В рукописи мы описывают использование на основе дрожжей флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов, участвующих в торговле и убивать процессы цитотоксических Субблок рицин токсинному завод (RTA).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Простой на основе флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов необходимых для рицин токсинному цепь (RTA) оборота дрожжей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Бактерий и растений A / B токсинов эксплуатировать природные людьми путей в эукариотических клеток для достижения их внутриклеточного ориентация в цитозоле и в конечном итоге убить. Такие A / B токсинов обычно состоят из ферментативно активной Asubunit (например, рицин токсинному (RTA)) и один или несколько ячеек, привязки Bsubunit(s), которые отвечают за токсин, привязки к определенным клеток поверхности рецепторы. Наши текущие знания о том, как A / B токсины способны эффективно опьяняющий клетки помогли ученым понять основных клеточных механизмов, как эндоцитоза и внутриклеточных белков, сортировка в высших эукариотических клеток. С медицинской точки зрения это также важно для выявления маршрутов оборота основных токсин найти решения адекватного лечения для пациентов или в конечном итоге разработать терапевтические токсин основанные применения для терапии рака.
С Анализ генома общесистемной A / B токсин, торговля в клетках млекопитающих является сложным, длительным и дорогостоящим, несколько исследований на A / B токсин транспорта выполнены в организме модель дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Несмотря на то что менее сложной, основных клеточных процессов в дрожжей и высших эукариотических клеток похожи и очень часто результаты, полученные в дрожжи могут быть переданы млекопитающих ситуации.
Здесь мы описываем быстрый и простой в использовании репортер пробирного анализа внутриклеточных торговли РТС в дрожжи. Существенным преимуществом нового анализа является возможность исследовать не только RTA ретро транслокации от эндоплазменный ретикулум (ER) в цитозоль, но скорее эндоцитоза и ретроградным токсин транспорт от плазматической мембраны в ER. Assay делает использование плазмида репортер, который позволяет косвенные измерения токсичности РТС через флуоресценции выбросов зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) после перевода в естественных условиях . Так как RTA эффективно предотвращает начало биосинтеза белка, 28S рРНК депуринизации, этот assay позволяет идентифицировать принимающей ячейки белков участвующих в внутриклеточного транспорта РТС через обнаружение изменений в флуоресценции выбросов.
Введение
Пациентов, страдающих от инфекций, токсин, бактерий представляют серьезные медицинские и финансовое бремя для каждой социальной системы здравоохранения, в частности, поскольку по-прежнему во многом отсутствуют эффективные лечебные процедуры. Для разработки новых терапевтических стратегий, механизмов комплекса интоксикации медицински соответствующие A / B токсинов, таких как холера токсин, Сига токсин или рицин необходимо полностью понимать на молекулярном уровне на основе романа мощный анализов, которые должны быть реализованы.
В последние годы, несколько исследований попытались проанализировать A / B токсин транспорт в дрожжей и mammalian ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Обзор общего рабочего процесса, экспериментальный изображен на рисунке 1.
Предупреждение: RTA высоко токсичен для людей. Требуется безопасность лаборатории разрешение S2 (биобезопасности уровня 2 эквивалент). Пожалуйста, носите перчатки в течение всего эксперимента.
1. гетерологичных выражение его меткой РТС в Escherichia coli
- Преобразование клеток кишечной палочки с выражение плазмида pET24-RTA(его) 6 или пустой вектор pET24a(+) с помощью стандартных электропорации протоколы9,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Процесс общего протокола, описанные в этой рукописи показана на рис. 1, примерно обобщение одного шаги для успешной очистки РТС и последующих GFP репортер пробирного эксперимент. Более подробное описание каждого отдельного шага можно найти в протоколе. Рисунок 2 иллюстрирует ожидаемый результат успешной очистки RTA аффинной хроматографии (рисунок 2A) и пустой вектор управления (р.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
При выполнении вышеупомянутый Протокол, мы рекомендуем следующие предложения для достижения успешных результатов эксперимента.
Для выражения гетерологичных протеина важно не превышать концентрацию IPTG 1 мм. IPTG концентрации > 1 мм подавляют промоутер индуцированной RTA выражения и приведет к снижению урожайности токсин. Кроме того клетки не должно быть культивируемых при температурах выше 28 ° C для предотвращения включения тела формирования, неэффективной и складывающиеся инактивации то.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Части этого исследования были любезно при поддержке гранта от Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильные>штаммы бактерий и дрожжей | |||
| <эм>Кишечная палочка BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 делеционные мутанты | Dharmacon | YSC1054 | целая коллекция |
| Name | Company< | Номер в каталог>е | Комментарии |
| Плазмиды, используемые в этом протоколе | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3< | ||
| >Name< | strong>Company | Номер в каталоге | Comments |
| >Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | литический фермент для клеточной стенки удаление |
| LB бульон средний | Thermo Scientific | 10855021 | 15 г агара был добавлен для производства пластин |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Сульфат аммония | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Дрожжевые добавки из смеси без лейцина | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Агар | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-глюкоза | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-рафиноза | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-сорбит | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-галактоза | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Имидазол | Рот | 3899.1 | |
| СТРАНИЦА линейка предварительно окрашенная | Fermentas | 26616 | белковая лестница, используемая для западного анализа |
| Name | Company | >Номер в каталоге | Комментарии |
| >Материал для очистки, обессоливания RTA и измерений считывателя | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | старая модель, другие доступные модели | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | старая модель, больше нет в наличии |
| & Auml; KTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Продукт снят с производства и заменен |
| HisTRAP HP колонка | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP обессоливающая колонна | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart стерильный фильтр | Sartorius | 16534K | 0.2 &; m набор |
| анализа белка BCA | размером пор Pierce | 23225 | |
| набор для анализа 660 нм | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 луночных планшетов | Thermo Scientific | 260860 | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| <сильно>антитела (опционально) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | первичное антитело; |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | , разведение 1:1000 |
Ссылки
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
