Методическая статья

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

DOI:

10.3791/56514

⸱

25 октября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, University of Cologne, 2Cologne Cluster of Excellence in Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем здесь простой и быстрый метод для изоляции Salmonella typhimurium-содержащих phagosomes от макрофагов, покрывая бактерий с биотина и стрептавидина.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сальмонеллы typhimurium является факультативной внутриклеточных бактерия, которая вызывает гастроэнтерит у людей. После вторжения lamina propria, S. typhimurium бактерии быстро обнаруживаются и фагоцитированных макрофагами и содержащиеся в везикулы, известный как phagosomes для того чтобы быть понижена. Изоляция S. typhimurium-содержащих phagosomes широко использовался для изучения как S. typhimurium инфекции изменяет процесс созревания фагосомы для предотвращения бактериального деградации. Классически, изоляции бактерий содержащих phagosomes была выполнена, сахароза градиентного центрифугирования. Однако этот процесс занимает много времени и требует специализированного оборудования и определенная степень ловкости. Описанные здесь — это простой и быстрый метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes от макрофагов, покрывая бактерий с биотина стрептавидина конъюгированных магнитные бусы. Phagosomes, полученные этим методом может быть приостановлено в любом буфере выбор, позволяя использование изолированных phagosomes для широкого спектра анализов, таких, как анализ белков, метаболит и липидов. В целом, этот метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes конкретных, эффективных, быстрых, требует минимального оборудования и более универсальным, чем классический метод изоляции, сахароза градиент ultracentrifugation.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги являются циркулирующие специализированных фагоцитирующих клеток, которые обнаружить, поглотит и ухудшить любые иностранные частиц, присутствующих в периферических тканях, начиная от apoptotic клеток до вторжения микроорганизмов, таких как бактерии. После поверхности рецептор опосредованный признания возбудителя определенных маркеров обычно присутствует на поверхности микроорганизмов (известный как патоген связанные молекулярные структуры или PAMPs) макрофаги инициировать сложный реорганизации клеточной мембраны в для того, чтобы окружить и фагоцитируют возбудителя1.

Охватившего патогена, затем содержится макрофагов в внутриклеточного везикул, известный как фагосомы. Через серию слияние и деление события с другими везикулы, таких как endosomes и лизосом возбудитель содержащих фагосомы приобретает набор белков, необходимых для ликвидации phagosomal содержание. Таким образом в ходе этого процесса, известный как фагосомы созревания2состав ферментативных фагосомы крайне непостоянны.

Вскоре после фагоцитоза, multimeric, которую комплекс вакуолярной АТФаза (v АТФаза) включена в мембране фагосомы сплавливанием с endosomes3. Этот комплекс использует АТФ для перекачки протонов от цитозоль для люмен фагосомы4. Подкисление фагосомы имеет важное значение для события слияния с другими везикулы5 и для активации большое количество рН зависимых ферментов и деструктивные6. Другой multimeric энзимный комплекс, который быстро собрал на мембране фагосомы представляет собой комплекс NADPH-оксидазы (NOX). NOX комплекс окисляет NADPH произвести реактивнооксигенных видов (ров), выделяется в просвете фагосомы и что существенный вклад в убийстве охватившего микроорганизмов7.

На первоначальных этапах созревания phagosomes настоящее время маркеры обычно как Rab5 и Rab7 раннего и позднего endosomes соответственно наряду с Субблок0 V v АТФазы8. Слияние phagosomes с лизосом и позднего endosomes приводит к подверженности самые разнообразные гидролитические ферменты, такие как катепсин протеаз, липазы и β-галактозидазы9фагоцитированных возбудителя. Подкисление просвета также необходим для активации этих ферментов. Например расщепление катепсина Д производить активный короткая форма-рН зависимых10. Эти ферменты ухудшить возбудителя и посредником производства возбудителя производные короткие пептиды, которые представлены макрофагов гистосовместимости комплекс (MHC) класса II молекул клеток T, чтобы инициировать адаптивного иммунного ответа11.

Следовательно фагосомы созревания имеет решающее значение для врожденный иммунный ответ и связывает врожденного и адаптивного герб иммунной системы. Это не удивительно, что патогенные организмы развивались стратегии преодоления ликвидации макрофагами через описанные выше процесс созревания фагосомы. Например внутриклеточных бактерий микобактерии туберкулеза и Legionella pneumophila предотвратить созревание фагосомы ингибирующих v АТФазы Ассамблеей и последующего люмен подкисления12,13 . Другие бактерии, такие как Listeria monocytogenes или шигеллам Флекснера побудить порообразования в мембране фагосомы бежать в цитозоль14,15. С другой стороны, Salmonella enterica серовар typhimurium (S. typhimurium) имеет возможность изменить свойства фагосомы в вакуоль превратить его в подходящее место для его репликации16. Эта способность делает S. typhimurium очень интересная модель для изучения возбудителя опосредованной вмешательства фагосомы созревания.

S. typhimurium является факультативной внутриклеточных бактерия, которая вызывает гастроэнтерит у людей. После вторжения lamina propria, S. Typhimurium бактерии быстро обнаруживаются и фагоцитированных макрофагами и содержащихся в phagosomes17. В некоторых докладах ранее описал что S. typhimurium-содержащих phagosomes настоящее время производители для endosomes и лизосом18, и другие исследования обнаружили фагосомы Лизосома фьюжн, предотвратить после S. Typhimurium инфекции19.

Первоначально фагосомы созревания на S. typhimurium инфекции были расследованы иммунофлуоресценции. Разработка методов для изоляции бактерий содержащих phagosomes включено более точное исследование содержания фагосомы с точки зрения endosome и лизосомальных маркеров. На сегодняшний день, основной метод, используемый для изоляции бактерий содержащих phagosomes является субцеллюлярные фракционирование сахарозы шаг градиенты18,20. Однако этот метод требует несколько шагов центрифугирования, которые могут вызвать механические повреждения phagosomes, может повлиять на стабильность phagosomal компонентов (белков и липидов) и отнимает много времени. Кроме того, он требует использования ультрацентрифуга: кусок специализированного оборудования, который не доступен для каждой лаборатории.

Недавно, новый подход был применен к изоляции бактериальных содержащих phagosomes, в которых бактериальных патогенов помечены с биотинилированным lipopetide (Lipobiotin) и впоследствии извлечены с помощью конъюгированных стрептавидина магнитные бусы21 . Мы предлагаем альтернативный дополнительный метод, снабдив бактериального поверхности Амин содержащих макромолекул с ГСЗ-биотин следуют конъюгированных стрептавидина магнитные шарики. Phagosomes, полученные этим методом сильно обогащенный в endosome и лизосомальных маркеры и может быть использован для широкий спектр анализов, от анализа белка омику анализа. Кроме того она не требует специализированного оборудования, такого как Ультрацентрифуги. Кроме того устраняя шаги центрифугирования, механические повреждения phagosomes и количество времени, занятых значительно сокращаются. Этот метод может быть легко адаптирована для изоляции phagosomes, содержащие другие бактерии, такие как грамположительных Staphylococcus aureus, также включены в этой рукописи. В целом, этот метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes является простым, экономически эффективным, и меньше времени чем классической изоляции, сахароза градиент ultracentrifugation, оказание высоко обогащенного бактерий содержащих phagosomes.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

все шаги, связанные с применением патогенных S. typhimurium должны осуществляться в BSL-2 или выше учреждения уровня биологической безопасности. Культура и покрытие S. Typhimurium, а также инфекции костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) должны быть выполнены под Ламинарный шкаф для предотвращения загрязнения. Изоляция S. typhimurium-содержащих phagosomes может быть выполнена на любой стенде лаборатории BSL-2.

Извлечение костного мозга от мышей для дифференциации в макрофаги была выполнена в соответствии с институциональных руководящих принципов на благосостояние животных и утверждена Северный Рейн-Вестфалия государственного агентства охраны природы, Окружающей среды и защиты прав потребителей [шведским für натур, Umwelt и Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Файла без: 84-02.05.40.14.082 и 84-02.04.2015.A443] и Кёльнского университета.

1. S. typhimurium Culturing

  1. Inoculate S. typhimurium (Штамм SL1344) из одного бактериальные колонии в 5 мл мозга сердце инфузии (BHI) бульон с помощью бактериальных цикла.
  2. Инкубировать бактериальных подвеска в инкубаторе при 37 ° C ночь встряхивании.
  3. На следующий день, передача 1 мл суспензии бактерий в 19 мл бульона BHI в коническую колбу и инкубировать при 37 ° C в инкубаторе встряхивании.
  4. Мониторинг S. typhimurium роста путем измерения оптической плотности (OD) на 600 Нм (600 OD) с спектрофотометром. Измерения должны быть проведены примерно каждые 30 мин
  5. Когда ОД 600 достигает 1,0, удалить бактериальный подвеска из инкубатора и передачи в Тюбик 50 мл. Центрифуга бактерий на 5400 x g 15 мин на 4 ° C.
  6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте в 10 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS).
  7. Центрифуга на 5400 x g 15 мин при 4 ° C.
  8. Удалить супернатант и Ресуспензируйте бактерий в 4,9 мл стерильного PBS.

2. Покрытие из S. typhimurium с ГСЗ-биотин/стрептавидина конъюгированных магнитные бусы

  1. Добавить 100 мкл 10 мг/мл биотина увязки решения (ГСЗ-биотин растворяют в диметилсульфоксида, ДМСО) свежеприготовленные, к бактериальной подвеска подготовлено на предыдущем шаге. Например разбавьте 5 мг биотина ГСЗ в 0,5 мл стерильного ДМСО. Mix правильно, закупорить вверх и вниз несколько раз.
  2. Разделить смесь в пяти 1.5 мл пробирок.
  3. Инкубировать втечение 2 ч при комнатной температуре (RT) на thermoblock с постоянной тряски на 350 об/мин.
  4. Центрифуга трубы на 15000 x g 10 мин на RT и удалить супернатант.
  5. Ресуспензируйте в 1 мл стерильного PBS, центрифуги на 15000 x g 10 мин на RT и удалить супернатант.
  6. Повторите шаг 2,5 еще два раза, чтобы полностью удалить избыток биотина, связывание решение.
  7. После последнего мыть, Ресуспензируйте гранулы в 1 мл стерильного PBS.
  8. Перевести 100 мкл решения стрептавидина конъюгированных магнитной бусины 10 мг/мл в 1,5 мл трубку и оставить его на магнитные стойки для 5 минут
  9. Удаление растворителя с пипеткой, взять магнитные бусы решения стрептавидина-конъюгированных от магнитные стойки и Ресуспензируйте с 1 мл суспензии покрытием бактериальные биотина, подготовленную на этапе 2.7.
  10. Инкубировать 1 час на RT на thermoblock с постоянной тряски на 350 об/мин.
  11. Место решение на магнитные стойки; подождите 5 минут и затем удалить с пипеткой бактерии, которые не придерживались на стену (держать его в пробирку, помечены как "-покрытием бактерии "). Фракция, придерживаясь стенке трубки при контакте с магнит это биотина/стрептавидина покрытием бактерии.
  12. Снять трубку, содержащую помеченные бактерий из магнитные стойки и Ресуспензируйте в 1 мл стерильного PBS.
  13. Поместить его снова на магнитные стойки, подождите 5 минут и использовать пипетку, чтобы удалить PBS.
  14. Повторите шаги 2.13 и 2.14 еще два раза, чтобы удалить все бактерии, которые не покрыты конъюгированных стрептавидина магнитные бусы.
  15. После последнего мыть, Ресуспензируйте покрытием бактерии в 500 мкл стерильных PBS и этикетке трубки как " покрытием бактерий ".
  16. Количество колонии, образуя единиц (cfu) оба "-покрытием бактерии " и " покрытием бактерии " решения покрытие серийных разведений на плитах агара BHI. Приблизительно 2 x 10 8 кое/мл покрытием бактерий получены из 20 мл первоначальных бактериальных подвеска с ОД 600 1.0. Держите покрытием бактериальные подвеска на 4 ° C для использования на следующий день заразить макрофагов.

3. Инфекция BDMDs

  1. в тот же день, когда бактерии покрыты биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы, пластина полностью дифференцированной BMDMs 22 блюдах 6 см на плотности тарелок 5 x 10 6 клеток за блюдо.
  2. На следующий день, центрифуга с покрытием бактериальные подвеска на 15000 x g 5 мин на 4 ° C.
  3. Удалить супернатант и Ресуспензируйте в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среде с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в концентрации 10 х 10 6 кое/мл.
  4. Заразить макрофагов в разносторонности инфекции (МВД) 10, удалите средство от BMDMs и добавьте 5 мл суспензии с покрытием бактериальные подготовлен. Оптимальное MOI может определяться для каждого типа клеток или экспериментальной целью изолированные phagosomes.
  5. Инкубировать в РТ за 10 мин для синхронизации фагоцитоза.
  6. Инкубировать при 37 ° C в 5% CO 2 инкубатора для 30 минут, чтобы инициировать фагоцитоза. Другие типы клеток может потребовать различных инкубации раз обеспечить интернализацию бактерий.
  7. Удалить бактерии содержащих среды из блюд и вымыть клетки с RPMI три раза, чтобы удалить бактерии, не учитываются.
  8. Наконец добавляют 10 мл RPMI, содержащие 10% FBS и гентамицина 50 мкг/мл, убить любого не фагоцитированных бактерии.
  9. Инкубировать зараженных BMDMs при 37 ° C с 5% CO 2, до тех пор, пока указать желаемое время. Желаемое время точка экспериментально должна определяться согласно бактерии и используемый тип ячейки и цель анализа. Для изучения ранних фагосомы endosome фьюжн события в S. Typhimurium инфицированных BMDMs, 30 минут инкубации рекомендуется. Для анализа последующих событий phagosomes могут быть извлечены после 2 ч или 4 ч инкубации. Длительный инкубационный макрофагов с S. Typhimurium за 24 часа приводит к смерти макрофаги. Расширенные внутриклеточную инфекцию до извлечения фагосомы вероятно может привести к деградации молекул биотин. Однако, мы не наблюдали потери биотина на покрытием бактерии до 24 ч.

4. Изоляция S. typhimurium-содержащих Phagosomes

  1. подготовить объем требуемых фагосомы изоляции буфера (50 мм трубы, pH.7, 5 мм EGTA мм MgCl 2, 50), добавив Дитиотреитол (DTT) до конечной концентрации 1 мм, B Cytochalasin к окончательному концентрация 10 мкм и протеазы и фосфатазы ингибиторов как рекомендованный производителем.
    Примечание: DTT и Cytochalasin B должны быть добавлены в буфер изоляции фагосомы A всегда непосредственно перед употреблением. Cytochalasin B разрушает цитоскелета, содействие разрыв мембраны клетки.
  2. В нужный момент точки, удалите средство от инфицированных клеток и промыть стерильной PBS, утепленные RT.
  3. Добавить 750 мкл phagosome изоляция буфер A за блюдо и инкубировать 20 мин на льду. При использовании числа различных клеток, объем буфера изоляции A следует пропорционально скорректирована.
  4. Добавить 250 мкл фагосомы изоляции буфера B (трубы 50 мм, pH.7, 50 мм MgCl 2, 5 мм EGTA, 220 мм маннит и 68 мм сахароза). Рок пластину для обеспечения что буфер достигает полной поверхности блюдо. При использовании числа различных клеток, объем буфера изоляции B следует пропорционально скорректирована.
  5. Удалить ячейки из блюдо, нежно соскоб с помощью резиновыми полицейский и передавать их на предварительно охлажденные 1,5 мл.
    6. Суспензию клеток
  6. пройти 26G иглы с помощью 1 мл шприца по крайней мере 15 раз (один стремление плюс один выброса клеток подвеска как один раз). Это достаточно, чтобы освободить цитозольной содержание BMDMs. Количество проходов через иглы должны быть оптимизированы для каждого типа клеток.
  7. Место суспензию клеток на магнитные стойки и подождать 5 мин. Частицы, прилагается к магниту, phagosomes, содержащие покрытием - S. Typhimurium. Суспензии содержит остальная часть клетчатых компонентов.
  8. Передачи подвеска в 1,5 мл трубку, помечены как " цитозоль ".
  9. Снять трубку с изолированной phagosomes из магнитные стойки и Ресуспензируйте их в 1 мл стерильного PBS.
  10. Место фагосомы подвеска на магнитные стойки, подождите 5 минут и удалите PBS.
  11. Повторите шаги 4.9 и 4.10 мыть изолированных S. typhimurium-содержащих phagosomes.
  12. Наконец удалить PBS и Ресуспензируйте phagosomes в буфере необходимые; например, в radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфер для анализа белка. Приблизительно 50-200 мкг белка получается на сэмпл после этого протокола, в зависимости от начального количества клеток и МВД инфекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изоляция бактерий содержащих phagosomes этот протокол требует biotinylation бактерий в качестве первого шага. Поэтому мы провели оценку эффективности S. typhimurium biotinylation конфокальная микроскопия анализ BMDMs, инфицированных биотинилированным mCherry -S. typhimurium помечены Cy5-стрептавидина. Вкратце BMDMs были инфицированы, как описано в этом протоколе с mCherry -S. typhimurium ранее биотинилированным но не инкубировали с кон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Новый метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes, покрывая бактерий с биотина и конъюгированных стрептавидина магнитные бусы описано здесь. После нежный нарушения клеточной мембраны бактерии содержащих phagosomes могут быть легко извлечены с помощью магнитной стойке. Мы показывают, что маркировка бактерий сохраняет возбудителя способность вызвать воспаление и не изменяет свойство фагоцитарной принимающей ячейки. Важно отметить, что phagosomes, полученные этим методом обогащаются в бактериях...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования в лаборатории Робинсон поддерживается финансирование из Кельна Excellence кластера на клеточных реакций стресс в Aging-Associated заболеваниях, Кёльнского университета, Германия (CECAD; финансируемых DFG в рамках инициативы превосходство немецкого федерального и Государственный правительства) и гранты от Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune и Мария-Pesch фонд университета Кельна, Германия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
EZ-Link NHS BiotinThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
PIPESCarl Roth9156.2
MgCl2CarlRothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SucroseCarl Roth4621.1
МаннитКарл Рот4175.1
DTTSigma43816
Остановить коктейль ингибиторов протеазы и фосфатазыThermo Fisher Scientific1861280
Цитохалазин BSigmaC6762
DYNAL или DynaMagМагнит Thermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 СпектрофотометрBio-Rad170-2501
Бактериальная петля (10&микро; l)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Институт Лейбница DSMZ-Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-стрептавидинInvitrogenSA1011
анти-бета-актиновые антителаSanta Cruz Biotechnologysc-47778
антитело против mCherryThermo Fisher ScientificPA5-34974
антитело против Rab5Santa Cruz Biotechnologysc-46692
антитело против Rab7Santa Cruz Biotechnologysc-10764
антитело против v-ATPase (V0)Santa CruzBiotechnology sc-28801
антитело против v-АТФазы (V1)Santa Cruz Biotechnologysc-20943
антитело против катепсина D SantaCruz Biotechnologysc-6486
антитело против Tomm20Santa Cruz Biotechnologysc-17764
антитело против кальнексинаSanta Cruz Biotechnologysc-46669
антитело против GAPDHSanta Cruz BiotechnologyСК-20357

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
  3. Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758(2008).
  4. Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
  5. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
  6. Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
  7. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
  8. Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
  9. Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
  10. Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
  11. Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
  12. Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
  13. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
  14. Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
  15. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  16. Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
  17. Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
  18. Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
  19. Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
  20. Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
  21. Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
  22. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  23. Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
  24. Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
  25. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  26. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  27. Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
  28. Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Salmonella

Похожие статьи