора центрифугированием в 460 x g за 5 мин.
    6. Очищение антитела используя столбец 1 мл, покрытые белок на систему быстрого белка жидкостной хроматографии (ПСОК) при 4 ° C.
      1. Сбалансировать белка sepharose столбец с 20 мм фосфатного буфера (рН 7).
      2. Фильтр средних культуры клеток от 6.2.5, используя 1.22 мкм фильтр, а затем 0,45 мкм фильтром.
      3. Загрузите отфильтрованные среднего на столбец.
      4. Вымойте с 20 мм фосфатного буфера (рН 7) и элюировать с буфером цитрат 0,1 М (рН 3,5).
      5. Прочитано оптических плотностей на 280 Нм на спектрофотометре поглощения и немедленно нейтрализовать-белковые фракции с 1 М трис-буфере (рН 9).
    7. Dialyze очищенный Ab на ночь при 4 ° C в кассету с молекулярной массой 3,5 K отсечки против PBS буфере (рН 7,4).
    8. Стерилизация фильтрации и контроля чистоты 0,2 мкм, размер-гель-проникающей хроматографии, как указано заводом-изготовителем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Начиная от КСДОР от здоровых доноров, этот проект представляет поколения человека mAbs, которые признают пептидные Pp65495 (Pp65, от человека цитомегаловирус) представил комплекс гистосовместимости класса I (MHC-I) молекулы HLA - A * 0201 () HLA-A2). Эти mAbs можно различать этот комплекс и комплексы, представляющие другие пептиды, погружены же MHC-I молекулы.

КСДОР окрашивали с HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC и HLA-A...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предлагаемый протокол является мощный метод для генерации человека mAbs непосредственно от Ag конкретных B клетки, циркулирующие в крови. Она сочетает в себе три важных аспекта: (i) использование связанных Тетрамер магнитного обогащения, который позволяет ex vivo изоляции даже редкие Ag привязки B клеток; (ii) стробирования стратегия, использующая три тетрамера Ag (два актуальными и один) помечены с трех различных флуорохромов изолировать подачей cytometry, только клетки B выражая конкретных BCR для желаемого Ag...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим цитометрии объекта «CytoCell» (SFR Santé, Biogenouest, Нант) за экспертной технической помощи. Мы благодарим также всех сотрудников производство рекомбинантных белков (P2R) и влияние платформ (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Нант) за их техническую поддержку. Мы благодарим Emmanuel Scotet и Ричард Breathnach за конструктивные комментарии по рукописи. Эта работа была финансово поддержана IHU-Сести проект, финансируемый программой «Investissements будущее» французское правительство, управляемых по французского национального исследования агентства (НРА) (АНР-10-IBHU-005). IHU-Сести проект поддерживается также Métropole Нант и округов Луары. Эта работа была реализована в рамках программы LabEX IGO, поддержке национального исследовательского агентства через инвестиций будущего программы НРУ-11-LABX-0016-01.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HEK 293A клеточная линияThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by life technologies21969-035(+) 4,5 г/л D-глюкоза
0,11 г/л пируват натрия
(-) L-глутмин
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
Бычья сыворотка альбумин (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-фосфат буферизованный физиологический раствор (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,5M pH=8Invitrogen by Life Technologies15575-020
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - разделение лимфоцитов среднийEuroBioCMSMSL01-01плотность 1,0777+/-0,001
стрептавидина R-фикоэритрин конъюгатInvitrogen by Life TechnologiesS21388premiun grade 1мг/мл содержит 5mM азид натрия
стрептавидин, конъюгат аллофикоцианинаInvitrogen by thermoFisher scientificS323621мг/мл
2mM азид премиум класса
Brilliant violet 421 стрептавидинBiolegend405225конц: 0,5 мг/мл
Анти-ПЭ сопряженные магнитные микрогранулыMiltenyi Biotec130-048-801
Анти-APC сопряженные магнитные микрогранулыMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs или QuadroMACS сепароторMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
LSКолонки Miltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Использованное разведение 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Использованное разведение 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Использованное разведение 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Использованное разведение 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Используемое разведение 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter ЦитометрBD Biosciences
8-полосные ПЦР-пробиркиAxygen321-10-061
Штативы для 96 микропробирокDominique Dutscher45476
RNAseOUT Ингибитор рибонуклеазы (рекомбинантный)Invitrogen от thermoFisher scientific10777-019кол-во:5000U (40U/мкл)
Дистиллированная вода Dnase/Rnase FreeGibco10977-035
Oligod(T)18 мРНК ПраймерNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Случайные гексамерыInvitrogen от thermoFisher scientificN8080127кол-во: 50 мкМ, 5нмоль
Superscript III Обратная транскриптазаInvitrogen от thermoFisher scientific18080-044кол-во: 10000U (200U/мкл)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerasePromegaM7805
dNTP Set, Молекулярная биология классаThermo ScientificR01824*100 мкм
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		Первый раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Наружные праймеры - Форвард Прмерс
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		Первый раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Наружные праймеры - Форвард Прмеры
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		Первый раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Наружные праймеры - Форвард Прмерс
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTT
CCGAGGTGCAG		Первый раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внешние праймеры - Форвард Прмеры
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		Первый раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Наружные праймеры -Обратные праймеры для Ig человека - Бактериальный ПЦР-скрининг
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		Первый раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Наружные праймеры -Обратные праймеры для человеческого Ig
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры - Прямые праймеры
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGAGGGTGACCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Обратные праймеры
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Обратные праймеры
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		Второй раунд ПЦР - Амплификация тяжелых цепей - Внутренние праймеры -Обратные праймеры
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Наружные праймеры -Прямые праймеры
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Наружные праймеры -Прямые праймеры
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Наружные праймеры -Прямые праймеры
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Наружные праймеры -Обратные праймеры - Бактериальный ПЦР-скрининг
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTC		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей k - Внутренние праймеры -Прямые праймеры
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Наружные праймеры -Прямые праймеры
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Наружные праймеры -Прямые праймеры
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Наружные праймеры -Forward праймеры
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Наружные праймеры -Прямые праймеры
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Наружные праймеры -Прямые праймеры
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей &лямбда; - Наружные праймеры -Прямые праймеры
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей &лямбда; - Наружные праймеры -Прямые праймеры
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		Первый раунд ПЦР - Амплификация легких цепей &лямбда; - Наружные праймеры -Форвард праймеры
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей &лямбда; - Внутренние праймеры -прямые праймеры
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Внутренние праймеры -прямые праймеры
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей &лямбда; - Внутренние праймеры -прямые праймеры
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Внутренние праймеры -прямые праймеры
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTATGCTGACTCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей &лямбда; - Внутренние праймеры -прямые праймеры
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей &лямбда; - Внутренние праймеры -прямые праймеры
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		Второй раунд ПЦР - Амплификация легких цепей и лямбда; - Внутренние праймеры -Обратные праймеры - Бактериальный ПЦР-скрининг
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Бактериальный ПЦР-скрининг
QA Agarose-TM, молекулярная биология GradeMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlateMacherey Nagel743.100.100
Фермент Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U/мл
Фермент SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/мл
Фермент Xho INew England BiolabsR0146L20000U/мл
Фермент BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/мл
HCg1 (регистрационный номер Genbank FJ475055)
LCk (регистрационный номер Genbank FJ475056 )
LCl (присоединение Genbank номер FJ517647)
T4 ДНК-лигазаInvitrogen от thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT mediumSigma AldrichY1003-500ML
AmpicillinSigma Aldrich10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, РНК и очистка белкаMacherey Nagel740588.250
Jet PEI ДНК реагент для трансфекцииPolyPlus101-40
Плоское дно96-луночная пластинаFalcon353072
V-образное дно 96-луночная пластинаNunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 см2 колбыNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT покрытие буферeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp плоское дно 96 лунок ИФА планшетыNunc/Thermofisher44-2404-21высокий связывающий белок
Античеловеческий IgG Ab конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
субстрат TMBBD Biosciences555214
стрептавидиномсигмаS0677
1 mL-HiTrap белок A HP колонкаGE Healthcare17-0402-01
Ä KTA FPLCGE Healthcare18190026
колонка Superdex 200 10/300 GL GEHealthcare17517501
NGC Quest 10 Plus Система хроматографииBioRad7880003

Ссылки

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Теги

Мононуклеарные клетки периферической кровиодноклеточная ОТ-ПЦРсортировка методом проточной цитометриитетрамеры HLA-A2/Pp65разделение с помощью магнитных микросферИФА-анализповерхностный плазмонный резонансамплификация генов иммуноглобулинов
Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.