Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Этот метод позволяет селективного окрашивания и количественного определения ДНК в гелях путем замачивания геля в зеленом SYBR я / нитро синий Tetrazolium решения и затем подвергая его солнечного света или синий источник света. Это создает видимый преципитат и почти не требует оборудования, что делает его идеальным для использования на местах.

Abstract

ДНК пятная методы очень важны для биомедицинских исследований. Мы разработали простой метод, который позволяет визуализировать ДНК невооруженным глазом формирование цветные преципитат. Она работает путем замачивания акриламида или агарозы дна гель в растворе 1 x (эквивалент 2,0 мкм) SYBR зеленый я (SG я) и 0,20 мм нитро синий tetrazolium, которая производит фиолетовый осадка из Формазаны при воздействии солнечного света или специально синий свет. Кроме того восстановление ДНК были проведены с использованием ампициллина устойчивостью плазмида в агарозном геле, окрашенных с нашим методом. Большее количество колоний был получен с нашим методом чем с традиционными окрашивание с помощью SG я с ультрафиолетовым освещением. Описан метод быстро, конкретные и нетоксичные для обнаружения ДНК, позволяя визуализации биомолекул «невооруженным глазом» без transilluminator и недорогой и подходит для использования в полевых. По этим причинам наши новые ДНК, окрашивание метод имеет потенциальные выгоды для научных исследований и промышленности.

Introduction

С достижениями в биохимии и молекулярной биологии исследования, с участием ДНК требуют более совершенных методов для анализа ДНК. Первый метод для окрашивания ДНК был серебряный пятнать, который очень чувствителен, но не хватает избирательности и не позволяют пример восстановления. Позже развитие флуоресцентные окрашивание ДНК допускается селективный количественного определения ДНК с возможностью восстановления образца. Одним из первых флуоресцентных красителей, используемых для количественного определения ДНК был бромид ethidium¹, который является мутагенным². Однако, теперь есть улучшение флуоресцентных красителей, которые являются более безопасным и более чувствительными, такие как GelRed и SYBR зеленый я (SG я)³; но все эти флуоресцентных красителей требуют использования ультрафиолетового (УФ) transilluminator или fluorimeter.

Существуют другие методы для пятнать заметно ДНК, например⁴ Метиленовый синий и фиолетовый кристалл^5,6,,78,9, но все они страдают от пониженную чувствительность и избирательность. Tetrazolium соли органических соединений восприимчивы к сокращению и когда это происходит, они образуют нерастворимые и цветные Формазаны осадок^10,11. Недавно было показано некоторые соли двухвалентной tetrazolium связываются с ДНК из-за их позитивные tetrazolium кольца¹².

В недавней публикации¹³была предложена новая техника видимых пятен и количественного анализа ДНК в полиакриламидных гелей, используя сокращение соли двухвалентной tetrazolium под названием nitro синий tetrazolium (NBT) и флуоресцентных красителей как бромид ethidium, GelRed, SYBR зеленый, я и SYBR золото. Эта реакция работал в присутствии синий свет или солнечного света и позволило пример восстановления с улучшенным качеством по сравнению с использованием SG я с УФ transilluminator. Цель настоящего документа – представить подробный протокол окрашивание техники с использованием tetrazolium солей.

Protocol

1. Подготовка и запуск гель

1. Подготовьте гели Денатурирующий гель полиакриламида 12% с помощью рецепта натрия Додециловый сульфат-Полиакриламид-гель электрофореза (SDS-PAGE) в Sambrook и Рассел¹⁴ , но использование воды вместо SDS.
   1. Подготовить 5 мл решения гелем, используйте 1,7 мл дистиллированной воды, 2 мл акриламида/бис акриламида (30/0,8% w/v), 1,3 мл 1,5 М трис рН 8,8, 0,05 мл 10% Персульфат аммония и 0,002 мл TEMED.
   2. Для подготовки 2 мл штабелируя гель использовать 1,5 мл воды, 0,33 мл акриламида/бис акриламида (30/0,8% w/v), 0,25 мл 1 М трис рН 6,8, 0,02 мл 10% Персульфат аммония и 0,002 мл TEMED. Размеры геля являются 7.3 x 8.2 см x 0,075 см (l x w x d).
      Примечание: Расческой 15 хорошо толщиной 0,75 мм для лучших чувствительность.
2. Добавьте необходимое количество 6 x загрузки буфера и образец ДНК в 1,5 мл microcentrifuge трубку (например использование 1 мкл 6 x загрузки буфера 5 мкл пример ДНК).
3. Место в зале вертикального электрофореза геля.
   1. Заполните камеры с 750 мл 1 x TAE буфера для запуска 2 гели. Подготовить 1 Л 50 x TAE, 442 g Tris база, 57,1 мл уксусной кислоты кристаллизированной и 100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8. Долейте дестилированную воду до окончательного объемом 1 л.
   2. Загрузите образцы в геле. Побегите гель на 100 V 2 h.
4. Кроме того Подготовьте 1 x TAE агарозном геле с помощью рецепт в Sambrook¹⁴.
   1. Добавить 300 мл 1 x TAE в палату горизонтального электрофореза. Побегите гель для 45 мин на 100 V.

2. Национальный банк Таджикистана SG я окрашивание (рис. 1).

1. Пятнать геля акриламида.
   1. Подготовка решения: 0.1% w/v НБТ и 1.2 x SG я.
      Примечание: Это позволяет использовать бромид ethidium, GelRed и SYBR золото вместо SG я, но SG, я имел лучшую производительность.
   2. Налить 16,75 мл 1,2 x SYBR зеленый я решение в контейнер соответствующего размера.
      Примечание: Мы использовали крышку коробки наконечник пипетки как контейнер, и эти тома рассчитываются для покрытия гель, с помощью этого контейнера; его размеры составляют 11,6 х 7,6 см x 2,6 см (l x w x d).
   3. Поместите гель в решении. Добавить 3.25 мл 0,1% раствора НБТ w/v дать 0,2 мм НБТ и 1 x (эквивалент 2,0 мкм) SG я окончательного концентрации.
   4. Печать контейнер с пластиковой пленкой и полностью обернуть контейнер с алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать любой освещенности.
      Примечание: Пластиковой пленки используется для предотвращения разбрызгивания и избежать реакции алюминиевой фольги с окрашивание раствора.
   5. Трясти за 25 мин на орбитальный шейкер на 60 об/мин.
   6. Удалите, алюминиевые и пластиковые покрытия. Подвергайте воздействию солнечного света в течение 90 минут максимум. Проверяйте каждые 5 мин до тех пор, пока появится полоса интерес.
   7. Чтобы использовать синий свет, подготовить печатную с 3 светоизлучающие диоды (СИД) и поместите светодиоды около 5 мм от поверхности геля (проверьте окрашивание непрерывно, как время необходимо будет зависеть от интенсивности светодиодный источник света).
2. Гель агарозы пятная.
   1. После того, как подготовка и запуск агарозы 1% гель, как описано в разделах 1.4 (размеры являются 1 x 6,2 см x 7 cm; l x w x d), выполните те же действия, как и 2.1 с этими изменениями:
   2. Налить 41.9 мл 1,2 x SG я решение в крышке ящика наконечник пипетки; его размеры составляют 11,6 х 7,6 см x 2,6 см (l x w x d). Добавление 8.1 мл 0,1% раствора НБТ.
   3. Печать контейнер с пластиковой пленкой, а затем полностью обернуть контейнер с алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать любой освещенности.
   4. Трясти за 1 час на орбитальный шейкер на 60 об/мин.

3. анализ данных.

1. НБТ SG я калибровочных кривых.
   1. Получите гель изображения путем сканирования на 1200 dpi.
   2. Открытое программное обеспечение для анализа изображений. Выпрямление изображений с помощью редактора изображений. Запустите образ денситометрия.
   3. Вычислите площадь под кривой. Подготовьте график_Макс сигнал/сигнал против концентрации ДНК.

4. ДНК восстановления.

1. Подготовить гель агарозы 1% в 1 x TAE с помощью рецепт найден в Sambrook¹⁴.
2. Добавить 300 мл 1 x TAE в палату горизонтального электрофореза. Загрузка 4 µL 100 нг/мкл pDJ100¹⁵ плазмиды и лестница ДНК по схеме на рисунке 2. Побегите гель на 1 ч в 100 V.
3. Марк и весят 2 пробки microcentrifuge 2 мл.
4. Вырежьте гель посередине для того чтобы иметь две одинаковых половинки. Каждый из них должен содержать лестница и образец плазмида сравнить различные методы окраски. Схематическое представление находится на рисунке 2.
5. Выведение одной половины с НБТ-SG я как в шаге 2.
   1. Вырежьте плазмиды группы с помощью чистой скальпель. Сохраните часть геля в одной из труб и весят.
6. Пятно с другой частью гель с SG с 50 мл 1 x SG я решения и медленно взболтать (60 об/мин) гель для 1 h в темноте.
   1. Гель на transilluminator и выставить 2 мин вырезать из плазмиды группы с помощью чистой скальпель.
   2. Сохраните часть геля в другую трубу и весят.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, сохраняя трубы при-20 ° C.
7. Выполнения извлечения плазмида с помощью комплекта извлечения коммерческих гель.

5. плазмида нормализации.

1. В пробки microcentrifuge 1,5 мл добавьте 10 мкл извлеченные плазмиды и 60 мкл типа, которую я воды. Mix и передать Кюветы кварцевые 60 мкл или использовать 2 мкл непосредственно в Nanodrop.
2. Измерение спектров поглощения между 230-320 нм. Вычислите образца плазмида концентрации с использованием следующей формулы:
   
   где D — это применяется коэффициент разрежения (в данном случае это 70/10), А_x — поглощение x Нм, и 50 является коэффициент пересчета в мкг/мл для dsDNA.
3. Развести образцы 9.1 нг/мкл.
4. Трансформировать сведущие клетки Escherichia coli (E. coli) (например XL10 золото) после¹⁶ Иноуэ процедура преобразования с использованием 5 мкл разбавленного образца.
5. Подсчитать количество колоний на чашки Петри и отмечаем разрежения. Вычислить единиц образуя колонии (CFU) с следующие формулы¹⁷:
   
   где D — коэффициент разрежения, применяется от первоначальной культуры.
6. Выполните непарных t тест.

Representative Results

Discussion

Чувствительных и Роман окрашивания методом ДНК на основе сокращения НБТ и использование SG, в этой статье был представлен. Важным шагом в этом протоколе это время инкубации геля в НБТ-SG я решение и концентрация НБТ. Время окрашивания гелей агарозы дольше акриламида гели из-за большей толщины Гели агарозы. Этот метод не работает хорошо в присутствии SDS как НБТ осаждается в контакте с ним. Если гель получит Фиолетовый фон, мы рекомендуем подготовить другой гель и сократить время воздействия света. Если витражи геля агарозы и не является достаточно чувствительность, рекомендуется увеличить время воздействия света. Если есть отсутствие чувствительности и опалесцирующая преципитат присутствует в гель, это может быть результатом загрязнения SDS. В этом случае подготовить новый гель и промывать перед добавлением окрашивание реагентов.

Высыпание происходит путем синий свет освещение, поставляемые свет синий светодиод или синего света присутствует ли естественно в солнечном свете. В связи с этим ограничением методики является источником света. Если там нет источника света, синий источник света, и если источник света не является однородной, это не возможно сделать сравнение, и по той же причине, это не возможно сделать количественную оценку. Однако полученные результаты будет несколько зависит от источника света используется. Если источник света не соответствует или uniform (например из-за изменений в интенсивности солнечного света в течение дня или неоднородность синий источник света), это будет более трудно прямых сравнений или количественной оценки различных образцов на различных уровнях раз.

Этот метод не нужно специального инструментария визуализировать ДНК, что делает его идеальным для использования на местах. Для количественные результаты можно использовать с высоким разрешением камеры или сканера office, как показано в этой работе.

Мы надеемся расширить эту технику в будущем, возможно, сочетая его с пятная других биомолекул с использованием двух различных методов окрашивания (например НБТ-SG с Кумасси) в том же гель.

Materials

Nitro blue tetrazolium	Gold Biotechnology	298-83-9	reagent used in the staining
SYBR Green I 10000X	Thermo-Fisher	S7563	reagent used in the staining
Gel extraction kit	QIAGEN	28704	used to extract plasmid from the gel in integrity assay
DNA ladder	Thermo-Fisher	SM 1331	used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay
Agar Agar	Merck		used to make LB-ampicillin culture plates 
sodium chloride	Merck	1064045000	used to make LB-ampicillin culture plates 
yeast extract	Becton, Dickinson and Company	212750	used to make LB-ampicillin culture plates 
peptone	Merck	72161000	used to make LB-ampicillin culture plates 
TEMED	AMRESCO	761	used to make polyacrylamide gels
ammonium persulfate	Calbiochem	2310	used to make polyacrylamide gels
acrylamide	invitrogen	15512-023	used to make polyacrylamide gels
bisacrylamide	SIGMA	146072	used to make polyacrylamide gels
Tris-base	Merck	1083821000	used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
EDTA	J.T. Baker	8993-01	used to make TAE buffer
Acetic acid	Merck	1,000,632,500	used to make TAE buffer
agarose	Merck	16802	used to make TAE buffer
spectrophotometer	Tecan	infinite 200 pro	used to quantify DNA plasmid
water purificatiom unit	Merck	Elix 100	use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions
distilled water		–	used in gels, culture medium, stainings and general solutions
HCl	J.T. Baker	9535-03	used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
6X DNA loading dye	Thermo-Fisher	R0610
5 mm Blue LED	Jinyuan electronics	SP-021	light source used in integrity assay
protoboard	KANDH	KH102	light source support and circuit 
9 V battery	Duracell	–	used to power the LED's
horizontal electrophoresis chamber	Biorad	1704486EDU	used to make and run agarose gel in integrity assay
vertical electrophoresis kit	Biorad	1658002EDU	used to run polyacrylamide gels in calibration curves
power supply	Biorad	1645050 	used to power the electrophoresis