Method Article

Сочетание митотическая клеток синхронизации и конфокальная микроскопия высокого разрешения для изучения роли многофункциональный клеточного цикла белков во время митоза

DOI:

10.3791/56513

⸱

December 5th, 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для двойной тимидина синхронизации клеток HeLa, следуют анализ с использованием конфокальная микроскопия высокого разрешения. Этот метод является ключом к получению большое количество клеток, что синхронно с S-фазе митоза, позволяя исследования митотическая роли многофункциональный белков, которые также обладают функциями межфазной.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение различных нормативных событий в зависимости от фазы клеточного цикла обеспечивает четкое понимание о деление и рост клеток. Было установлено, что синхронизация клеточных популяций на определенных стадиях клеточного цикла будет весьма полезным в таких экспериментальных начинаниях. Над использованием фармакологических ингибирующих наркотиков для изучения событий последующего клеточного цикла и для получения конкретных обогащения отдельных этапов митотическая синхронизации клеток по обращению с химическими веществами, которые являются относительно менее токсичные может быть выгодным. Здесь мы описываем протокол для синхронизации клеток человека на разных этапах клетки цикла, включая как в S фаза и фаза M с блоком двойной тимидин и освободить процедуры для изучения функциональность митотическая белков в хромосоме выравнивания и сегрегации. Этот протокол был чрезвычайно полезным для изучения митотическая роли многофункциональный белков, которые обладают установленным межфазной функций. В нашем случае митотическая роль Cdt1, белок, критических для репликации происхождения лицензирования в фазе G1, могут изучаться эффективно только тогда, когда G2/M-конкретных Cdt1 может быть исчерпана. Мы описываем подробный протокол для истощения G2/M-конкретных Cdt1 с помощью двойной тимидина синхронизации. Мы также объяснить протокол фиксации клеток и живой клетки изображений с помощью конфокальная микроскопия высокого разрешения после выпуска тимидина. Этот метод также полезен для анализа функции митотическая белков как физиологические, так и возмущенных условиях как для Hec1, компонент Ndc80 комплекс, поскольку он позволяет получить большой выборки митотическая клеток для фиксированной и живой клетки анализ как мы показываем здесь.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В клеточный цикл клетки проходят серию жестко регулируемых и височно контролируемых событий для точного дублирования их геном и распространения. В млекопитающих клеточный цикл состоит из межфазной и M-фазы. В интерфазе, который состоит из трех этапов - G1, S, и G2, ячейка дублирует его генома и подвергается роста, который необходим для нормального клеточного цикла прогрессии1,2. В M-фаза, которая состоит из цитокинез и митоз (профаза, Прометафаза, метафаза, анафазе и Телофаза), родительские ячейки производит две генетически идентичных клеток дочи. В митозе, сестра chromatids дублированный генома, конденсированной (профаза) и на их kinetochores, захвачен микротрубочек собрал митотического веретена (Прометафаза), что заставляет их выравнивание на пластину метафазы (метафаза), следуют их равных сегрегации, когда сестра chromatids Сплит сторону и перевезены в противоположный шпиндель мачты (анафазе). 2 клетки дочи физически отделены деятельности на основе актина сократительной кольца (Телофаза и цитокинез). Кинетохор — это специализированный белковых структура, которая собирает в регионе прицентромерного chromatids и служить в качестве вложения сайты для шпинделя микротрубочек. Его основная функция заключается в диск хромосома захвата, выравнивание и помощь в коррекции неправильного шпинделя микротрубочек вложения, при посреднической шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт сохранить верность хромосома сегрегации3,4.

Метод синхронизации клетки служит идеальным инструментом для понимания молекулярных и структурных мероприятий, участвующих в прогрессии клеточного цикла. Этот подход использовался для обогащения клеточных популяций на конкретных этапах для различных видов анализа, включая профилирование экспрессии генов, анализ клеточных биохимических процессов и выявления локализации внутриклеточных белков. Синхронизированные mammalian клеток может использоваться не только для изучения отдельных генов продуктов, но и для подходов, включающих анализ всего геномов, включая анализ microarray ген выражение5, Мирна выражение модели6, Переводческая правила7и протеомного анализа белка модификации8. Синхронизации может также использоваться для изучения последствий экспрессии генов и белков нокдаун или нокаут-, или химических веществ на клеточный цикл прогрессии.

Клетки могут быть синхронизированы на различных стадиях клеточного цикла. Физические и химические методы широко используется для синхронизации клеток. Наиболее важными критериями для синхронизации клеток являются, что синхронизация должна быть noncytotoxic и обратимым. Ввиду возможных негативных последствий сотовой синхронизации клетки фармакологическими агентами химико зависимые методы может быть выгодным для изучения ключевых клеточного цикла событий. К примеру гидроксимочевина, amphidicolin, mimosine и Ловастатин, может использоваться для синхронизации клеток в фазе G1/S но, из-за их влияния на биохимические пути, который они подавляют, они активировать клеточный цикл контрольно-пропускной пункт механизмов и убить является важным часть клетки9,10. С другой стороны обратной связи торможение репликации ДНК, добавив тимидина к росту СМИ, известный как «тимидина блок», могут арестовать клеточного цикла в определенные точки11,12,13. Клетки также могут быть синхронизированы на этапе G2/M, рассматривая с Нокодазол и RO-33069,14. Нокодазол, который предотвращает сборки микротрубочек, имеет относительно высокий цитотоксичности. Кроме того арестован Нокодазол клетки могут вернуться к межфазное благосклонностью, митотическая проскальзывания. Двойной тимидина блок арест клетки в фазе G1/S и после выхода из блока, клетки находятся синхронно продолжить через G2 и в митозе. Обычной прогрессии клеточного цикла для ячеек, освобождены от тимидина блока можно наблюдать под конфокальная микроскопия высокого разрешения ячейки фиксации или живой изображений. Эффект возмущений митотическая белков могут быть изучены, специально когда клетки ввести и перейти через митоз после освобождения от двойной тимидина блока. Cdt1, многофункциональный белков, участвует в ДНК репликации лицензирования происхождения в фазе G1 и требуется также для Кинетохор микротрубочки вложений во время митоза15. Чтобы изучить функции Cdt1 во время митоза, необходимо принять метод, который позволяет избежать эффекта его истощения на репликации лицензирования во время фазы G1, хотя в то же время осуществление его истощении, специально во время фазы G2/М только. Здесь мы представляем подробные протоколы, основанные на блоке двойной тимидина изучение митотического роль белков, выполняет несколько функций в различных стадиях клеточного цикла, как фиксированной, так и клеток изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. двойной блок тимидин и выпуска: Подготовка реагента

  1. Сделать 500 мл Дульбекко изменения среднего среднего (DMEM) орел с 10% FBS, пенициллина и стрептомицина.
  2. Сделать 100 мм запас тимидин в стерильной водой и хранить в аликвоты-80 ° c.

2. протокол для фиксированной ячейки изображений митотическая прогрессии (рис. 1A)

  1. День 1, семя ~ 2 x 105 НеЬа клетки в скважины 6-ну пластины с крышки выскальзования (стерилизованное с 70% этанола и УФ-облучения) и 2 мл DMEM среды. Рост клеток в увлажненные инкубатор для 24 ч при 37 ° C и 5% CO2.
  2. 1st тимидина блок: на 2 день, тщательно смешать необходимое количество тимидин в свежих DMEM СМИ (100 мм штока, 2 mM концентрации выпускных экзаменов).
  3. Добавить 2 мл, содержащих тимидина СМИ для ячеек в каждой скважине 6-ну пластины и проинкубируйте 18 h.
  4. На третий день аспирационная среднего и вымыть клетки дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM; рост клеток в свежих подогретую среде DMEM для 9 h освободить клетки от блока.
  5. блок тимидина 2nd : снова добавить 2 мл, содержащих тимидина СМИ (2 mM концентрации выпускных экзаменов) в ячейки в каждой скважине пластину 6-хорошо.
  6. Инкубируйте еще 18 h.
  7. На 4 день аспирационная среднего и вымыть клетки дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM.
  8. Разбавить малые интерферирующие РНК (контроль и Cdt1) и трансфекции реагента в сыворотке свободный рост среднего отдельно на 10 мин смешать их вместе и проинкубируйте втечение 20 мин на RT. Конечная концентрация siRNA, используемых в каждом transfection была 100 Нм. Добавьте смесь реакции клетки, которые были вымыты из тимидина.
  9. Инкубировать клетки при 37 ° C для 9-10 ч для освобождения от блокирования и исправить клетки на обложке скользит с 4% PFA для 20 мин на RT.
    Предупреждение: PFA токсичных, носить соответствующую защиту.
  10. Имунноконтраст клетки, после permeabilizing с 0,5% (v/v) моющее средство для 10 мин на RT и мойки клетки дважды с ПБС втечение 5 мин.
    1. Заблокировать ячейки с 1% BSA (w/v) в ПБС за 1 час на RT, следуют лечении клетки с 50 мкл первичного антитела (антитела анти α-тубулина мыши разводят 1:1, 000, кролик антитела анти Zwint1 разводят в 1: 400 и мыши, анти фосфо ɣ H2AX разводят в 1: 300) в 1% (w/v) BSA в однократном ПБС втечение 1 ч при 37 oC.
    2. После мытья вне клетки с ПБС трижды, лечить клетки с 50 мкл вторичных антител для каждого покрытия стекла (Alexa 488 и родамин красный в разведениях 1: 250 в 1% (w/v) BSA в ПБС) за 1 ч на RT.
    3. После мытья клетки с ПБС дважды за 5 мин, лечить клетки с DAPI (0.1µg / мл в однократном ПБС) за 5 мин на RT.
    4. После мытья клетки с ПБС дважды за 5 мин, поместите крышку скольжения, стоящих перед клетки в соответствующие крепления СМИ на слайде ясно микроскопические.
  11. Монтированным клетки для immunostained белки с 60 X или 100 X 1.4 NA план-Apochromatic ДВС масло погружения цель на Перевернутый высоким разрешением Конфокальный микроскоп, оснащенный соответствующей камерой как необходимые для качества изображения требуется.
  12. Получение изображений при комнатной температуре, как z стеки толщиной 0,2 мкм, используя программное обеспечение подходит для микроскопа.

3. протокол для живых клеток изображений митотическая прогрессии (рис. 3A)

  1. На 1 день семян около 0,5-1 х 105 НеЬа клетки стабильно выражения mCherry-H2B и GFP-α-тубулина (слегка переменная на основе типа клеток и белков, которые они выражают) в 35 мм стекла дно блюда с 1,5 мл DMEM среды и вырастить их в увлажненный Инкубатор для 24 h на 37 oC и 5% CO2.
  2. 1st тимидина блок: на 2 день, добавить 1,5 мл тимидин содержащих СМИ к ячейкам в блюдо (тимидина 100 мм, 2 mM концентрации выпускных экзаменов,).
  3. Инкубируйте 18 h.
  4. На 3 день аспирационная носитель, содержащий тимидин и вымыть клетки трижды, дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM.
  5. Разбавить малые интерферирующие РНК (контроль и Hec1) и трансфекции реагента с сыворотка свободный рост среднего отдельно на 10 мин смешать их вместе и проинкубируйте втечение 20 мин на RT. Конечная концентрация siRNA, используемых в каждом transfection была 100 Нм. Добавьте смесь реакции клетки, которые были вымыты из тимидина.
  6. Рост клеток в 1,5 мл свежего подогретую DMEM среды для 8 h освободить клетки от блока.
  7. блок тимидина 2nd : добавить 1,5 мл тимидин содержащих СМИ (2 mM концентрации выпускных экзаменов) в ячейки в блюдо.
  8. Инкубируйте еще 18 h.
  9. На 4 день аспирационная среднего и вымыть клетки трижды, дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM. Затем рост клеток в свежих подогретую Лейбовиц (L-15) средний дополнена 10% FBS и 20 мм HEPES при pH 7.0 для 8 h освободить клетки от блока.
  10. Поместите блюдо в камере контроля температуры в Конфокальный микроскоп высокого разрешения, который уже перешел на по крайней мере 30 минут до начала изображений для стабилизации температуры на сцене и экспериментальных.
  11. Фокус в светлые области с 60 x целей до тех пор, пока клетки являются видимыми, а затем вручную просеять на сцене в область выбора.
  12. Настройка света и мощности лазерного воздействия, параметров получения изображений и продолжительность эксперимента с использованием программного обеспечения приобретения изображения микроскопа выбора. Используйте фильтры для GFP (488 возбуждения; 385 Нм выбросов) и mCherry (561 Нм возбуждения и 385 Нм выбросов) для получения изображений.
  13. Выполнять покадровый эксперимент, отдельно приобретать импульсного света и флуоресценции изображения каждые 10 мин на период до 16 ч.
  14. Получение изображений, как двенадцать 1.0 мкм отделенный z самолеты в 9 ч после освобождения от двойной тимидина блока с помощью программного обеспечения необходимости микроскоп.
  15. Анализ изображений, отслеживание отдельных ячеек для митотическая прогрессии и окончательно собрать соответствующие фильм с исходным кодом Фиджи/ImageJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение митотического прогрессии и стабильности микротрубочек в клетках исправлена после освобождения от двойной тимидина блок
Cdt1 участвует в лицензировании происхождение репликации ДНК в фазе G1. Он разлагается во время фазы S, но повторно накапливается в фазе G2/М. Для изучения его роль в митозе, эндогенного Cdt1 необходимо истощены специально на этапе Г/М, методом, наиболее подходящим клеток синхронизации, двойной тимидина блока15. Клетки ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важным преимуществом двойной тимидина синхронизации является, что она обеспечивает увеличения размера выборки митотическая клеток в окне короткое время со многими из этих клеток, введя митоз в унисон, позволяя также анализ хромосом выравнивание, биполярный шпинделя формирования и хромосомы сегрегации с гораздо более высокой эффективности.

Многие нормативные белковых комплексов и сигнальных путей посвящены обеспечению нормальных прогрессии через митоз и дерегулирование этого процесса м...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие финансового интереса.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны д-р Козо Танака Университета Тохоку, Япония для обмена клетки HeLa, стабильно выражая гистона mCherry H2B и GFP-α-тубулина. Эта работа была поддержку NCI Грант для DV (R00CA178188) и начальных средств от северо-западного университета.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (1x)Life Technologies11965-092Магазин по адресу 4 ° C
DPBS (1x)Life Technologies14190-144Склад в 4 ° К.
Лейбовиц s (1x) L-15 среднийLife Technologies21083-027Магазин в 4 ° C
Сыворотка с пониженным содержанием (Opti-MEM)Life Technologies319-85-070Хранить при 4 градусах; C
Пенициллин и стрептомицинLife Technologies15070-063 (Pen Strep)1:1,000 разведение
Dharmafect2GE DharmaconT-2002-02Хранить при 4 ° C
ТимидинMP Biomedicals LLC103056Растворен в стерильной дистиллированной воде
Cdt1 siRNALife TechnologiesRef 10
Hec1 siRNALife TechnologiesRef 13
Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-H2B
HeLa-клетки, экспрессирующие GFP-&альфа;-тубулин и mCherry H2BЩедрый подарок от доктора Кодзо Танака из Тохоку университет, Япония
Раствор формальдегидаSigma-Aldrich CorporationF8775Токсичный, требуется осторожность
DAPISigma-Aldrich CorporationD9542Токсичный, требуется осторожность
Мышиный анти-α-тубулинSanta Cruz BiotechnologySc322931:1,000 разведение
Кролик муравей-Zwint1BethylA300-781Aразведение 1:400
Мышиный антифосфо- и гамма; H2AX (Ser139)Upstate Biotechnology05-626, клон JBW3011:300 разведение
Alexa 488Jackson ImmunoResearch1:250 разведение
Rodamine Red-XJackson ImmunoResearch1:250 разведение
BioLite 6 лунок мультидиверсThermo Fisher Scientific130184
35 мм Стеклянное дно тарелкиMatTek CorporationP35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE инвертированный микроскопNikon Instruments
Вращающийся диск для конфокальногоYokagawaCSU-X1
Ultra 888 EM-CCD ФотоаппаратAndoriXon Ultra EMCCD
4 длины волны лазерAgilent Technologies
Инкубационная система для микроскоповTokai HitTIZB
Программное обеспечение NIS-elementsот Nikon Instruments

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitotic Cell SynchronizationHigh Resolution Confocal MicroscopyDouble Thymidine BlockCell Cycle AnalysisMitotic Protein FunctionChromosome Alignment SegregationCdt1 Depletion ProtocolHec1 Kinetochore AnalysisLive Cell ImagingFixed Cell Analysis

Related Articles