Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Эта рукопись описывает метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы датчиками дневно меченых ДНК, для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH — метод визуализации, который позволяет одновременного обнаружения, локализации и количественной оценки одной молекулы мРНК в фиксированных отдельных ячеек.

Abstract

Описан метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы в фиксированных бактерий для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH позволяет измерение к ячейке изменчивости в мРНК копировать количество генов интерес, а также субцеллюлярные расположение стенограммы. Основные шаги, фиксация культуры бактериальных клеток, permeabilization клеточных мембран и гибридизации целевой стенограммы с наборами коммерчески доступных короткие дневно меченых олигонуклеотидных зондов. smFISH может позволить изображения стенограммы нескольких генов в той же ячейке, с ограничения, налагаемые спектральных дублирования между различными флуоресцентных маркеров. После завершения протокола, показанная ниже клетки может быть легко образы с помощью микроскопа, в сочетании с камерой для низк интенсивности флуоресценции. Эти изображения, а также контуры клеток, полученные от сегментации фазы контраст кадров, или от пятнать клеточных мембран, позволяют рассчитать мРНК копии номер распределения образец клеток с открытым исходным кодом или заказ программного обеспечения. Обозначая метод, описанный здесь может также применяться для изображения стенограммы с стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм).

Introduction

Stochasticity является фундаментальных и неизбежным аспектом экспрессии генов и приводит к ячейке неоднородность¹, как на уровне стенограммы и белки^2,3. Количественная оценка изменчивости между ячейками при четко определенных условиях открывает уникальный в основные процессы, которые лежат в основе экспрессии генов и его регулирования. Одним из важных источников неоднородности ячеек в бактерий происходит на уровне транскрипционный анализ. Стенограмма цифры варьируются не только благодаря stochasticity транскрипции, но и post-transcriptional процессы, такие как регулирование малых молекул РНК и RNAases². Одним из способов прямого доступа к этой неоднородности в количественных моды является дневно пометки отдельных стенограммы данного гена в smFISH. Эта методология позволяет обнаружение и локализация внутриклеточных конкретных молекул РНК в фиксированной,⁴отдельных бактериальной клетки. мРНК гибридизированных с набором дневно меченых ~ 20 база Лонг олигонуклеотиды, которые предназначены для привязки выборочно стенограммы интерес^5,6. Несколько маркировки обеспечивает обнаружение выше фона флуоресценции, и отдельные молекулы мРНК появляются как дифракционный пятна под флуоресцентным микроскопом⁷ (см. Рисунок 1). Существуют другие подходы для маркировки молекулы мРНК, в которых дополнительные олигомера зонды нести конъюгированных гаптенами (например, биотин или digoxigenin), которые обнаруживаются с помощью вторичных дневно меченых репортер методы⁸.

Существуют другие методы, которые обеспечивают количественной информации о стенограммы, в дополнение к smFISH. Некоторые, такие как Северная пятно или количественного PCR, зонд основная и таким образом можно измерить количество мРНК копий ни их позиции в отдельных клетках. Поэтому эти методы не подходят для количественного определения изменчивости к ячейке. Недавно на основе изображения метод, который позволяет для количественной оценки как копирование количество РНК в клетки, так и их внутриклеточного расположения, называется мультиплексированием ошибка надежные флуоресценции в situ гибридизация (MERFISH) был разработан. MERFISH основан на уступки уникальный штрих-код, состоящий из определенной комбинации из фиксированного числа дневно меченых олигонуклеотидных зондов. Эти штрих-коды зачитываются в последовательных раундов smFISH измерений, с Фотообесцвечивание ниже каждого раунда гибридизации, тем самым увеличивая пропускную способность на два порядка^9,10. Эта техника требует автоматизированных жидкости, обработка системы и надлежащего дизайн набора зонд.

Сочетание нескольких флуоресценции маркировки отдельных стенограмм, а также Роман суперразрешением методы, такие как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)¹¹, позволяет десятикратное увеличение в резолюции Локализация внутриклеточных стенограмм. В шторм подходящее сочетание флуоресцентных зондов и визуализации буфера позволяет несколько циклов флуоресценции выбросов на молекулу зонд (мигает). ШТОРМ может также использоваться для изображения транскриптом E. coli и наблюдать пространственной организации генома общесистемной РНК, путем маркировки одновременно все стенограммы интерес¹².

Все методы одноклеточных, рассмотренных выше основаны на визуализации стенограммы в стационарных клетках. Следовательно они не обеспечивают никакой информации относительно кинетических свойств стенограммы внутри клетки. Чтобы следовать стенограммы в живые клетки¹³, мРНК могут быть помечены сплавливанием гена интереса к массиву привязки сайтов. Эти последние затем распознаются RNA-связывая протеин, например бактериофага MS2 пальто белка, который сливается с флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)^10,14,15.

Здесь мы описываем метод для маркировки индивидуальных mRNAs с набором зондов дневно меченых ДНК, для использования в smFISH эксперименты, в частности в E. coli. Кроме того мы показываем, что та же схема маркировки могут быть использованы для измерения ШТОРМА с незначительными изменениями.

Protocol

1. зонд дизайн Примечание: Этот протокол использует коммерчески доступных олигонуклеотидных зондов, уже отмеченных флуорофоров. Датчики состоят из набора специфических последовательностей взаимодополняющие цели мРНК, каждый зонд конъюгированных к одной молекулы флуоресцентные. Кроме того это возможность прикрепления флуоресцентные маркеры зонды, как описано в других разделах5,16. Дизайн smFISH зонды с помощью зонда дизайнер16 алгоритм, разработанный Арджун рай (van Oudenaarden лаборатории, Массачусетский технологический институт); последовательности smFISH датчики, используемые в этой рукописи, перечислены в таблице материалов.Примечание: Минимальное количество зондов в наборе для обнаруженный сигнал составляет ~ 30. Точное число может варьироваться в зависимости от гена интереса, особенно если очень краткое стенограммы измеряются. Выберите краситель, который соответствует оптические установки (см. таблицу материалов).Примечание: Cy3 красителя или оптически эквивалент краска с низкой восприимчивости к фото отбеливание, настоятельно рекомендуется. Кандидат в двойной маркировки является Cy5 или оптически эквивалент красителя (см. таблицу материалов). Подходящие красители для ШТОРМА изображений помечены мРНК характеризуются их потенциала для нескольких циклов флуоресценции выбросов. Некоторые smFISH красители могут быть использованы для ШТОРМА изображений (см. таблицу материалов). Чтобы изображение двух (или более) стенограммы, соответствующих различных генов в одной ячейке, следует выбрать зонды олигонуклеотида, конъюгированных красители, чьи спектры имеют мало или нет дублирования. 2. Реагент подготовка Примечание: Важно хранить пробы, RNAse бесплатно с помощью свободной РНКазы расходных материалов например отфильтрованных наконечники и трубки и чтобы любой рабочей среды в чистоте. Во избежание деградации транскриптов целевой все реагенты используемые после фиксации клетки должна быть свободной от нуклеиназы (см. таблицу материалов) или Диэтилпирокарбонат (DEPC)-лечение и стерилизации. Буферы для smFISH Подготовьте свободный РНКазы ПБС (фосфатный буфер, решение с фосфатного буфера концентрации 0,01 М и концентрация хлорида натрия 0,154 М, (рН 7,4)). Разбавить бесплатно РНКазы PBS 10 x (см. таблицу материалов) в свободной от нуклеиназы воды (см. таблицу материалов) в 1:10 соотношение v/v. Можно также подготовить DEPC-лечение 1 x PBS. Подготовка, RNase бесплатно 2 x SSC (буфер солевой раствор натрия цитрата, 0.3 М NaCl в 0,03 М цитрат натрия, (рН 7,0)). Разбавить РНКазы бесплатно 20 x SSC (см. таблицу материалов) в свободной от нуклеиназы водой 1:10 соотношение v/v. Кроме того, готовить DEPC-лечение 2 x SSC. Олигонуклеотидных зондов Стоковый раствор. Повторно растворить смесь сушеных олигонуклеотида зонд в 200 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, pH 8.0) для создания запаса зонд 25 мкм. смесь хорошо, закупорить вверх и вниз, а затем вихря и центрифуги кратко. Чтобы избежать замораживания и оттаивания Стоковый раствор трубки, сделайте несколько аликвоты Стоковый раствор, соответствующая сумма будет использоваться в один экспериментальный запуск. Хранят раствор при температуре-20 ° C или ниже и защищать от света.Примечание: Зонд набор 5 нмоль может обеспечить до 250 реакций гибридизации. Гибридизация буфера (после Скиннер и др. 7 ): Добавьте 5 мл нуклеиназы свободной воды 50 мл полипропиленовые коническое дно трубки. Добавьте 1 g декстран сульфата в воде и растворить его в энергичной vortexing. Перемешайте содержимое в орбитальный шейкер, пока пузырьки исчезают (~ 30 мин). Добавьте в решение 3,530 мкл дейонизированной формамид, 10 мг E. coli tRNA, 1 мл 20 x SSC, 100 мкл, комплекса ванадила ribonucleoside 200 мм и 40 мкл 50 мг/мл BSA. Принесите окончательный объем до 10 мл добавлением DEPC-лечение водой или нуклеиназы свободной воды и вихревой решения до тех пор, пока это однородные.Примечание: Чтобы избежать замораживания и оттаивания решения, сделать несколько аликвоты Стоковый раствор, соответствующая сумма будет использоваться в один экспериментальный запуск. Хранят раствор при температуре-20 ° C. Убедитесь в том позволить формамид нагреть до комнатной температуры перед открытием бутылки. Для уменьшения фона, предлагается для калибровки оптимальный формамид концентрации (10-40% v/v соотношение). Осторожностью: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Формамид высокотоксичных и известный систему или тератогеном. Избегайте контакта с глазами и кожей, вдыхания или проглатывания. Обрабатывать его под вытяжной шкаф при ношении лабораторный халат и защитные перчатки. Стерилизуйте решение путем передачи его через фильтр 0,22 мкм. Оставайтесь на аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C до одного года. Подготовить фиксации буфера (4,6% формальдегида в однократном ПБС) путем добавления ПБС 37% формальдегида (v/v) (см. 2.1.1) v/v соотношение 1:8 и вихря.ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Формальдегид является высокотоксичным и известный канцероген. Обрабатывать его под вытяжной шкаф при ношении лабораторный халат и защитные перчатки. Подготовить мыть буфер для smFISH (20% формамида в 2 x SSC), добавив дейонизированной формамид 2 x SSC (см. 2.1.2) v/v соотношение 1:4 и вихря. Подготовка изображений буфер для smFISH, добавив 5 мм cysteamine и кислорода мусорщиков (7 мкм глюкозооксидаза, 56 Нм каталазы и 10% глюкозы (w/v)) мыть буфера (20% формамида в 2 x SSC) Буферы для ШТОРМА Подготовка буфера A, добавляя 50 мм трис-HCl и 10 мм NaCl нуклеиназы свободной воды.Примечание: Магазин на RT лет. Подготовка буфера B, добавляя 50 мм трис-HCl, 10 мм NaCl и 10% w/v глюкозы нуклеиназы свободной воды.Примечание: Хранить при 4 ° C на срок до одного года. Подготовьте МПС буфера путем растворения cysteamine 77 мг в 1 мл буфера A (делает решение 1 М).Примечание: Он может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц. Подготовка Gloxy буфера, добавив 8,440 AU (условные единицы) глюкозооксидазы и 70,200 AU каталазы в 1 мл буфера а.Примечание: Делает 50 x Стоковый раствор, он может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц. Подготовка изображений буфер для ШТОРМА, добавляя 50 мм МПС буфера и 1 x Gloxy буфера для буфера б.Примечание: Изображения буфера для ШТОРМА состоит из 5 мм cysteamine, мусорщиков кислорода (7 мкм глюкозооксидазы и 56 Нм каталаза) 50 мм трис с 10 мм NaCl и 10% глюкозы при pH 8.0. Подготовка перед изображений, она может храниться и использоваться на RT для приблизительно 2Н. 3. образец фиксации Расти бактериальной клетки (например, е.Коли MG1655) в средствах массовой информации роста выбор (например, средний LB) ночь Инан орбитальный шейкер на 260 об/мин и 37 ° C.Примечание: Для определения фона из-за привязки неспецифической зондов, измерения в штамм, в котором был удален гена интереса должны проводиться, следуя тем же процедурам (см. Δgalk вsodB Рисунок 1 и Δ в Рисунок 2). Разбавить ночь культуры масштаба 1: 100 в свежих средних и измерить его оптической плотности (600ОД) в спектрофотометре каждые ~ 1 ч, до значение 0,2 – 0,4; 4 мл культуры должно быть достаточно.Примечание: Если выбранный Микроскоп не имеют Фазовый контраст или возможности контраст дифференциальной помехи, E. coli наружной мембраны могут быть помечены с 2 мкм липофильных флуоресцентных маркеров (см. таблицу материалов), который следует добавить в бактериальная суспензия 20 мин до фиксации17. Фиксация и дальнейшего лечения осуществляется, как описано ниже. Должны позаботиться о том, чтобы выбрать маркер флуоресцентные, имея другой спектр излучения, чтобы свести к минимуму спектральных совпадения с надписью зонд набором. Пелле клетки центрифугированием на 5 мин на 4500 g при 4 ° C. Удалите супернатант из всех труб. Добавьте 1 mL ПБС к каждой пробке и Ресуспензируйте гранулы для сведения к минимуму к ячейке агрегации. Затем добавьте 4 мл фиксации буфера и вихревой мягко. Проинкубируйте образцы в орбитальный шейкер на 260 об/мин за 30 мин при температуре 24 ° C. Пелле клетки центрифугированием за 10 мин, 1000 г, 4 ° C. Удалите супернатант. Добавьте 1 mL ПБС. Передавать суспензий 1.8 мкл коническое дно микро-пробирок (см. таблицу материалов) и повторите шаг 3,6 дважды. 4. образец Permeabilization Очень тщательно удалите супернатант. Используйте небольшой объем пипетки, при необходимости удалить все жидкости вне гранулы. Ресуспензируйте в 300 мкл DEPC-лечение или нуклеиназы свободной воды. Добавить 350 мкл высококачественного абсолютного этанола (99%) и осторожно перемешать, инвертирование трубки. Мкл еще 350 этанола и смесь еще раз, чтобы достичь концентрации окончательный этанол 70% (v/v соотношение).ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Этанол является горючим. Вращать образец с трубки ротатор на 20 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре (RT), или на 4 ° C на ночь. Образцы могут храниться при температуре 4 ° C до одной недели. 5. Гибридизация Пелле клетки центрифугированием 7 мин, 750 x g, 4 ° C. Удалите супернатант. Добавьте 1 мл 20% мыть буфер для образцов и оставить стоя за несколько минут, или пипетки для полного растворения гранул. Пелле клетки центрифугированием за 7 мин., на 750 x g, 4 ° C. Очень осторожно удалите супернатант, закупорить. При необходимости удалить все жидкости вне гранулы используйте малообъемной пипетки. Добавить зондов олигонуклеотида равным Алиготе буфера гибридизации Стоковый раствор таким образом, чтобы концентрация окончательный олигонуклеотида 250 Нм; вихревой энергично.Примечание: Один можно пометить два или более различных целевых mRNAs сразу в той же ячейке. Добавление наборов зонд обеих целей в гибридизации буфер. Необходимо выбрать красители, имеющих различные спектры выбросов к минимуму спектральных дублирования (например, Cy3 и Cy5). Убедитесь, что образцы, предназначенные для ШТОРМА изображений гибридизированных с олигонуклеотида зонд, набор конъюгированные с подходящей краской для ШТОРМА (например, в таблице материалов). Приостановите образцов (см. шаг 5.4) в 50 мкл гибридизации буфер, который содержит зонды олигонуклеотида, избегая поколения пузыри (решение довольно вязкий). Оставьте на ночь образцы на горячей блок при 30 ° C в темноте.Примечание: После этого, образцы могут храниться на срок до 6 месяцев при 4 ° C. 6. мытье Используйте один новые пробки microcentrifuge для каждого образца изображения. Добавьте 1 мл мыть буфера. Мкл 10-15 от гибридизированные образцов новой трубы, содержащий буфер мыть и микс/Вортекс. Пелле клетки центрифугированием 7 мин, 750 x g при 4 ° C. Удалите супернатант.Примечание: Для уменьшения фона, Инкубируйте 1 час при температуре 30 ° C. Мыть два раза больше (Ресуспензируйте в 1 мл мыть буфера, центрифуги и удаление гранул). Ресуспензируйте 25 мкл буфера мытья.Примечание: Для того, чтобы уменьшить фото Отбеливание одного можно добавить в буфер мыть кислородной очистки системы (2.6) для повышения стабильности красителя в одной молекулы флуоресценции эксперименты6. 7. подготовка проб для изображений Примечание: Клетки должны быть иммобилизованным для обеспечения надлежащего изображений под микроскопом флуоресценции и фазово контрастной. Следующие методы могут использоваться для подготовки образцов, в которых различные поля зрения может отражаться на разные фокальной плоскости. Подготовка геля агарозы Добавьте агарозы 150 мг в 10 мл 2 x SSC буфер. Не добавляйте 2 x SSC агарозы, иначе он не будет правильно распустить. Микроволновая печь для 10-15 s каждый раз до тех пор, пока большие пузырьки начинают формироваться. Отложите остыть в течение нескольких минут. Место отделяя силиконовые рамка на слайде, так что центр слайд по-прежнему подвергаются. Место 10 мм широкий (толщиной 1-2 мм) жесткое кольцо в центре слайда и внесите небольшое количество геля в нем, для уплотнения. Подождите несколько минут для того чтобы затвердеть. Добавьте больше гель, пока не образуется высокой куполообразной формы. Подождите 10 минут для упрочнения для его и снимите кольцо (с помощью тонкой пинцета или любой другой метод). Депозит ~ 10 мкл промывают бактериальных клеток (см. 6.5) на гель и печать с coverslip слайд #0. Подготовка образца камеры для smFISH В качестве альтернативы (к шагу 7.1) подготовить образцы для изображений, иммобилизирующие промывают бактериальные клетки (см. 6.5) на поли D-лизин покрытием стекла дно одноразовые пластиковые Петри. Проинкубируйте образцы в темноте, при комнатной температуре, в ночь перед визуализацией, чтобы позволить адгезии клеток на поверхности. До визуализации раз промойте мыть буфера (. 5); Держите образец мокрые с мыть или buffer(2.5) или буфера для smFISH (2.6). Палата Пробоподготовка для ШТОРМА Подготовка образцов для ШТОРМА для изображений на поли D-лизин покрытием стекла дно одноразовые пластиковые Петри. Проинкубируйте образцы в темноте, на RT, на ночь. До визуализации мыть раз с мыть буфер для smFISH (2.5); и добавить изображения буфера для ШТОРМА (2.7.5). 8.Визуализация Стенограмма Изображение с оснащены моторизованного столика микроскопа-поля флуоресценции клеток (см. таблицу материалов).Примечание: Для ШТОРМА модификации, используйте помечены краска способна несколько циклов эмиссии флуоресценции клеток. Изображение образца с помощью 3D супер резолюции съемочной системы (например, см. таблицу материалов). Использование (рекомендуется) 60-100 x N.A > 1.3 масло погружения фазы контрастности объектива с мощным источником света, таких как ртуть или -металлогалогенные лампы; Также рекомендуются на основе Светодиодных источников света. Использование стандартного охлаждением ПЗС, идеально оптимизированный для уровня визуализации мычать свет, а не скорость (мы используем камеры с размером пикселя 16 мкм) (см. таблицу материалов).Примечание: Использование из охлажденной EMCCD (электрон, умножая сочетании заряда устройства) камеры CCD камеры необходимо уменьшить тепловой шум, который предотвращает обнаружение, особенно одной молекулы. Использовать фильтр задает для флуорофоров выбран. Чтобы правильно определить границы ячейки, получить изображения различных полей зрения каждого образца с фазы контраст оптики или маркировки дневно внешней клеточной мембраны. Получение изображений на различных фокальной плоскости (z стека) для всех каналов (обычно 13 фрагментов, разделенных 250 Нм принимаются).Примечание: Моторизованного столика микроскопа и наборы фильтров должны управляться коммерческими (см. таблицу материалов) или собственного программного обеспечения, которое может захватить стек изображений в последовательности. 9. анализ данных Преобразуйте стеки изображений в подходящий формат для анализа данных. Оценить количество целевой копии mRNA от общей интенсивности флуоресцентные очагов в ячейке, а не от подсчета дискретных «места» как и других имеющихся в настоящее время протоколов. Провести анализ изображений с открытым исходным кодом18 или по плану программы. Подробная Визуализация данных и анализа Скиннер и др. 7

Representative Results

Мы провели измерения smFISH galK и sodB стенограмм в клетках E. coli . Стенограммы были гибридизированных с набором специфических последовательностей в дополнение к последовательности целевых объектов, каждый зонд конъюгированных к одной молекулы флуоресцентные (см. табл…

Discussion

Мы измерили в нашей лаборатории Стенограмма количество различных генов в клетках E. coli , с помощью метода smFISH². Короче говоря, эта процедура состоит из следующих этапов: клетки фиксации, permeabilization мембран для проникновения щупа, зонд гибридизации и образцы изображений, и?…

Materials

Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker – Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen – Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 – 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24×60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagcgttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagcgttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa