Методическая статья

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

14.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56613

⸱

2 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

В этой статье

Краткое содержание

Гидродинамические хвост инъекции Вену векторов интеграции на основе transposon позволяет Трансфекция стабильная мышиных гепатоцитов в vivo. Здесь мы представляем практический протокол transfection систем, позволяющий долгосрочный учредительный выражение одного трансген или комбинированных учредительных и доксициклин индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый в печени.

Аннотация

В модели исследования рака печени, регенерации, воспаление и фиброз гибкие системы в vivo экспрессии генов и глушителей являются весьма полезными. Гидродинамические хвост инъекции Вену конструкций на основе transposon является эффективным методом для генетических манипуляций гепатоцитов в взрослых мышей. Помимо выражения учредительный трансген эта система может использоваться для более сложных приложений, таких как индуцируемый опосредованной генов нокдаун, последствия ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы, чтобы вызвать мутации гена, или индуцибельной систем. Здесь сочетание учредительный CreER выражения вместе с индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый выбора представлен как пример этой техники. Мы покрываем многоступенчатого процедуры, начиная от подготовки Спящая красавица-transposon конструкции, инъекции и лечении мышей и подготовка ткани печени для анализа на иммуноокрашивания. Представлена система-это надежный и эффективный подход к достижению сложных генетических манипуляций в гепатоцитах. Он специально полезна в сочетании с КРР/loxP основанный мыши штаммов и может применяться для различных моделей в исследовании болезни печени.

Введение

Хронические заболевания печени представляет основных медицинских бремя мира1. Исследования животных моделей являются важнейшими инструментами в исследовании болезни печени и помогли ответить на сложные вопросы в регенерации печени, печеночная воспаление и стеатоз, а также рака печени2. Значительное количество этих животных моделей полагаются на генетической модификации клеток печени. Таким образом эффективные инструменты для манипулирования экспрессии генов в гепатоцитах являются полезным3. Установленные методы селекции штаммов генетически модифицированные мыши или поколения вирусных векторов для гепатоцитов инфекции являются либо времени, гавань проблем безопасности, или дают бедным трансген выражение в гепатоциты в естественных условиях 4 , 5. инъекции Вену гидродинамических хвост (HTVI)-это альтернативный метод для в vivo трансфекции гепатоцитов, позволяя легко, быстро и экономически эффективных допрос функции гена в печени. Для HTVI вектор, перевозящих желаемой последовательности ДНК растворяется в объеме физраствора, соответствует 10% от массы тела животного вводят. Решение затем вводят в Вену хвост в течение 5-10 s6. Превышение сердечного выброса, солевой раствор вытекает из нижней полой вены в печени Вены, ведущих к расширению печени и гидродинамические трансфекции гепатоцитов7. Для достижения стабильного геномной интеграции, метод была объединена с transposon основе векторов, например Спящая красота -transposon системы. Эта систем опосредует рекомбинации целевой векторов с сайтов геномной рекомбинации, катализируемые Спящая красота -Транспозаза8,9. Для моделей фиброз печени или канцерогенеза желательно часто overexpress или молчание генов в определенные моменты времени модели болезни. Для этой цели, инструменты для экспрессии генов индуцибильный как LoxP/Cre системы или тетрациклин inducible gene выражение системы (тет-на) может быть используемые10.

Здесь мы описываем протокол в vivo трансфекции мышиных гепатоцитов, используя HTVI системы на базе transposon Спящая красавица . Помимо протокола для стабильного, учредительный выражение трансген под контролем печени конкретной промоутера, мы опишем более продвинутые векторная система, которая объединяет учредительный тамоксифен зависимых Cre рекомбиназа (CreER) выражение с индуцибельной выражение трансген или адаптированных микроРНК индуцируемый (мир индуцируемый), называется pTC тет системы11. В этой системе вектор в основу вектор с recombinational клонирования системы, что позволяет быстро и легко поколения новых векторов12клонируются индуцибельной трансгенов или мир процессируются тетрациклин зависимой выражения. Это видео на основе руководство охватывает подготовку подходящих векторов, инъекции и лечения мышей для достижения индуцибельной трансген/мир индуцируемый выражение и, наконец, подготовка ткани печени для анализа. Чтобы включить сочетание любых Cre/loxP при посредничестве системы мыши с выражением или нокдаун гена любого выбора, что делает его широко применяются системы исследований заболеваний печени был разработан метод, описанный в настоящем Протоколе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных и были утверждены ответственные власти (Oberbayern фон Regierung, Мюнхен, Германия и Стэнфорд институциональный уход за животными и использовать Комитет, Стэнфорд, Калифорния, США). Список всех плазмиды для клонирования (шаг 1 до 4) предоставляется в дополнительной таблице S1.

1. клонирование трансген для экспрессии генов учредительного

  1. Дизайн праймеров для трансген амплификации13,14.
  2. Добавление места ограничения для Голд (TTAATTAA)' конец 5 праймера вперед. Добавьте ' конец 5 праймера обратный места ограничения для AscI (GGCGCGCC) или ФГОУ (GGCCGGCC).
  3. Усилить трансген методом ПЦР с использованием условий, оптимизированный для желаемого трансген14. Очищают, использование коммерчески доступных комплект очистки ДНК.
    Примечание: Отжиг время зависит грунты, предназначенные на этапе 1.1., удлинение времени зависит от длины конструкции. Например для построения 1000 bp длины использования 60 s удлинение времени.
  4. Дайджест трансген и вектор для учредительного ген выражение15 с nucleases соответствующих ограничений (см. шаг 1.2) и буфер в суммарный объем 50 мкл при 37 ° C на ночь. Например, дайджест конструкция с 5 единиц Голд и 5 единиц ФГОУ при необходимости (см. шаг 1.2).
  5. Гель Очистить переваривается вектор и вставки с помощью набора извлечения коммерческих гель согласно инструкциям производителя. Выполнение стандартного лигирование 100 ng вектора и 100 – 1000 ng вставки с помощью 400 U T4 инактивирует лигаза на 14 ° C для 16 h. тепла при 65 ° C для 10 мин.
  6. Трансформировать компетентным бактерий, используя стандартный тепло шок протокол16.
  7. Плиты на агаре пластины содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубируйте на 30 ° C в течение 24 ч.
  8. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК с использованием коммерческих алкалический комплекта согласно инструкциям производителя и проверить последовательность Сэнгер последовательности17 (секвенирование грунтовка: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
  9. Использование положительных колоний для макси масштаб амплификации плазмидной ДНК и очистить с помощью свободных эндотоксина плазмидные комплект подготовки18 согласно инструкциям производителя.
  10. Конструкция готова для инъекций, таким образом, перейдите к шагу 5.

2. клонирование трансген для экспрессии генов индуцибильный

  1. Дизайн праймеров для трансген амплификации13,14.
  2. Добавление места ограничения для SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) или KpnI (GGTACC)' конец 5 праймера вперед. Добавьте ' конец 5 праймера обратный места ограничения для персо (GCGGCCGC) или XhoI (CTCGAG).
  3. Усилить трансген методом ПЦР с использованием условий, оптимизированный для желаемого трансген14. Очищают с помощью коммерческого kit очистка ДНК.
  4. Дайджест очищенный трансген и 4 мкг вектора входа (pEN_TTmcs-вектор, смотрите Таблицу материалы)19 отдельно с соответствующим ограничением nucleases (см. шаг 2.2) и буфер в суммарный объем 50 мкл при 37 ° C в одночасье.
  5. Гель Очистить переваривается вектор и вставки с помощью набора извлечения коммерческих гель согласно инструкциям производителя. Выполнение стандартных перевязки с 100 ng вектора и 100 – 1000 ng вставки с помощью 400 U T4 инактивирует лигаза на 14 ° C для 16 h. тепла при 65 ° C для 10 мин.
  6. Трансформировать компетентным бактерий, используя стандартный тепло шок протокол16.
  7. Плиты на агаре пластины содержащего гентамицин 15 мкг/мл. Инкубируйте при 37 ° C для 16 h.
  8. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК и проверить вставка последовательности17 с использованием pCEP вперед грунтовка: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
    Примечание: ПЦР на одной колонии могут выполняться без предварительной очистки с грунтовки pCEP вперед и обратного pCEP (5' Ага AAG КТГ GGT CTA Гат УВД ВРЧ 3'). Этот шаг может полезно для предварительного отбора положительных колоний.
  9. Перейдите к шагу 4.

3. клонирование из мир индуцируемый для Inducible Gene НОК-Даун

  1. Дизайн мир индуцируемый олигонуклеотиды согласно pSLIK клонирования19протокола. Отжиг и очищают олигонуклеотиды и разбавить 1:20 в ddH2O.
  2. Дайджест 3 мкг вектора входа с 5 U BfuAI при 50 ° C, 3 часа, затем инактивирует реакции при 65 ° C для 20 мин.
    Примечание: Если совместное выражение зеленого флуоресцентного белка (КГВ), использование pEN_TTGmiRc19 как вектор входа, в противном случае использовать pEN_TTmiRc219.
  3. Гель Очистить переваривается вектор как шаг 2,5. Выполнение стандартных лигирование 100 ng вектора и 1 мкл очищенной и разбавляют индуцируемый олигонуклеотиды (шаг 3.1) с помощью 400 U T4 лигаза при комнатной температуре в течение 1 ч. тепловой инактивации при 65 ° C для 10 мин.
  4. Трансформировать компетентным бактерий, используя стандартный тепло шок протокол16.
  5. Плиты на агаре пластины содержащего гентамицин 15 мкг/мл. Инкубируйте при 37 ° C для 16 h.
  6. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК и проверить Вставка, Сэнгер последовательности17 (секвенирование грунтовка: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
  7. Перейдите к шагу 4.

4. recombinational клонирования для создания клонов готова для инъекций

  1. Смесь 150 ng вектора входа (от шаг 2 и шаг 3) и 150 нг pTC тет вектор20.
  2. Добавьте буфер TE суммарный объем 8 мкл (рН = 8).
  3. Передача смеси ферментов LR-clonase II (см. Таблицу материалы) на лед, проинкубируйте 2 мин Vortex дважды.
  4. 2 мкл LR-clonase фермент смесь II реакции и инкубировать при 25 ° C в течение 1 ч.
  5. Остановите реакции, добавив 1 мкл протеиназы K-решения. Инкубируйте при 37 ° C за 10 мин.
  6. Преобразование Stbl3 компетентным бактерий с 2 мкл recombinational клонирования смешать с использованием стандартной тепло шок протокол16.
  7. Плиты на агаре пластины содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубируйте на 30 ° C в течение 24 ч.
  8. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК с помощью свободных эндотоксина плазмидные комплект подготовки18 согласно инструкциям производителя и подтвердить целостность вектор Сэнгер последовательности17 (секвенирование грунтовка 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
  9. Конструкция готова для инъекций, перейдите к шагу 5.

5. Подготовка раствор для инъекции Вену гидродинамических хвост

Примечание: Подготовка конструкций для экспрессии генов учредительных и индуцибельной описаны в шаге 1, 2, 3 и 4.

  1. Подготовить стерильного 0,9% физиологического раствора для инъекций (делать не использовать PBS). Используйте том, соответствующий около 10% от массы тела мыши. Пример: для мыши, массой 20 г, подготовьте 2 мл раствора.
  2. Подготовьте инъекции векторов, которые были очищены с помощью свободных эндотоксина плазмидные очистки комплект18 (см. шаг 1.8 или 4,8, соответственно).
  3. Добавить 10 мкг или 15 мкг эндотоксинов бесплатно Спящая красавица конструкции вектора (из шага 1 использование 10 мкг, от шаг 4 Использование 15 мкг, соответственно) и 1 мкг эндотоксинов бесплатные pc-HSB521 мл стерильного физиологического раствора.
  4. Хранят раствор для до 4 ч при 4 ° C. Не замораживать.

6. выполнение гидродинамических хвост инъекции Вену

  1. Используйте фиксатор для инъекции Вену хвост (коммерческие или подготовленных от 50 мл Конические трубки с отверстиями для дыхания и хвост). Заполните нижней части трубки с папиросной бумаги.
  2. Для инъекций Используйте мышь около 8 – 10 недель возраста с весом 20-25 г.
  3. Взвешивание мышей до инъекции и подготовить объем впрыска в зависимости от веса (соответствует 10% от веса тела, см. шаг 5.1). Подготовьте стерильные 3 мл шприц с иглой 27 G для инъекций и залейте требуемый объем.
  4. Поместите указатель мыши в фиксатор. Регулировать количество папиросной бумаги (см. шаг 6.1) оставить только минимальное пространство для движения, но достаточно места для дыхания.
  5. Убедитесь, что мышь дышать регулярно.
  6. Теплый хвост, с помощью инфракрасных ламп для 30-60 s. тщательно следите за признаки перегрева.
  7. Очистите хвост с спиртом.
  8. Вставьте иглу почти горизонтально либо один из двух боковых хвост вен близко к основанию хвоста.
    Примечание: Если установлен успешно, небольшое количество крови может вытекать обратно в конус иглы. Не рекомендуется активно аспирационная как любое дополнительное движение иглы может привести к его перемещения и/или травмы Вены.
  9. Придать общий объем в Вену хвост в течение 8-10 s.
  10. Немедленно удалите мышь из фиксатор. Сжимать инъекции раной для по крайней мере 30 s или до тех пор, пока любое кровотечение спадает.
  11. Поместите указатель мыши в отдельной клетке. Как только мышь оправился от процедуры (около 30-60 мин), передача мыши обратно в его оригинальной клетку. Проверить на мыши регулярно для последующих 24 часов.
    Примечание: Умеренный седативный эффект мыши обычно наблюдается до 2 ч после инъекции.
  12. Прежде чем продолжить дальнейшие эксперименты (т.е., шаг 7), подождите 10-15 дней для оформления неинтегрированный векторов.

7. индукция Transfected CreER тамоксифен

Предупреждение: Тамоксифен вредно, могут быть злокачественными или нанести ущерб плодовитости. Пожалуйста, обратитесь к лист данным по безопасности.

  1. План тамоксифен внутрибрюшинной инъекции в течение трех дней подряд.
  2. День 1 Растворите 10 мг тамоксифен в 40 мкл этанола. Инкубируйте на 55 ° C для 10 min. Vortex несколько раз, пока не растворится тамоксифен.
  3. Добавление 960 мкл кукурузное масло. Инкубируйте на 5 минут при температуре 55 ° C. Вихревой несколько раз, чтобы получить ясное решение.
  4. Приготовляют раствор в 1-мл инсулина шприц с иглой 27 G.
  5. Загривок мыши, захватывая шею мыши тщательно с пальца и второй палец, фиксации хвост между база руки и четвертый и пятый палец.
  6. Inject 0,1 мл (= 1 мг тамоксифен) решения внутрибрюшинно в левом нижнем квадранте живота.
  7. Повторяйте инъекции на дни 2 и 3.

8. всасывание тетрациклина зависимых генов или индуцируемый выражение

Предупреждение: Доксициклин может быть вредным. Пожалуйста, обратитесь к лист данным по безопасности.

Примечание: В зависимости от вида и продолжительности эксперимента, Доксициклин может поставляться в питьевой воде (шаг 8.1) или Чоу (шаг 8.2)

  1. Для краткосрочных экспериментов (< 10 дней) администрирование доксициклин через питьевую воду, используя следующий протокол.
    1. Растворяют 5 г сахарозы в 100 мл воды. Автоклав.
    2. Растворите 100 мг доксициклина гиклат в 5 мл раствора сахарозы (шаг 8.1.1) в 15 мл Конические трубки.
    3. С помощью 10-мл шприц, стерильные фильтр решение через фильтр 0.2 мкм. Добавьте в решение сахарозы, подготовленную на этапе 8.1.1.
    4. Поставка раствора сахарозы доксициклин качестве питьевой воды с помощью мыши. Проверьте ежедневно и заменить, когда решение становится мутным, указывающее бактериальных разрастание (заменить прозрачный раствор после трех дней позднее).
  2. Для долгосрочных экспериментов (> 10 дней) или эксперименты, чувствительных к метаболические изменения, используйте коммерческих доксициклин Чоу (например, доксициклин гиклат Чоу 0,625 г/кг) чтобы избежать обезвоживания и/или сахароза индуцированные изменения в печени лечение животных.

9. Подготовка мыши печени для анализа иммуноокрашивания

Предупреждение: Параформальдегида может быть вредным. Пожалуйста, обратитесь к лист данным по безопасности.

Примечание: Timepoint когда будут проанализированы мышей зависит от эксперимента. Рекомендуется для анализа тканей печени после не менее трех дней лечения доксициклин для обеспечения достаточной индукции трансген или индуцируемый выражения.

  1. Готовим 1 мл шприц с иглой 27 G с 1 мл 4% раствора параформальдегида (PFA).
  2. Усыпить мыши, соответствующий метод согласно утвержденным животных протокол.
    Примечание: Руководящие принципы для соответствующих методов эвтаназии может варьироваться в зависимости от учреждения.
  3. Тщательно с использованием рассечения ножницы и анатомический пинцет, откройте брюшной полости с средний лапаротомия подвергать печени. Переместите в тонком кишечнике право подвергать воротной вены и нижней полой вены (IVC).
  4. Вставьте иглу подготовленный шприц (см. шаг 9.1) в МКВ и вырезать воротной вены. Inject 1 мл PFA медленно в МКВ perfuse ткани печени и удалить auto люминесцентные красные кровяные клетки (желательно, если будет выполняться immunofluorescent окрашивание).
  5. Удаление печени. Прополощите в воде и передача на 5 – 10 мл 4% раствора PFA.
  6. Для парафиновых срезах исправить ткани для 36-48 ч. ткани готова для обезвоживания и встраивание парафина.
  7. Для замороженных секций, исправить ткани в 4% ПФА за 1 час.
    1. Для криозащиты передать раствор 10% сахарозы. Инкубируйте 60 мин.
    2. Переезд в 20% раствора сахарозы. Инкубируйте 60 мин.
    3. Переезд в 30% раствора сахарозы. Инкубировать 12 – 16 h. встроить в внедрение комплекса для замороженной секции и заморозить при температуре-20 ° C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективность трансфекции путем инъекции Вену гидродинамических хвост: Процент мышиных гепатоцитов, которые являются transfected эжекции путем однократной инъекции является переменной и зависит от нескольких параметров, таких как объем впрыска, время впрыска, количество введенного ДНК, а размер вводят конструкцию6, 22,23. Кроме того эффективность трансфекции обычно ниже в более ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Трансфекция гепатоцитов с гидродинамическим хвост инъекции Вену стал установленным метод с момента ее введения более чем 15 лет назад6. Введенный объем превышает сердечного выброса и перетекает из нижней полой вены в синусоид печени7, ведущих к трансфекции около 10-20%, в некоторых случаях до 40% гепатоцитов25,26. Предикторы успешных трансфекции являются от закачанного объема вводили время22<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Эта работа была поддержана Deutsche Krebshilfe, Германия (номер 111289 Грант для UE), Люсиль Паккард для здоровья детей (Эрнест и Амелия Галло наделены докторантура стипендий - CTSA номер гранта УЛ1 RR025744 для UE). Мы благодарим д-р Марк а. Кей для векторных конструкций и экспериментальной советы и д-р Жюльен Sage для мышей и экспериментальной поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher#SM1331DNA Ladder для электрофореза
Tissue-Tek O.C.T.Сакура4583встраивание криосекций
Biozym LE AgaroseBiozym840004
бромида этидияSigma-AldrichE7637-1G
D(+)-SaccharoseCarl Roth4621.1Для подслащивания доксициллинового раствора
Ampicillin Sodium SaltAppliChemA0839,0010Для отбора Amp-устойчивых клонов
LB Агар (Лурия/Миллер)Карл РотX969.1
Бульон LB (Лурия/Миллер)Карл РотX968.1
S.O.C. Среднийтермо Фишер15544034
сульфатом гентамицинаAppliChemA1492,0001Для селекции устойчивых к гентамицину клонов
Roti-Histofix 4 %Fa. РастворпараформальдегидаRoth P087.6
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mixinvitrogen/ThermoFisher11791-020содержит смесь ферментов LR-клоназы II и протеиназу K
DB3.1 Компетентные клеткиThermo Fisher11782-018
Stbl3 Химически компетентная E. coliThermo FisherC737303
NameCompany<strong>Номер в каталогеКомментарии
Ферменты рестрикции
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Наборы
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Для извлечения ДНК из геля
NucleoSpin Gel и PCR Clean UpMacherey & Nagel740609.10
NucleoBond PC20Macherey & Плазмидная экстракция Nagel 740571 (мини-преп)
NucleoBond PC500Macherey & Nagel740574Plasmid Extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo FisherF530S
NameCompany<strong>Номер в каталоге<>Комментарии
Материалы для экспериментов на мышах
Шприц Injekt F 1 млBraun9166017VДля внутрибрюшинного введения
Omnifix Luer 3 млBraun4616025VДля внутривенного введения
Sterican Canjula 24GBraun4657675
Sterican Canjula 27GBraun4657705
тамоксифенSigma-AldrichT5648-1GДля активации CreER
Кукурузное маслоSigma-AldrichC8267-500MLНоситель для инъекций тамоксифена
Doxycycline hyclatAppliChemA2951,0025Активация тетрациклин-зависимой экспрессии
Injekt 10 мл ШприцBraun4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831,826,001Для фильтрации доксициклина
NaCl 0,9%Braun3200905Носитель для внутривенных инъекций
Falcon Conical Tube 50млCorning Life Science352095
инфракрасная лампан/д н/дДля согревания хвоста мыши
IVISPerkin Elmer124262In vivo imaging system
NameCompany<strong>Каталожный номерКомментарии<
strong>Плазмиды для клонирования векторов-транспозонов спящей красавицы для HTVI.
pTCn/aВектор для конститутивной экспрессии генов, ссылка 15
pEN_TTmcsAddgene #25755Вектор входа для индуцируемой экспрессии генов, ссылка 19
pEN_TTGmiRc2Addgene #25753Входной вектор для индуцируемой экспрессии miR-шРНК с коэкспрессией GFP, ссылка 19
pEN_TTmiRc2Addgene #25752Входной вектор для индуцируемой экспрессии miR-шРНК без ко-экспрессии GFP, ссылка 19
pTC ApoE-TetAddgene #85578Экспрессионный вектор для индуцируемого гена или экспрессии miR-шРНК с промотором ApoE.HCR.hAAT, ссылка 11
pTC-CMV-TetAddgene #85577Вектор экспрессии индуцируемого гена или miR-шРНК с промотором ЦМВ, ссылка 11
strong

Ссылки

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159(2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236(2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029(2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50(2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894(2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936(2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79(2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023(2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Sleeping BeautyCreER

Похожие статьи