Методическая статья

Метод для маркировки стенограммы в клетках отдельных кишечная палочка для одной молекулы флуоресценции в Situ гибридизация экспериментов

DOI:

10.3791/56600

⸱

21 декабря 2017 г.

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы датчиками дневно меченых ДНК, для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH — метод визуализации, который позволяет одновременного обнаружения, локализации и количественной оценки одной молекулы мРНК в фиксированных отдельных ячеек.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы в фиксированных бактерий для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH позволяет измерение к ячейке изменчивости в мРНК копировать количество генов интерес, а также субцеллюлярные расположение стенограммы. Основные шаги, фиксация культуры бактериальных клеток, permeabilization клеточных мембран и гибридизации целевой стенограммы с наборами коммерчески доступных короткие дневно меченых олигонуклеотидных зондов. smFISH может позволить изображения стенограммы нескольких генов в той же ячейке, с ограничения, налагаемые спектральных дублирования между различными флуоресцентных маркеров. После завершения протокола, показанная ниже клетки может быть легко образы с помощью микроскопа, в сочетании с камерой для низк интенсивности флуоресценции. Эти изображения, а также контуры клеток, полученные от сегментации фазы контраст кадров, или от пятнать клеточных мембран, позволяют рассчитать мРНК копии номер распределения образец клеток с открытым исходным кодом или заказ программного обеспечения. Обозначая метод, описанный здесь может также применяться для изображения стенограммы с стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stochasticity является фундаментальных и неизбежным аспектом экспрессии генов и приводит к ячейке неоднородность1, как на уровне стенограммы и белки2,3. Количественная оценка изменчивости между ячейками при четко определенных условиях открывает уникальный в основные процессы, которые лежат в основе экспрессии генов и его регулирования. Одним из важных источников неоднородности ячеек в бактерий происходит на уровне транскрипционный анализ. Стенограмма цифры варьируются не только благодаря stochasticity транскрипции, но и post-transcriptional процессы, такие как регулирование малых молекул РНК и RNAases2. Одним из способов прямого доступа к этой неоднородности в количественных моды является дневно пометки отдельных стенограммы данного гена в smFISH. Эта методология позволяет обнаружение и локализация внутриклеточных конкретных молекул РНК в фиксированной,4отдельных бактериальной клетки. мРНК гибридизированных с набором дневно меченых ~ 20 база Лонг олигонуклеотиды, которые предназначены для привязки выборочно стенограммы интерес5,6. Несколько маркировки обеспечивает обнаружение выше фона флуоресценции, и отдельные молекулы мРНК появляются как дифракционный пятна под флуоресцентным микроскопом7 (см. Рисунок 1). Существуют другие подходы для маркировки молекулы мРНК, в которых дополнительные олигомера зонды нести конъюгированных гаптенами (например, биотин или digoxigenin), которые обнаруживаются с помощью вторичных дневно меченых репортер методы8.

Существуют другие методы, которые обеспечивают количественной информации о стенограммы, в дополнение к smFISH. Некоторые, такие как Северная пятно или количественного PCR, зонд основная и таким образом можно измерить количество мРНК копий ни их позиции в отдельных клетках. Поэтому эти методы не подходят для количественного определения изменчивости к ячейке. Недавно на основе изображения метод, который позволяет для количественной оценки как копирование количество РНК в клетки, так и их внутриклеточного расположения, называется мультиплексированием ошибка надежные флуоресценции в situ гибридизация (MERFISH) был разработан. MERFISH основан на уступки уникальный штрих-код, состоящий из определенной комбинации из фиксированного числа дневно меченых олигонуклеотидных зондов. Эти штрих-коды зачитываются в последовательных раундов smFISH измерений, с Фотообесцвечивание ниже каждого раунда гибридизации, тем самым увеличивая пропускную способность на два порядка9,10. Эта техника требует автоматизированных жидкости, обработка системы и надлежащего дизайн набора зонд.

Сочетание нескольких флуоресценции маркировки отдельных стенограмм, а также Роман суперразрешением методы, такие как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)11, позволяет десятикратное увеличение в резолюции Локализация внутриклеточных стенограмм. В шторм подходящее сочетание флуоресцентных зондов и визуализации буфера позволяет несколько циклов флуоресценции выбросов на молекулу зонд (мигает). ШТОРМ может также использоваться для изображения транскриптом E. coli и наблюдать пространственной организации генома общесистемной РНК, путем маркировки одновременно все стенограммы интерес12.

Все методы одноклеточных, рассмотренных выше основаны на визуализации стенограммы в стационарных клетках. Следовательно они не обеспечивают никакой информации относительно кинетических свойств стенограммы внутри клетки. Чтобы следовать стенограммы в живые клетки13, мРНК могут быть помечены сплавливанием гена интереса к массиву привязки сайтов. Эти последние затем распознаются RNA-связывая протеин, например бактериофага MS2 пальто белка, который сливается с флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)10,14,15.

Здесь мы описываем метод для маркировки индивидуальных mRNAs с набором зондов дневно меченых ДНК, для использования в smFISH эксперименты, в частности в E. coli. Кроме того мы показываем, что та же схема маркировки могут быть использованы для измерения ШТОРМА с незначительными изменениями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. зонд дизайн

Примечание: Этот протокол использует коммерчески доступных олигонуклеотидных зондов, уже отмеченных флуорофоров. Датчики состоят из набора специфических последовательностей взаимодополняющие цели мРНК, каждый зонд конъюгированных к одной молекулы флуоресцентные. Кроме того это возможность прикрепления флуоресцентные маркеры зонды, как описано в других разделах5,16.

  1. Дизайн smFISH зонды с помощью зонда дизайнер16 алгоритм, разработанный Арджун рай (van Oudenaarden лаборатории, Массачусетский технологический институт); последовательности smFISH датчики, используемые в этой рукописи, перечислены в таблице материалов.
    Примечание: Минимальное количество зондов в наборе для обнаруженный сигнал составляет ~ 30. Точное число может варьироваться в зависимости от гена интереса, особенно если очень краткое стенограммы измеряются.
  2. Выберите краситель, который соответствует оптические установки (см. таблицу материалов).
    Примечание: Cy3 красителя или оптически эквивалент краска с низкой восприимчивости к фото отбеливание, настоятельно рекомендуется. Кандидат в двойной маркировки является Cy5 или оптически эквивалент красителя (см. таблицу материалов). Подходящие красители для ШТОРМА изображений помечены мРНК характеризуются их потенциала для нескольких циклов флуоресценции выбросов. Некоторые smFISH красители могут быть использованы для ШТОРМА изображений (см. таблицу материалов). Чтобы изображение двух (или более) стенограммы, соответствующих различных генов в одной ячейке, следует выбрать зонды олигонуклеотида, конъюгированных красители, чьи спектры имеют мало или нет дублирования.

2. Реагент подготовка

Примечание: Важно хранить пробы, RNAse бесплатно с помощью свободной РНКазы расходных материалов например отфильтрованных наконечники и трубки и чтобы любой рабочей среды в чистоте. Во избежание деградации транскриптов целевой все реагенты используемые после фиксации клетки должна быть свободной от нуклеиназы (см. таблицу материалов) или Диэтилпирокарбонат (DEPC)-лечение и стерилизации.

  1. Буферы для smFISH
    1. Подготовьте свободный РНКазы ПБС (фосфатный буфер, решение с фосфатного буфера концентрации 0,01 М и концентрация хлорида натрия 0,154 М, (рН 7,4)). Разбавить бесплатно РНКазы PBS 10 x (см. таблицу материалов) в свободной от нуклеиназы воды (см. таблицу материалов) в 1:10 соотношение v/v.
      1. Можно также подготовить DEPC-лечение 1 x PBS.
    2. Подготовка, RNase бесплатно 2 x SSC (буфер солевой раствор натрия цитрата, 0.3 М NaCl в 0,03 М цитрат натрия, (рН 7,0)). Разбавить РНКазы бесплатно 20 x SSC (см. таблицу материалов) в свободной от нуклеиназы водой 1:10 соотношение v/v.
      1. Кроме того, готовить DEPC-лечение 2 x SSC.
  2. Олигонуклеотидных зондов Стоковый раствор.
    1. Повторно растворить смесь сушеных олигонуклеотида зонд в 200 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, pH 8.0) для создания запаса зонд 25 мкм. смесь хорошо, закупорить вверх и вниз, а затем вихря и центрифуги кратко.
    2. Чтобы избежать замораживания и оттаивания Стоковый раствор трубки, сделайте несколько аликвоты Стоковый раствор, соответствующая сумма будет использоваться в один экспериментальный запуск. Хранят раствор при температуре-20 ° C или ниже и защищать от света.
      Примечание: Зонд набор 5 нмоль может обеспечить до 250 реакций гибридизации.
  3. Гибридизация буфера (после Скиннер и др. 7 ):
    1. Добавьте 5 мл нуклеиназы свободной воды 50 мл полипропиленовые коническое дно трубки. Добавьте 1 g декстран сульфата в воде и растворить его в энергичной vortexing. Перемешайте содержимое в орбитальный шейкер, пока пузырьки исчезают (~ 30 мин).
    2. Добавьте в решение 3,530 мкл дейонизированной формамид, 10 мг E. coli tRNA, 1 мл 20 x SSC, 100 мкл, комплекса ванадила ribonucleoside 200 мм и 40 мкл 50 мг/мл BSA. Принесите окончательный объем до 10 мл добавлением DEPC-лечение водой или нуклеиназы свободной воды и вихревой решения до тех пор, пока это однородные.
      Примечание: Чтобы избежать замораживания и оттаивания решения, сделать несколько аликвоты Стоковый раствор, соответствующая сумма будет использоваться в один экспериментальный запуск. Хранят раствор при температуре-20 ° C. Убедитесь в том позволить формамид нагреть до комнатной температуры перед открытием бутылки. Для уменьшения фона, предлагается для калибровки оптимальный формамид концентрации (10-40% v/v соотношение).
      Осторожностью: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Формамид высокотоксичных и известный систему или тератогеном. Избегайте контакта с глазами и кожей, вдыхания или проглатывания. Обрабатывать его под вытяжной шкаф при ношении лабораторный халат и защитные перчатки.
    3. Стерилизуйте решение путем передачи его через фильтр 0,22 мкм. Оставайтесь на аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C до одного года.
  4. Подготовить фиксации буфера (4,6% формальдегида в однократном ПБС) путем добавления ПБС 37% формальдегида (v/v) (см. 2.1.1) v/v соотношение 1:8 и вихря.
    ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Формальдегид является высокотоксичным и известный канцероген. Обрабатывать его под вытяжной шкаф при ношении лабораторный халат и защитные перчатки.
  5. Подготовить мыть буфер для smFISH (20% формамида в 2 x SSC), добавив дейонизированной формамид 2 x SSC (см. 2.1.2) v/v соотношение 1:4 и вихря.
  6. Подготовка изображений буфер для smFISH, добавив 5 мм cysteamine и кислорода мусорщиков (7 мкм глюкозооксидаза, 56 Нм каталазы и 10% глюкозы (w/v)) мыть буфера (20% формамида в 2 x SSC)
  7. Буферы для ШТОРМА
    1. Подготовка буфера A, добавляя 50 мм трис-HCl и 10 мм NaCl нуклеиназы свободной воды.
      Примечание: Магазин на RT лет.
    2. Подготовка буфера B, добавляя 50 мм трис-HCl, 10 мм NaCl и 10% w/v глюкозы нуклеиназы свободной воды.
      Примечание: Хранить при 4 ° C на срок до одного года.
    3. Подготовьте МПС буфера путем растворения cysteamine 77 мг в 1 мл буфера A (делает решение 1 М).
      Примечание: Он может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.
    4. Подготовка Gloxy буфера, добавив 8,440 AU (условные единицы) глюкозооксидазы и 70,200 AU каталазы в 1 мл буфера а.
      Примечание: Делает 50 x Стоковый раствор, он может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.
    5. Подготовка изображений буфер для ШТОРМА, добавляя 50 мм МПС буфера и 1 x Gloxy буфера для буфера б.
      Примечание: Изображения буфера для ШТОРМА состоит из 5 мм cysteamine, мусорщиков кислорода (7 мкм глюкозооксидазы и 56 Нм каталаза) 50 мм трис с 10 мм NaCl и 10% глюкозы при pH 8.0. Подготовка перед изображений, она может храниться и использоваться на RT для приблизительно 2Н.

3. образец фиксации

  1. Расти бактериальной клетки (например, е.
Коли MG1655) в средствах массовой информации роста выбор (например, средний LB) ночь Инан орбитальный шейкер на 260 об/мин и 37 ° C.
Примечание: Для определения фона из-за привязки неспецифической зондов, измерения в штамм, в котором был удален гена интереса должны проводиться, следуя тем же процедурам (см. Δgalk вsodB Рисунок 1 и Δ в Рисунок 2).
  • Разбавить ночь культуры масштаба 1: 100 в свежих средних и измерить его оптической плотности (600ОД) в спектрофотометре каждые ~ 1 ч, до значение 0,2 - 0,4; 4 мл культуры должно быть достаточно.
    Примечание: Если выбранный Микроскоп не имеют Фазовый контраст или возможности контраст дифференциальной помехи, E. coli наружной мембраны могут быть помечены с 2 мкм липофильных флуоресцентных маркеров (см. таблицу материалов), который следует добавить в бактериальная суспензия 20 мин до фиксации17. Фиксация и дальнейшего лечения осуществляется, как описано ниже. Должны позаботиться о том, чтобы выбрать маркер флуоресцентные, имея другой спектр излучения, чтобы свести к минимуму спектральных совпадения с надписью зонд набором.
  • Пелле клетки центрифугированием на 5 мин на 4500 g при 4 ° C. Удалите супернатант из всех труб.
  • Добавьте 1 mL ПБС к каждой пробке и Ресуспензируйте гранулы для сведения к минимуму к ячейке агрегации. Затем добавьте 4 мл фиксации буфера и вихревой мягко.
  • Проинкубируйте образцы в орбитальный шейкер на 260 об/мин за 30 мин при температуре 24 ° C.
  • Пелле клетки центрифугированием за 10 мин, 1000 г, 4 ° C. Удалите супернатант. Добавьте 1 mL ПБС.
  • Передавать суспензий 1.8 мкл коническое дно микро-пробирок (см. таблицу материалов) и повторите шаг 3,6 дважды.

    • 4. образец Permeabilization

    1. Очень тщательно удалите супернатант. Используйте небольшой объем пипетки, при необходимости удалить все жидкости вне гранулы.
    2. Ресуспензируйте в 300 мкл DEPC-лечение или нуклеиназы свободной воды. Добавить 350 мкл высококачественного абсолютного этанола (99%) и осторожно перемешать, инвертирование трубки. Мкл еще 350 этанола и смесь еще раз, чтобы достичь концентрации окончательный этанол 70% (v/v соотношение).
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Этанол является горючим.
    3. Вращать образец с трубки ротатор на 20 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре (RT), или на 4 ° C на ночь. Образцы могут храниться при температуре 4 ° C до одной недели.

    5. Гибридизация

    1. Пелле клетки центрифугированием 7 мин, 750 x g, 4 ° C. Удалите супернатант.
    2. Добавьте 1 мл 20% мыть буфер для образцов и оставить стоя за несколько минут, или пипетки для полного растворения гранул.
    3. Пелле клетки центрифугированием за 7 мин., на 750 x g, 4 ° C.
    4. Очень осторожно удалите супернатант, закупорить. При необходимости удалить все жидкости вне гранулы используйте малообъемной пипетки.
    5. Добавить зондов олигонуклеотида равным Алиготе буфера гибридизации Стоковый раствор таким образом, чтобы концентрация окончательный олигонуклеотида 250 Нм; вихревой энергично.
      Примечание: Один можно пометить два или более различных целевых mRNAs сразу в той же ячейке. Добавление наборов зонд обеих целей в гибридизации буфер. Необходимо выбрать красители, имеющих различные спектры выбросов к минимуму спектральных дублирования (например, Cy3 и Cy5). Убедитесь, что образцы, предназначенные для ШТОРМА изображений гибридизированных с олигонуклеотида зонд, набор конъюгированные с подходящей краской для ШТОРМА (например, в таблице материалов).
    6. Приостановите образцов (см. шаг 5.4) в 50 мкл гибридизации буфер, который содержит зонды олигонуклеотида, избегая поколения пузыри (решение довольно вязкий).
    7. Оставьте на ночь образцы на горячей блок при 30 ° C в темноте.
      Примечание: После этого, образцы могут храниться на срок до 6 месяцев при 4 ° C.

    6. мытье

    1. Используйте один новые пробки microcentrifuge для каждого образца изображения. Добавьте 1 мл мыть буфера.
    2. Мкл 10-15 от гибридизированные образцов новой трубы, содержащий буфер мыть и микс/Вортекс.
    3. Пелле клетки центрифугированием 7 мин, 750 x g при 4 ° C. Удалите супернатант.
      Примечание: Для уменьшения фона, Инкубируйте 1 час при температуре 30 ° C.
    4. Мыть два раза больше (Ресуспензируйте в 1 мл мыть буфера, центрифуги и удаление гранул).
    5. Ресуспензируйте 25 мкл буфера мытья.
      Примечание: Для того, чтобы уменьшить фото Отбеливание одного можно добавить в буфер мыть кислородной очистки системы (2.6) для повышения стабильности красителя в одной молекулы флуоресценции эксперименты6.

    7. подготовка проб для изображений

    Примечание: Клетки должны быть иммобилизованным для обеспечения надлежащего изображений под микроскопом флуоресценции и фазово контрастной. Следующие методы могут использоваться для подготовки образцов, в которых различные поля зрения может отражаться на разные фокальной плоскости.

    1. Подготовка геля агарозы
      1. Добавьте агарозы 150 мг в 10 мл 2 x SSC буфер. Не добавляйте 2 x SSC агарозы, иначе он не будет правильно распустить.
      2. Микроволновая печь для 10-15 s каждый раз до тех пор, пока большие пузырьки начинают формироваться. Отложите остыть в течение нескольких минут.
      3. Место отделяя силиконовые рамка на слайде, так что центр слайд по-прежнему подвергаются.
      4. Место 10 мм широкий (толщиной 1-2 мм) жесткое кольцо в центре слайда и внесите небольшое количество геля в нем, для уплотнения. Подождите несколько минут для того чтобы затвердеть.
      5. Добавьте больше гель, пока не образуется высокой куполообразной формы. Подождите 10 минут для упрочнения для его и снимите кольцо (с помощью тонкой пинцета или любой другой метод).
      6. Депозит ~ 10 мкл промывают бактериальных клеток (см. 6.5) на гель и печать с coverslip слайд #0.
    2. Подготовка образца камеры для smFISH
      1. В качестве альтернативы (к шагу 7.1) подготовить образцы для изображений, иммобилизирующие промывают бактериальные клетки (см. 6.5) на поли D-лизин покрытием стекла дно одноразовые пластиковые Петри.
      2. Проинкубируйте образцы в темноте, при комнатной температуре, в ночь перед визуализацией, чтобы позволить адгезии клеток на поверхности. До визуализации раз промойте мыть буфера (. 5); Держите образец мокрые с мыть или buffer(2.5) или буфера для smFISH (2.6).
    3. Палата Пробоподготовка для ШТОРМА
      1. Подготовка образцов для ШТОРМА для изображений на поли D-лизин покрытием стекла дно одноразовые пластиковые Петри.
      2. Проинкубируйте образцы в темноте, на RT, на ночь. До визуализации мыть раз с мыть буфер для smFISH (2.5); и добавить изображения буфера для ШТОРМА (2.7.5).

    8.Визуализация Стенограмма

    1. Изображение с оснащены моторизованного столика микроскопа-поля флуоресценции клеток (см. таблицу материалов).
      Примечание: Для ШТОРМА модификации, используйте помечены краска способна несколько циклов эмиссии флуоресценции клеток. Изображение образца с помощью 3D супер резолюции съемочной системы (например, см. таблицу материалов).
    2. Использование (рекомендуется) 60-100 x N.A > 1.3 масло погружения фазы контрастности объектива с мощным источником света, таких как ртуть или -металлогалогенные лампы; Также рекомендуются на основе Светодиодных источников света.
    3. Использование стандартного охлаждением ПЗС, идеально оптимизированный для уровня визуализации мычать свет, а не скорость (мы используем камеры с размером пикселя 16 мкм) (см. таблицу материалов).
      Примечание: Использование из охлажденной EMCCD (электрон, умножая сочетании заряда устройства) камеры CCD камеры необходимо уменьшить тепловой шум, который предотвращает обнаружение, особенно одной молекулы.
    4. Использовать фильтр задает для флуорофоров выбран.
    5. Чтобы правильно определить границы ячейки, получить изображения различных полей зрения каждого образца с фазы контраст оптики или маркировки дневно внешней клеточной мембраны. Получение изображений на различных фокальной плоскости (z стека) для всех каналов (обычно 13 фрагментов, разделенных 250 Нм принимаются).
      Примечание: Моторизованного столика микроскопа и наборы фильтров должны управляться коммерческими (см. таблицу материалов) или собственного программного обеспечения, которое может захватить стек изображений в последовательности.

    9. анализ данных

    1. Преобразуйте стеки изображений в подходящий формат для анализа данных.
    2. Оценить количество целевой копии mRNA от общей интенсивности флуоресцентные очагов в ячейке, а не от подсчета дискретных «места» как и других имеющихся в настоящее время протоколов.
    3. Провести анализ изображений с открытым исходным кодом18 или по плану программы. Подробная Визуализация данных и анализа Скиннер и др. 7

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы провели измерения smFISH galK и sodB стенограмм в клетках E. coli . Стенограммы были гибридизированных с набором специфических последовательностей в дополнение к последовательности целевых объектов, каждый зонд конъюгированных к одной молекулы флуоресцентные (см. таблицу материалов). Флуоресценции и фазы контраст изображения MG1655 одичал типа штамм E. coli (WT) или JW0740 (Keio коллекции)19 galK исключить деформации (ΔgalK) подвергают...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы измерили в нашей лаборатории Стенограмма количество различных генов в клетках E. coli , с помощью метода smFISH2. Короче говоря, эта процедура состоит из следующих этапов: клетки фиксации, permeabilization мембран для проникновения щупа, зонд гибридизации и образцы изображений, используя стандартный флуоресцентным микроскопом. Эта процедура основана на ранее опубликованные те, с некоторыми изменениями по6,7,

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Эта работа была поддержана Израиль научного фонда Грант 514415 (и.с.) и BSF-NSF (MCB) Грант 2016707 (и.с.). Поддержка Зигфрид и Ирма Ульман, также признается профессорской кафедры (чтобы и.с.).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Декстран сульфат натриевой солиSigma-AldrichD8906
    Чистый этанол, 99,5%, реагент ACS, абсолютныйMallinckrodt Baker - Avantor8025.25
    Диэтилпирокарбонат (DEPC)Sigma-AldrichD5758
    РНКаза без РНКазы 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
    РНКаза без РНКазы 10XPBS Life Technologies/AmbionAM9625
    TE буфер (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) BioUltra, для молекулярной биологииSigma-Aldrich93283
    вода без нуклеазThermo Fisher Scientific10977035
    Раствор формальдегида для молекулярной биологии, 36,5-38% в водеSigma-AldrichF8775
    Деионизированный формамид, без нуклеазThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
    тРНК E. coli (рибонуклеиновая кислота, тип переноса xx из эшерихии)Sigma-AldrichR1753-500UN
    UltraPure BSA (50 мг/мл)Thermo Fisher Scientific/AmbionAM2616
    Ванадил-рибонуклеозидный комплекс, VRC, 200 мМNew England BiolabS1402S
    Poly-L-лизинSigmaP4707
    Цистеамин и кислородSigma-Aldrich30070
    Глюкозооксидаза из Aspergillus niger, тип VII, 50KUSigma-AldrichG2133
    КаталазаSigma-AldrichC40
    D-глюкозаSigma-AldrichG8270
    D-фукозаSigma-AldrichF8150
    Vybrant DiO Раствор для мечения клетокLife ТехнологииV2286
    Агарозный, легкоплавкий реагентSigma-AldrichA9414
    Клейкий силиконовый изолятор 24-2 мм Диаметр X 1,8 мм Глубина JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 666208
    покрытый поли-D-лизином стеклянный дно Чашки для культурыMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
    Нитриловые неопудренные смотровые перчатки Super lifeSupermaxTC-N-9889
    Фирменная стерилизационная лента для инкубатораSigma-AldrichBR61750
    Микроцентрифужные пробирки (1,8 мл)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
    Falcon полипропиленовые пробирки с круглым дном (14 мл)BD Biosciences352059
    Центрифуга с коническим дном полипропилен пробирки (50 мл)Corning
    (Corning 5 мл)Corning Life Sciences4051
    (Corning 10 мл)Corning Life Sciences4488
    (Corning 25 мл)Corning Life Sciences4251
    Sarstedt67.742
    Наконечники для пипеток без РНКазы 0,2 - 20 мкм; lFroggaBioFT20
    Наконечники для пипеток без РНКазы 10 - 200 мкм; lAxigene/corningTF-200
    РНКаза наконечники для пипеток 100 - 1000 μ lFroggaBioFT1000
    РНКаза наконечники для пипеток 100 - 1000 lSorenson14200
    Шприц диспозилит 10 мл игла G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
    Minisart 0,2 мкм Шприцевой фильтрSartorius16534 K Nikon
    instruments микроскоп тип A погружное масло A, 8ccNikonMXA20233
    предметные стекла для микроскопа 76 x26, 3"x1"x1 ммThermo Fisher Scientific421-004ET
    #0 Покровная горка 24x60Thermo Fisher Scientific/MenzelBNBB024060A0
    Орбитальный шейкерM.R.CTOU-50
    Горячий блокM.R.C
    VortexFried Electric CompanyG-560-E
    МикроцентрифугаEppendorf5427R
    ЦентрифугаEppendorf5810R
    Портативный Pipet-Aid XP2, контроллер пипеткиDrummond Scientific Company4-000-501-I
    OD600 Спектрофотометр для измерения скорости роста бактерий DiluPhotometerMidsciOD600-10
    iXon X3 EMCCD камераAndorDU-897E-CS0-#BV
    Eclipse Ti микроскопNikonMEA53100
    CFI plan apochromat DM 100X масляный объектив лямбда PH-3 N.A 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
    Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; ЭМ - ЭТ620/60М; BS - T570LPНабор фильтров Nikon49005
    (CY5): EX - ET640/30X; ЭМ - ЭТ690/50М; BS - T660PNikon49009
    Nis-элементы AR программное обеспечение для автоматического восстановленияNikonMQS31000
    STORM микроскопVutaraSR-200
    NA 1.2 водный иммерсивный объектив Olympus
    SRX программное обеспечение для сбора и анализа изображенийVutara
    Evolve 512 EMCCDФотометрия
    Stellaris® Зонды FISH, индивидуальные анализы с CAL Fluor® Red 590 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
    Probe Последовательность для мРНК galK:
    gtgttttttttctttcagactc
    tagccaaatgcgttggcaaa
    ctgaatggtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtc
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtgcacaactgacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgattttcataatcggct
    gtttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacacacac
    gggtacgtttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacgcg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgcgcaacagcgttgaac
    ggcgttttcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctctaccagagt
    acctttgtcgccacacag
    ggatcagcgcgacgatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctttttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    Stellaris® Зонды FISH, индивидуальный анализ с помощью Quaser Fluor® Red 670 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
    Probe Последовательность для мРНК sodB:
    gtgttttttttcagactc
    tagccaaatgcgttggcaaa
    ctgaatggtgtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtc
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtgcacaactgacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgattttcataatcggct
    gtttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacacacac
    gggtacgtttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacgcg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgcgcaacagcgttgaac
    ggcgttttcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctctaccagagt
    acctttgtcgccacacag
    ggatcagcgcgacgatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctttttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    Серологические пипетки 430828 Серологические пипетки Серологические пипетки Кюветы для спектрофотометра gcatcgagggaaaaactcgtc gcatcgagggaaaaactcgtc

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
    2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    3. Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
    4. van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).
    5. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
    6. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
    7. Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
    8. Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).
    9. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
    10. van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
    11. Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
    12. Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
    13. Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
    14. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
    15. Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
    16. So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
    17. Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
    18. Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
    19. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).
    20. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    21. Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

    Похожие статьи