Простой на основе флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов необходимых для рицин токсинному цепь (RTA) оборота дрожжей

Краткое содержание

В рукописи мы описывают использование на основе дрожжей флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов, участвующих в торговле и убивать процессы цитотоксических Субблок рицин токсинному завод (RTA).

Аннотация

Бактерий и растений A / B токсинов эксплуатировать природные людьми путей в эукариотических клеток для достижения их внутриклеточного ориентация в цитозоле и в конечном итоге убить. Такие A / B токсинов обычно состоят из ферментативно активной Asubunit (например, рицин токсинному (RTA)) и один или несколько ячеек, привязки Bsubunit(s), которые отвечают за токсин, привязки к определенным клеток поверхности рецепторы. Наши текущие знания о том, как A / B токсины способны эффективно опьяняющий клетки помогли ученым понять основных клеточных механизмов, как эндоцитоза и внутриклеточных белков, сортировка в высших эукариотических клеток. С медицинской точки зрения это также важно для выявления маршрутов оборота основных токсин найти решения адекватного лечения для пациентов или в конечном итоге разработать терапевтические токсин основанные применения для терапии рака.

С Анализ генома общесистемной A / B токсин, торговля в клетках млекопитающих является сложным, длительным и дорогостоящим, несколько исследований на A / B токсин транспорта выполнены в организме модель дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Несмотря на то что менее сложной, основных клеточных процессов в дрожжей и высших эукариотических клеток похожи и очень часто результаты, полученные в дрожжи могут быть переданы млекопитающих ситуации.

Здесь мы описываем быстрый и простой в использовании репортер пробирного анализа внутриклеточных торговли РТС в дрожжи. Существенным преимуществом нового анализа является возможность исследовать не только RTA ретро транслокации от эндоплазменный ретикулум (ER) в цитозоль, но скорее эндоцитоза и ретроградным токсин транспорт от плазматической мембраны в ER. Assay делает использование плазмида репортер, который позволяет косвенные измерения токсичности РТС через флуоресценции выбросов зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) после перевода в естественных условиях . Так как RTA эффективно предотвращает начало биосинтеза белка, 28S рРНК депуринизации, этот assay позволяет идентифицировать принимающей ячейки белков участвующих в внутриклеточного транспорта РТС через обнаружение изменений в флуоресценции выбросов.

Введение

Пациентов, страдающих от инфекций, токсин, бактерий представляют серьезные медицинские и финансовое бремя для каждой социальной системы здравоохранения, в частности, поскольку по-прежнему во многом отсутствуют эффективные лечебные процедуры. Для разработки новых терапевтических стратегий, механизмов комплекса интоксикации медицински соответствующие A / B токсинов, таких как холера токсин, Сига токсин или рицин необходимо полностью понимать на молекулярном уровне на основе романа мощный анализов, которые должны быть реализованы.

В последние годы, несколько исследований попытались проанализировать A / B токсин транспорт в дрожжей и mammalian клеток с помощью длительных и дорогостоящих методов, таких как радиоактивного токсина маркировки^1,2 , а также на основе малых интерферирующих РНК скрининг подходы к³. В некоторых случаях токсин людьми был визуализирован в естественных условиях по микроскопии флуоресцирования после химических и/или генетических сцепления отдельных токсин субблоков с флуорофоров, квантовые точки либо флуоресцентные белки^4,5. К сожалению таких изменений часто приводят к неактивной и/или измененных природных свойств токсины. Другой элегантный способ ответить косвенно широкий спектр научных вопросов является использование репортер систем на основе ферментов, таких как lacZ, Люцифераза, или флуоресцентные белки (например GFP или Discosoma sp. красный флуоресцирующий белок () dsRed)).

В этой рукописи простой протокол описан, который идентифицирует клеточных компонентов, необходимых для внутриклеточного транспорта внеклеточно прикладной РТС в S. cerevisiae. Таким образом флуоресценции репортер плазмида, содержащие сигнал N-терминальный ER-импорта, следуют GFP выступает в качестве датчика биосинтез белка, который косвенно меры ингибирование перевод RTA-опосредованной белка GFP флуоресценции выбросов после в естественных условиях перевод⁶. В случае, что RTA эндоцитоз или внутриклеточных торговли отрицательно (или положительное) влияет в мутанта удаления конкретной дрожжей, по сравнению с одичал тип это может быть обнаружена через увеличение (или уменьшение) в GFP флуоресценции выбросов⁶.

Пока все методы анализа RTA транспорт в дрожжевых клеток были ограничены ER-цитозоль ретро транслокации процесс RTA. В такой системе искусственного РТС, содержащие сигнал импорта ER выражается от индуцибельной промоутер, что приводит к фенотипу суицидальные^1,7. Хотя ячейку привязки B-Субблок рицин в экспериментальной установки, описанных в этой рукописи также отсутствует и, таким образом, не представляют собой полностью естественный ситуации рицин holotoxin интоксикации⁸, токсин транспорт из плазмы мембраны через аппарат Гольджи к ER можно тесно имитировать с этот роман assay. Интересно, что предварительные результаты, полученные в ходе экспериментального исследования указывают, что людьми пути, используемые RTA показывают поразительное сходство с опьянением маршрут рицин holotoxin.

В целом описан метод может использоваться для определения конкретной роли отдельных клеточных белков в RTA эндоцитоза и оборота дрожжей. Кроме того эта экспериментальная установка может легко адаптируется к другим рибосома инактивации токсинов производятся и от различных дрожжей и бактерий видов, таких как zymocin или сига токсин.

Протокол

Примечание: Обзор общего рабочего процесса, экспериментальный изображен на рисунке 1.

Предупреждение: RTA высоко токсичен для людей. Требуется безопасность лаборатории разрешение S2 (биобезопасности уровня 2 эквивалент). Пожалуйста, носите перчатки в течение всего эксперимента.

1. гетерологичных выражение его меткой РТС в Escherichia coli

1. Преобразование клеток кишечной палочки с выражение плазмида pET24-RTA_{(его) 6} или пустой вектор pET24a⁽⁺⁾ с помощью стандартных электропорации протоколы^9,10. Ячейки, содержащие пустые плазмида служат отрицательного контроля.
2. После выбора положительных клонов на канамицин содержащих пластины фунтов (100 мкг/мл) прививать клетки, содержащие выражение плазмида RTA или пустой вектор в 5 мл LB_Кан среднего (LB средний 100 мкг/мл канамицин) и Инкубируйте на 37 ° C и 220 rpm за 24 ч.
3. Дополнение 1 L LB_Кан средних с 5 мл перед культурой и инкубации клеток при 37 ° C и 220 об/мин, до тех пор, пока клетки достигли ОД₆₀₀ 0.8-1.0 (примерно 3-4 h). После этого уменьшить температуру культуры до 28 ° C и подготовить 1 M изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) раствор в H₂O.
4. Побудить RTA выражением E. coli , добавив IPTG до конечной концентрации 1 мм.
5. После 3.5 h на 28 ° C и 220 rpm, урожай клетки центрифугированием на 10000 x g и 4 ° C на 10 мин, помыть лепешка два раза с 5 мл буфера привязки (500 мм NaCl, имидазола 10 мм и 20 мм х₂PO₄ pH = 7,4) на 10 000 x g и 4 ° C на 10 мин и Ресуспензируйте Пелле в 5 мл связывание буфера.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена на данном этапе, и клетки могут храниться при температуре 80 ° C в течение нескольких дней.

2. Очистка его меткой РТС через аффинной хроматографии

1. Sonicate клетки на льду, используя следующий протокол: 15 s пульс (20 мкм), 30 s паузы. Повторите этот шаг пять раз.
2. Центрифуга клеток lysate на 21 000 x g и 4 ° C на 15 мин и фильтровать супернатанта, используя систему фильтров стерильный шприц (размер пор 0.2 мкм).
   Примечание: Гранулы клетки успешно sonicated образцов Показать прозрачные границы.
3. Использовать систему автоматизированной очистки с 5 мл Ni^{2 +}-на основе сходства столбец для того чтобы очистить его меткой RTA фракция от стерильной фильтрации E. coli супернатант. В общем используйте элюции скорость 1 мл/мин и охладить весь очистки системы для предотвращения привязки неэффективным токсин и потеря активности токсин.
   Примечание: В таблице 1перечислены параметры для эффективной очистки RTA. Смотрите также Беккер и др. для дальнейшей информации,⁹.
   1. Вкратце сбалансировать столбце сходства с 20 мл буфера привязки удалить буфер хранения. Примените стерильной фильтрации супернатант на столбец сходства с помощью шприца.
   2. Промойте колонку с 25-35 мл буфера привязки для удаления unbound протеины из столбца. Выполните шаг Стиральная до поглощения УФ на 280 Нм находится недалеко от начального значения УФ.
   3. Элюировать привязанных RTA фракция 20-35 мл буфера (имидазол 500 мм, 500 мм NaCl, 20 мм х₂PO₄, pH = 7.2) и сохранить образец на льду (рисунок 2A и 2B рисунок).
      Примечание: Элюции RTA фракции характеризуется увеличением УФ поглощения. Пожалуйста, обратите внимание исключительно собирать эта фракция для предотвращения загрязнения с неспецифическими связанных белков.
   4. Используйте 20 мкл eluted образцов для выполнения Кумасси синим пятнать¹¹ или Вестерн-блот анализ^12,13 (необязательно). Используйте начальных против его антител (1:1, 000) и вторичные анти-mouse-IgG-ПХ (1:10, 000) для обнаружения РТС и проверки чистоты образца (рис. 3).
   5. Опреснения eluted RTA дроби на 5 мл опреснительной столбца и сбалансировать образца в 0,8 М сорбитол.
      1. Заменить сродство столбца столбец системы очистки опреснительной и впервые сбалансировать столбец с 20 мл сорбитола 0,8 М.
      2. Примените eluted RTA дроби к столбцу через шприц. Промойте колонку с 100 мл сорбитола 0,8 М и элюировать обессоленной RTA дроби в 15 мл трубку, как только поглощения УФ начинает увеличить (рис. 2 c).
      3. Хранить eluted RTA дроби при 4 ° C.
         Примечание: Непосредственно остановите RTA доля выборки, когда проводимость увеличивается во избежание загрязнения соли. В таблице 1 перечислены параметры для опреснительной процедуры.
4. Концентрат eluted RTA дроби на 10000 x g и 4 ° C на 30-180 мин с использованием 10 кДа Усеченная колонна спина в окончательный объем 1-2 мл и хранить образца при температуре 4 ° C для 3-4 недели.
   Предупреждение: Не замерзают образца после замораживания приводит к полной потере RTA деятельности.
5. Определите концентрацию белка, используя набор для определения обычного белка. Концентрация белка должно быть в диапазоне 1-1,5 мг/мл.
   Примечание: РТС, как правило, осадок при слишком высокой концентрации протеина (> 5 мг/мл).

3. дрожжи преобразования и удаления клеточной стенки

1. Трансформировать одичал тип или отдельных дрожжи удаления мутантов с GFP репортер плазмида pRS315-K28_SP- GFP⁶ с помощью стандартной литий ацетат трансформации методов¹⁴. Инкубировать клетки на лейцина отсева (d/o) глюкозы пластины (2% раствор глюкозы, агар 1,5%, 0,5% сульфата аммония, 0,17% дрожжей азота базы (YNB) и 0.087% d/o смесь без лейцина) при 30 ° C на 2-3 дня по критерию позитивных клон.
2. Выберите 3 клоны различных дрожжей от каждой плиты и инокуляции клонов в 100 мл лейцина d/o Рафиноза среды (Рафиноза 2%, 0,5% сульфата аммония, 0,17% YNB и 0.087% d/o смесь без лейцина) 220 об/мин и 30 ° C до₆₀₀ OD = 1.0-2.0 (2-4 x 10⁷ клеток/мл).
   Примечание: Рост клеток штаммов удаления различных дрожжей отличается. Монитор ОД₆₀₀ через спектрофотометром.
3. Для вычисления значений₆₀₀ ОД, развести образцы ОД₆₀₀ = 0,1-0,3 (1:5 до 1:10 разведений) и измерения₆₀₀ ОД в спектрофотометре. Как ссылка используйте H₂O дополнена соответствующее количество лейцина d/o raffionose среды.

Наконец, Ресуспензируйте ОД₆₀₀ = 125 в 5 мл стерильной воды (5 x 10⁸ клеток/мл).

Центрифуга клетки при 25 ° C за 5 мин на 10000 x g, вымыть клетки дважды с 5 мл стерильной воды и Ресуспензируйте ячейки в буфер spheroplasting 50 мл (сорбитол 0,8 М, 10 мм трис-HCl (рН 7,5), 10 мм₂CaCl, 2 мм Дитиотреитол (DTT) и 200 мкг/мл литических ферментов).

Инкубировать культуры 50 мл на 100 об/мин и 30 ° C для 90 минут дополнительно: мониторинг формирования сферопласт каждые 15 мин при фазово-контрастной микроскопии. Под микроскопом клетки должны иметь прозрачный темно-серого цвета. Брайт (refractile) клеток недостаточно перевариваются, тогда как призраки (бледно-серый клетки с мало, если таковые имеются, внутренняя структура) чрезмерно перевариваются.

Проверьте эффективность подготовки сферопласт для каждого образца.

1. После того, как отделочные шаг 3.5, смешать 4 мкл spheroplasted 50 мл культуры с 496 мкл буфера spheroplasting (примерно 2 × 10⁶ spheroplasts) и центрифуги для 10 мин на 400 x g.
2. Ресуспензируйте Пелле в 10 мл H₂O дистиллированной, образец вихрь 30 s, и пластины из 10 мкл пример на лейцина d/o глюкозы пластины (2% раствор глюкозы, агар 1,5%, 0,5% сульфата аммония, 0,17% YNB и 0.087% d/o смесь без лейцина).
3. Инкубации клеток для 3 дней при 30 ° C. Подсчитать общее количество колоний выращенные клетки на плите. Для оценки данных, используйте только образцы с эффективностью более чем 98% (всего количества клеток колонии < 40 колоний/плита).

Центрифуга клетки от шаг 3.5 на 400 x g и 4 ° C на 10 минут и смыть клетки дважды с 5 мл стабилизировалась лейцина d/o Рафиноза среднего (сорбитол 0,8 М, Рафиноза 2%, 0,5% сульфата аммония, 0,17% YNB и 0.087% отсева из смеси без лейцина). Ресуспензируйте клетки в 5 мл стабилизированной лейцина d/o Рафиноза среднего (1 x 10⁸ клеток/мл) и напрямую использовать клетки для измерений assay репортера GFP (раздел 4).

4. GFP репортер Assay измерения в 96-луночных пластины

1. Семена из spheroplasts клеток дрожжей, полученный на шаге 3.7 в 96-луночных пластины (200 мкл/хорошо).
2. Добавить 70 Рафиноза среднего d/o мкл стабилизированный лейцина, содержащие отрицательный контроль (элюата Ni^{2 +}-сродство очищенный lysate клетки от клеток IPTG-индуцированной E. coli , выражая пустой вектор) или очищенного РТС в конечной концентрации РТС 5 мкм ( соответствует 160 г/Л RTA) в каждой скважине.
3. Сразу же добавьте 30 решение галактозы мкл стабилизировалась (галактоза 30%, сорбит 0,8 М) чтобы побудить экспрессия гена GFP и впоследствии начать измерение.
   Примечание: Выполнить по крайней мере 3 технических реплицирует за эксперимент и 3 биологических реплицирует на штамм дрожжей.
4. После окончания подготовки проб (шаги 4.1-4.3) Положите пластину 96-луночных флуоресценции читателя и начать измерение. Используйте фильтр 475/509 Нм, набор необходимых для GFP флуоресценции обнаружения. Выполнения измерений при 30 ° C, 120 об/мин и с трястия диаметром 1 мм над окно времени 20 h (измерения каждые 10 минут).
   Примечание: Набор фильтров GFP обычно доступна во всех системах читателя. Температура, время окна, измерения интервалов и концентрация РТС может настраиваться для собственных нужд. Представитель результаты показаны на рисунке 4.
5. Дополнительно: Используйте дополнительные механизмы внутреннего контроля в области измерения для контроля качества. Подготовьте отрицательный контроль, добавив 30 мкл стабилизированный лейцина d/o Рафиноза среднего вместо 30% галактозу (не GFP индукции). Кроме того 70 мкл раствора G418 0,8 М сорбитол стабилизировалась (300 мкг/мл). Перевод ингибитором белка G418 служит в качестве позитивного управления для ингибирования белка как он предотвращает экспрессия гена GFP в дрожжи.
6. Рассчитать относительный GFP флуоресценции в процентах для точки время 20 h по следующему уравнению (см. рис. 4A): где NC является отрицательный контроль
   1. Кроме того, определить относительную GFP флуоресценции для каждой точки измерения (в данном случае 10 мин, также смотрите шаг 4.4) с использованием выше уравнения. Как показано на рисунке 4В, создайте граф, промокательной интенсивностью флюоресценции GFP (ось y) с течением времени (ось x).

Результаты

Процесс общего протокола, описанные в этой рукописи показана на рис. 1, примерно обобщение одного шаги для успешной очистки РТС и последующих GFP репортер пробирного эксперимент. Более подробное описание каждого отдельного шага можно найти в протоколе. Рисунок 2 иллюстрирует ожидаемый результат успешной очистки RTA аффинной хроматографии (рисунок 2A) и пустой вектор управления (р...

Обсуждение

При выполнении вышеупомянутый Протокол, мы рекомендуем следующие предложения для достижения успешных результатов эксперимента.

Для выражения гетерологичных протеина важно не превышать концентрацию IPTG 1 мм. IPTG концентрации > 1 мм подавляют промоутер индуцированной RTA выражения и приведет к снижению урожайности токсин. Кроме того клетки не должно быть культивируемых при температурах выше 28 ° C для предотвращения включения тела формирования, неэффективной и складывающиеся инактивации то...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильные>штаммы бактерий и дрожжей
<эм>Кишечная палочка BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 делеционные мутанты	Dharmacon	YSC1054	целая коллекция
Name	Company<	Номер в каталог>е	Комментарии
Плазмиды, используемые в этом протоколе
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3<
>Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Comments
>Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	литический фермент для клеточной стенки удаление
LB бульон средний	Thermo Scientific	10855021	15 г агара был добавлен для производства пластин
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Сульфат аммония	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Дрожжевые добавки из смеси без лейцина	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Агар	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-рафиноза	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-сорбит	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-галактоза	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Имидазол	Рот	3899.1
СТРАНИЦА линейка предварительно окрашенная	Fermentas	26616	белковая лестница, используемая для западного анализа
Name	Company	>Номер в каталоге	Комментарии
>Материал для очистки, обессоливания RTA и измерений считывателя
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		старая модель, другие доступные модели
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	старая модель, больше нет в наличии
& Auml; KTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Продукт снят с производства и заменен
HisTRAP HP колонка	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP обессоливающая колонна	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart стерильный фильтр	Sartorius	16534K	0.2 &; m набор
анализа белка BCA	размером пор Pierce	23225
набор для анализа 660 нм	Thermo Scientific	22660
96 луночных планшетов	Thermo Scientific	260860
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
<сильно>антитела (опционально)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	первичное антитело;
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	, разведение 1:1000