Существует требование сделать Доклинические испытания для класса Роман «сирота» препаратов, называемых фармакологических сопровождающих, воспроизводимость, быстро и эффективно. Мы разработали на основе культуры пробирного высоко стандартизированных, простой и универсальный мобильный экран для право пациентов, а также сопровождающий Роман фармакологических препаратов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В пробирке Фермент измерения для испытания фармакологических Chaperone реагирования в Фабри и Pompe болезни
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Использование персонализированной медицины для лечения редких моногенных заболеваний как лизосомальных хранения расстройства (ЗПУ) оспаривается сложных клинических судебного конструкции, высокой стоимости и незначительного числа пациентов. В большинстве СУРЛ вовлечены сотни мутантных аллелей. Заболеваний, обычно подразделяются на 2-3 клинических типов зависимости от тяжести. Кроме того молекулярная характеристика генотипа может помочь предсказать клинических исходов и информировать пациентов. Поэтому мы разработали assay простой клетки культуры, основанные на HEK293H клетки, участием чрезмерно выражая мутации, выявленных в Фабри и Pompe болезни. Аналогичный анализ недавно была введена как Доклинические испытания для выявления поддаются мутации для фармакологической Chaperone терапии (РСТ) в болезнь Фабри. Эта рукопись описывает assay культуры измененные клетки, которая позволяет быстрое фенотипические оценки аллельных вариантов в Фабри и Pompe болезни определить право пациентов на РСТ и может помочь в разработке новых pharmacochaperones.
Введение
Есть более чем десятка лизосомальных хранения расстройств (ЗПУ), связанных с гликозидазы дисфункции в результате первичного генных мутаций. Соответственно, Фабри (Маккусика #301500) и болезней Pompe (Маккусика #232300), более чем 500 и 200 Миссенс-мутации зарегистрировано1,2,3 , что соответствует около 60% всего мутации графа. По-прежнему определяются многочисленные новые варианты гена, многие из которых имеют неизвестное значение. Обширные биохимические исследования показали, что определенные генотипы не приводят к полной потере функции гена GLA (Маккусика * 300644) в болезнь Фабри, но вызывают соответствующие фермента не в состоянии достичь термодинамически благоприятствования складной состояния4 . Это приводит к ER удержания и преждевременной ухудшение иначе функционального энзима. Аналогичные выводы были сделаны в других ЗПУ, включая Pompe болезни5. Кроме того молекулярная характеристика фермента вариантов может способствовать клинической интерпретации мутаций в момент диагностики6, предполагая, что ЛСД прогрессии является индивидуальный процесс, основанный на характер, мутации. Таким образом обычные классификации в различных клинических типов обычно 2-3 должны быть пересмотрены с целью упорядочения клинических консультирования и лечения.
Фермент заместительной терапии (ERT) доступен для обоих заболеваний. ERT, однако, имеет ограниченную эффективность в пораженные ткани/органы как мозг и скелетных мышц. Кроме того ERT можно выявить иммуногенность ответ, которая ставит под угрозу его терапевтический эффект. Фармакологических сопровождающим (шт) являются альтернативой привлекательным лечения для пациентов с так называемой гибкой мутации. ПК в качестве молекулярных леску для сворачивания белка правильной и стабилизации, который в свою очередь предотвращает сохранение эндоплазменный ретикулум (ER) и ER-связанные деградации фермента. Кроме того компьютеры могут быть введены перорально и потенциально могут пересекать гематоэнцефалический барьер. Таким образом РСТ может быть более жизнеспособным вариантом для лечения больных с определенным генотипов. Для обширный обзор на ПК приложения в ЗПУ обратитесь к отличным обзором Паренти7.
Обнаружение сотен болезнетворных мутантные аллели проблемы наркотиков Доклинические испытания и требует простой, быстрый и высоко стандартизованной оценки поддаются пациентов для персонализированной медицины подход. Чтобы оценить пагубное влияние мутаций гена ЛСД и тестирования кандидата мутации предсказать поддаются пациентов для РСТ, был высоко стандартизированных гиперэкспрессия системы в HEK293H клетках, которая позволяет для измерения активности фермента быстрый и надежный разработано. Аналогичные системы гиперэкспрессия ранее были описаны Фабри и Pompe болезни с помощью COS-78,9,10,11, НеЬа клетки12или HEK29313 ,14,,1516 клеток для гликозидазы гена.
Очень подобный метод запатентован даже как «Метод для прогнозирования реакции на фармакологические Chaperone лечение заболеваний»17 , указывающее значение ячейки культуры системы, способной интегрироваться в клиническую практику.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка мутант pcDNA3.1/GLA и pcDNA3.1/ГАА конструкций
Примечание: Клонирования стратегии гла и ГАА кодирования последовательностей (cds) были сообщалось ранее15,18.
- Сайт направленного мутагенеза, используя сайт Направленный мутагенез
- Используйте ссылку последовательностей NM_000169.2 и NM_000152.4 как шаблоны для мутагенеза GLA и ГАА генов, соответственно. Есть набор соль бесплатно грунтовки высокой чистоты (25-37-РВК) синтезируется коммерческого поставщика услуг, с смысл и antisense грунты, перевозящих один из соответствующих последовательности изменения центральной их длины индивидуально ввести мутации. Используйте средство дизайн бесплатно грунтовка для поддержки грунтовка дизайн19.
- Для реакционной смеси используйте стандартные условия для решения реакции и условия PCR, предоставляемых производителем.
- Mix 5 мкл 10 x буфер реакции, 10 нг двунитевая шаблон плазмидной ДНК (pcDNA3.1/GLA или pcDNA3.1/ГАА), 125 нг каждого праймера, 1 мкл предоставленный dNTP смеси, 3 мкл Реагента ДМСО в соответствующий объем деонизированной воды (объем окончательной реакции : 50 МКЛ). Наконец добавьте 2.5 U ДНК-полимеразы и смешивать, закупорить вверх и вниз. Как отрицательный контроль увлечь образец без грунт.
- Старт PCR, используя следующую программу: шаг 1: 95 ° C в течение 1 мин, шаг 2: 95 ° C 50 s, шаг 3: 60 ° C 50 s, шаг 4: 68 ° C 8 мин, повторите шаг 2-4 18 раз и шаг 5: 68 ° C в течение 10 мин.
- После ПЦР, 1 мкл Dpnя энзима ограничения (10 U/мкл) и далее инкубировать реакции флакон при 37 ° C в течение 1 ч.
- Преобразование и скрининга для желаемого клон
- Трансформировать Алиготе ultracompetent клеток в соответствии с рекомендациями производителя. Использование SOC среднего (Триптон 2% (w/v), дрожжевой экстракт 0,5% (w/v), NaCl 10 мм, KCl 2,5 мм, стерилизуют при температуре 121 ° C и затем добавить стерильной фильтрации растворов MgCl2 и глюкозы до окончательного концентрации 10 и 20 мм, соответственно) вместо производителя Средний. После процедуры плита 250 мкл мутагенеза образца на LB пластины содержащий ампициллина 100 мкг/мл и инкубировать при 37 ° C для 18 h.
- Заверить, что количество трансформантов > 10 и реакция урожайности по крайней мере в три раза больше колоний как без грунтовка управления реакции, например, с помощью световой пластины для облегчения подсчета колонии. Затем выбрать 3 колоний и подготовить 3 мл ночи культур в среде LB отвара.
- На следующий день, осуществлять подготовку плазмида с набором стандартных и анализировать всю последовательность, используя T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA тег GG-3ʹ) и праймеры BGHr (5ʹ-тег AAG ГЦА CAG ВРЧ общ 3ʹ) через стандартный Сэнгер последовательности.
- Используйте подходящие молекулярной биологии инструмент для анализа последовательности. При обнаружении требуемой мутации и no далее последовательности аномалий по сравнению с NM_000169.2 (α-галактозидазы A) или NM_000152.4 (кислота альфа-глюкозидазы) рассматривается, выберите клон для очищения плазмиды трансфекции класса.
- Определите чистоту ДНК путем измерения поглощения в спектрофотометре.
Примечание: Разрешать только те препараты, которые дают чистоты плазмида с коэффициентом поглощения 260/280 > 1.8 для ячейки культура экспериментов.
2. Культивирование клеток HEK293H
- Сохраняйте HEK293H клетки в высокой глюкозы (4,5 г/Л) Dulbecco´s модифицированных Eagle среднего (DMEM) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина. Держите клетки в water-jacket инкубатора при 37 ° C под атмосферу 5% CO2 .
- Культивируйте клетки плотностью 80-90%.
- Аспирационная среднего и мыть после того, как с помощью фосфат буфер солевой раствор (PBS) без Ca2 + и Mg2 +.
- Проход, добавив 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO2.
- Разделение клетки 1:15 в свежих средних и семян новых T75 колбу для поддержания постоянного культуры. Не использовать ячейки с более чем 25 проходы.
3. pcDNA3.1/GLA и pcDNA3.1/ГАА плазмида Transfection и лечения HEK293H
- за 24 часа до трансфекции, мыть HEK293H клетки в колбе культуры клеток T75 раз с PBS с Ca2 +, мг2 +. Урожай клетки с 0,05% трипсина-ЭДТА, как указано выше и семян 1,5 x 105 клетки в полости плиты 24 хорошо культуры с использованием 500 мкл DMEM среднего дополнена 10% FBS без антибиотиков.
- Осуществлять протокол transfection согласно инструкции производителя. Как правило используйте смесь из 1 мкг ДНК плазмиды и 2,5 мкл Реагента трансфекции в 100 мкл DMEM сыворотки бесплатно. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре и добавить в ячейки в drop-wise манере впоследствии.
- Удалите носитель, содержащий трансфекции реагент после периода 4 ч при 37 °C/5% CO2 и 500 мкл свежие DMEM с 10% FBS / 1% пенициллина/стрептомицина.
Примечание: Во время этого шага, 1-Deoxygalactonojirimycin гидрохлорид (DGJ) или 1-Deoxynojirimycin гидрохлорид (DNJ) могут быть добавлены к питательной среды где предназначены (использовать водный раствор 10 мм для получения конечной концентрации 20 мкм DGJ и DNJ ). Свежие DGJ или DNJ был добавлен 42 h после трансфекции плазмиды.
4. ячейка урожай и α-галактозидазы A или кислоты альфа-глюкозидазы измерения активности
- Ячейка урожай
- В день сбора урожая удалить ячейки из инкубатора и аспирационная среды. Тщательно вымойте клетки 2 раза с PBS с Ca2 + и Mg2 +.
Примечание: Этот шаг очень важен, потому что DGJ и DNJ являются сильными ингибиторами α-галактозидазы и α-глюкозидазы, соответственно, и любые остатки нарушится тест. - 200 мкл деионизованной воды непосредственно на верхней части клетки. Промойте клетки от плиты и передавать их на 1,5 мл реакции.
- В день сбора урожая удалить ячейки из инкубатора и аспирационная среды. Тщательно вымойте клетки 2 раза с PBS с Ca2 + и Mg2 +.
- Гомогенизация, замораживания и оттаивания
- Поместите образцы в соответствующей пены стойку и вихревые для 5 s, чтобы сделать более эффективным lysis. Поместите образцы, чередуя в жидком азоте для 10 s и в ванну воды комнатной температуры до оттаивания был полный (5 мин).
- Повторите эту процедуру 5 раз и затем спина образцы для 5 мин на 10000 x g.
- Подготовьте свежие трубки для каждого образца, содержащий 40 мкл дейонизированной H2O и 10 мкл пример. Mix решение vortexing кратко и передачи 10 мкл в полость 96 хорошо плиты (каждый образец в трех экземплярах). Разбавить бычьим сывороточным альбумином (БСА) раствор 2 мг/мл в дейонизированной H2O следующим образом для получения калибровочной кривой: 50 мкл H2мкл BSA O/50; 60 мкл H2O/40 мкл BSA; 70 мкл H2O/30 мкл BSA; 80 мкл H2O/20 мкл BSA; Мкл 90 H2O/10 мкл BSA; 100 мкл H2O.
- Начала реакции, добавив 200 мкл Реагента BCA (Реагент A и B реагент смешивается в соотношении 50: 1) и инкубировать в течение 1 ч в темноте при 37 ° C под легким агитации на орбитальный шейкер (300 об/мин). Измерение оптической плотности на 560 Нм в тарелку читателя.
Примечание: Образцы обычно содержат от 1 до 1,5 мкг белка на мкл.
- Разбавьте подсчитанная сумма каждого образца и пипетки в свежие 1,5 мл реакции трубы для получения 0,05 (для α-галактозидазы A) или (для кислоты альфа-глюкозидазы) 0,5 мкг белка/мкл решения. Вихревой образцы для 5 s снова и пипетки 10 мкл этой разрежения в 96 хорошо пластины (каждый образец в двух экземплярах).
- Начало реакции, добавив 20 мкл раствора соответствующих субстрата:
Для α-галактозидазы A: 2 мм 4-Methylumbelliferyl-α-D-галактопиранозид (4-му gal) в 0,06 М фосфатного буфера цитрата, рН 4.7.
Для кислоты альфа-глюкозидазы: 2 мм 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-му glu) в ацетат натрия 0,025 M, рН 4,0. - Инкубируйте ферментативных реакций на 1 ч в темноте при 37 ° C под легким агитации на орбитальный шейкер (300 об/мин). Прекратить реакцию путем добавления 200 мкл 1,0 м, рН 10.5 скорректированные глицин NaOH буфера.
- Стандартной кривой 4-methylumbelliferone (4-му) от 0,01 мг/мл бульона приготовляют следующим образом:
100 мкл H2O / нет 4-му; 80 мкл H2O / 20 мкл 4-му; 60 мкл H2O / 40 мкл 4-му; 40 мкл H2O / 60 мкл 4-му; 20 мкл H2O / 80 мкл 4-му; H2O / 100 µL 4-му, накапайте 10 мкл каждого разведения в 96 хорошо пластины (в дубликатов) и добавить 200 мкл буфера 1,0 М глицин NaOH в каждой скважине для того чтобы отрегулировать громкость и рН. - Мера активности ферментов в флуоресценции читателя с соответствующим фильтром установить и анализировать данные с помощью соответствующего программного обеспечения для устройства чтения флуоресценции.
Примечание: Оба 4-кружка субстратов сводится к 4-му во время воздействия α-галактозидазы A или кислоты альфа-глюкозидазы. Выпущенное 4-му является флюрохром, которая может быть измерена на 360 и 465 Нм как волны возбуждения и выбросов, соответственно, с помощью Считыватель микропланшетов флуоресценции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Процедура мутагенеза
Чтобы оценить эффективность GLA генов мутагенезом, мутации были классифицированы в одну из следующих категорий. Этот подход к генерации мутации показал, что около 66,5% мутаций GLA были получены в первой попытке. Еще 25% могут быть получены после слегка модифицированный второй ПЦР.
Категория 1: Мутагенезом PCR было эффективным с первой попытки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанные здесь, обеспечивает надежные результаты оценки ущерба фермента в наследственных лизосомных заболеваний обмена веществ. Эта рукопись является поправка к протоколу публикации ранее15. Наиболее важных изменений включают жесткости (то есть, в процессе подготовки мутант векторная конструкция), стандартизация протокол культуры клетки (то есть, HEK293H клетки обслуживания и transfection условия) и высокая количество экспериментальных повторений (по крайней мере 5), к...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы признать Мэнди Loebert и Тина Чайка за отличную техническую поддержку. Мы благодарим Luo Флора (Гарвардской медицинской школы, Бостон, MA, США) для языка редактирования помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, США | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA CCA´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Primer | |
| BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Эберсберг, Германия | n.a.Tryptone | |
| Carl Roth, Карлсруэ, Германия | 8952.1 | ||
| Экстракт дрожжей | Merck, Дармштадт, Германия | 103,753 | |
| Хлорид натрия | Merck, Дармштадт, Германия | 1,064,041,000 | |
| Хлорид потазия | Merck, Дармштадт, Германия | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Дармштадт, Германия | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Моногидрат глюкозы | Merck, Дармштадт, Германия | 1,083,422,500 | |
| Гидроксид натрия | Merck, Дармштадт, Германия | 1,064,980,500 | |
| Глицин | Carl Roth, Карлсруэ, Германия | 3908.2 | |
| Лимонная кислота | Carl Roth, Карлсруэ, Германия | X863.3 | |
| динатрия гидрофосфат | Merck, Дармштадт, Германия | 1,065,860,500 | |
| Ацетат натрия | Merck, Дармштадт, Германия | 1,062,640,050 | |
| Ледяная уксусная кислота | Sigma Aldrich, Мюнхен, Германия | A6283 | |
| LB Агар | Carl Roth, Карлсруэ, Германия | X969.2 | |
| LB Средний | Carl Roth, Карлсруэ, Германия | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch | , Фрайбург, Германия | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Германия | 12245 | |
| HEK293H клеточная линия | Invitrogen, Карлсруэ, Германия | 11631-017 | |
| Dulbecco´ s Модифицированный Eagle Medium | Invitrogen, Карлсруэ, Германия | 31966-047 | |
| Сыворотка бычьего рогатого скота HyClone | GE Healthcare, Южный Логан, штат Юта, США | SV30160.03 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Invitrogen, Карлсруэ, Германия | 15140-122 | |
| Стандартные колбы для клеточных культур CELLSTAR, Greiner Bio One VWR | International GmbH, Ганновер, Германия | 82050-854 | |
| Планшеты для клеточных культур (24 лунки) | Sarstedt, Nü mbrecht, Германия | 831,836 | |
| Cellstar 96 луночный планшет | Greiner bio one, Фрикенхаузен, Германия | 655185 | |
| реакционные пробирки SafeSeal, 1,5 мл | Sarstedt, Nü mbrecht, Германия | 72,706 | |
| Липофектамин 2000 | Invitrogen, Карлсруэ, Германия | 11668-019 | |
| 1-дезоксигалактоноджиримицина гидрохлорид | Sigma Aldrich, Мюнхен, Германия | D9641 | |
| 1-дезоксигалактоноджиримицина гидрохлорид | Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада | D236500 | |
| 1-дезоксиноджиримицин | Sigma Aldrich, Мюнхен, Германия | D9305 | |
| PBS Dulbecco без кальция, без магния | Biochrom, Берлин, | Германия L 1825 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,05%), фенол красный | Thermo Scientific, Брауншвейг, Германия | 25300054 | |
| набор для анализа белка BCA Pierce | Thermo Scientific, Брауншвейг, Германия | 23225 | |
| 4-метилумбеллиферон | сигма Aldrich, Мюнхен, Германия | M1381 | |
| 4-метилумбеллиферил &альфа;-D-галактопиранозид | Sigma Aldrich, Мюнхен, Германия | M7633 | |
| 4-метилумбеллиферил &альфа;-D-глюкопиранозид | Sigma Aldrich, Мюнхен, Германия | M9766 | |
| Name< | strong>Company | >Номер в каталоге | Комментарии |
| Equipment | |||
| incubator тип T6 | Heraeus Instruments, Ханау, Германия | n.a.Luminous | |
| Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Германия | P265.1 | |
| 3130 xl Генетический анализатор | Applied Biosystems, Дармштадт, Германия | n.a.GFL-3032 | |
| бактериальный шейкер | GFL, Бургведель, Германия | n.a.Avanti | |
| J-25 центрифуга | Beckman/Coulter, Крефельд, Германия | n.a.Ultraspec | |
| 3100 pro спектрофотометр | Amersham Biosciences, Бакингемшир, Великобритания | н.а. | |
| с водяной рубашкой | Binder, Туттлинген, Германия | n.a.Vortex | |
| Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Богемия, Нью-Йорк, США | n.a.Z | |
| 233 MK-2 охлаждаемая микротрубчатая центрифуга | Hermle, Туттлинген, Германия | n.a.LaboStar | |
| прибор для сверхчистой воды | Siemens, Берлин, Германия | n.a.Thermo | |
| Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Рига, Латвия | n.a.Tecan | |
| GENios Reader | Tecan, Mä nnedorf, Швейцария | n.a.HI | |
| 223 Микропроцессорный pH-метр | HANNA Instruments, Арворе, Португалия | n.a.CASY | |
| br/> Cell Counter + Analyser System Модель TT | Innovatis AG, Cham/Zug, Швейцария | ||
| Name | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| >Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Mä nnedorf, Швейцария | n.a.GraphPad | |
| Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния; США | n.a.Microsoft | |
| Office 2010 | Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон, США | n.a.BioEdit | |
| Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = не применимо |
Ссылки
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331(2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092(2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632(2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111(2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91(2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
