Методическая статья

При приеме внутрь люминесцентные, магнитные наночастицы для определения способности поглощения жидкости в насекомых

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56619

⸱

20 декабря 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Kent State University at Stark, 2Department of Mathematical Sciences, Clemson University, 3Liquid Crystal Institute, Kent State University, 4Brookhaven National Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Жидкости кормление насекомые имеют возможность приобретать мельчайшие количества жидкостей из пористых поверхностей. Этот протокол описывает метод для непосредственно определяют способность для насекомых глотать жидкостей из пористых поверхностей с использованием кормления решения с флуоресцентные, магнитные наночастицы.

Аннотация

Жидкости кормления насекомых глотать различные жидкости, которые присутствуют в окружающей среде, как бассейны, фильмы, или ограничивается мелкие поры. Исследования жидких приобретения требуют оценки mouthpart структуры и функции отношения; Однако исторически механизмов поглощения жидкости выводятся из наблюдений структурных архитектуры, иногда без сопровождения с экспериментальными данными. Здесь мы приводим новый метод для оценки способности поглощения жидкости с бабочек (Lepidoptera) и мух (Diptera), используя небольшое количество жидкости. Насекомых питаются с 20% раствор сахарозы, смешанного с флуоресцентные, магнитные наночастицы от фильтра документов размеров конкретных поры. Урожай (внутренняя структура, используемая для хранения жидкости) удаляется из насекомых и размещены на конфокального микроскопа. Магнит помахал посадки для определения присутствия наночастицы, которые указывают, если насекомые способны глотать жидкости. Эта методология используется выявить широко механизм кормления (капиллярность и жидких моста формирования), который потенциально распределяется между Lepidoptera и двукрылых, при кормлении из пористых поверхностей. Кроме того, этот метод может использоваться для исследования кормления механизмов среди различных жидкости кормления насекомых, включая важное значение передачи болезни и биомиметики и потенциально другие исследования, которые включают нано - или микро размера трубы где жидкого транспорт требует проверки.

Введение

Многие группы насекомых имеют ротовые органы (proboscises) адаптирована для кормления на жидкости, такие как нектар, гниение фрукты, sap потоков (например двукрылых1, Lepidoptera2, перепончатокрылые3), ксилема (4полужесткокрылые), слезы (Lepidoptera 5) и кровь (Phthiraptera6, Siphonaptera7, двукрылых7, Полужесткокрылые8, Lepidoptera9). Способность насекомых питаются жидкости имеет отношение к здоровья экосистемы (например , опыление10), болезнь передачи4,11, biodiversification2,12и исследования 13конвергентной эволюции. Несмотря на большое разнообразие источников продовольствия тема среди некоторых жидкости кормления насекомых — возможность приобрести небольшое количество жидкости, которые могут ограничиваться микро - или нано размера капель, жидких пленок или пористых поверхностей.

Учитывая широкое разнообразие жидкости кормления насекомых (более 20% всех видов животных14,15) и их способности прокормить на различных источников питания, понимание их кормления поведения и механизмов поглощения жидкости важное значение во многих областях. Насекомое mouthpart функциональность, например, сыграла определенную роль в развитии биомиметических технологии, например, microfluidic приборы, которые могут выполнять задачи, такие как приобретение небольшого количества жидкости, с использованием методов, аналогичных тем, которые работают 16насекомых. Основная проблема в изучении механизмов поглощения жидкости, однако, определение не только как насекомые питаются жидкости, но приобретения экспериментальных доказательств того, что поддерживает механизм. Исключительно с помощью поведения (например, зондирование с Хоботок12,17) как индикатор для кормления недостаточно, потому что это не подтверждение успешного поглощения жидкости, и не предоставляет средства для определения маршрута, жидкости поездки, как они проходят через насекомых. Кроме того проведения экспериментов с небольшим количеством жидкости лучше представляет естественный кормления сценарии, где жидкости являются ограничения ресурсов2,12.

Рентген фазы контраст изображения была использована с бабочка монарх (Данай Плексипп L.) для оценки как бабочки питаются небольшое количество жидкости из пористых поверхностей12. Бабочки Монарх использовать капиллярность через пробелы между кутикулярного прогнозы (спинной legulae) вдоль Хоботок довести жидкости ограничивается мелкие поры в пищевой канал. Входящие жидкости образуют пленку на стене канала продовольственной, которая растет и падает в жидком мост на плато нестабильности12,18, который затем транспортируется в кишечнике бабочка действий всасывания насоса в голову. Хотя этап контраст рентгенография является оптимальный инструмент для визуализации потока жидкости внутри насекомых12,19,20,21, технология не является легкодоступной и более удобным метод необходим для быстрой оценки насекомого способность поглощения жидкости и глотать их.

Чтобы определить, если питание механизм для D. Северной относится к другим Lepidoptera и также мух (Diptera) (обе группы питаются жидкости из пористых поверхностей), Леннерт и др. 13 применяется техника для оценки способности насекомых кормить на небольшое количество жидкости из пористых поверхностей, который сообщается здесь подробно. Хотя протокол, изложенные здесь для исследований, которые используют смачивается и пористых поверхностей, методологии могут быть изменены для других исследованиях, например касающиеся кормления бассейн механизмов. Кроме того приложения распространяется на другие поля, включая микрофлюидика и bioinspired технологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. насекомых видов, подготовку решений и кормления станции настройки

Примечание: капустницы (Pieris rapae л, белянок) выбираются в качестве видов чешуекрылых представитель потому, что они были использованы в предыдущих исследованиях способности поглощения жидкости и mouthpart морфология22,23. Потому что они часто наблюдаются кормления на пористых поверхностях13используются дома мух (Муха domestica L., настоящие мухи) и синей бутылкой мух (Красноголовая синяя vomitoria л, Каллифориды).

  1. P. Крыма порядок как личинки насекомых поставщика и задние их на искусственные диеты (см. Таблицу материалы) до тех пор, пока они окукливаются и возникают как взрослых в камеру окружающей среды 23 ° C и 18 Л: 6 d фотопериода. Порядок М. domestica и C. vomitoria как куколок и задние их на тех же условиях окружающей среды, как P. Крыма. Не кормить взрослых бабочек и мух, после того, как они выходят из куколок до кормления экспериментов.
  2. Подготовка 20% раствора сахарозы (контроль) и 20% сахарозы наночастиц решение для тестирования для поглощения жидкости. Приготовляют раствор наночастиц, добавив флуоресцентные магнитные наночастицы (оксид железа с полиакриловой кислоты покрытием, около 20 Нм в диаметре)24 -20% раствора сахарозы (1 мг/мл dH2O наночастиц с 20%-ая сахароза решение 1:1). Подготовить раствор 1 x-фосфатный буфер (PBS) (10 x разбавляют до 1 x в dH2O, рН 7,4), который используется для вскрытия.
  3. Питание станции, которая состоит из ручного манипулятора с зажимом и отдельный этап питания (платформа) (рис. 1). Место вогнутой слайд на стадии подачи и нейлон чистые фильтры диаметром пор размер 11, 20, 30, 41 или 60 мкм и мембранные фильтры с размер поры диаметром 1, 5, 8 или 10 мкм для кормления экспериментов поблизости.

2. питание протокол

  1. Обертывание тела, ноги и Крылья насекомых в сложенный папиросной бумаги. Положение насекомых, так что только головы и ротовые органы подвергаются. Место Крылья насекомых между двумя слайдами в Микроскоп, которые проводятся вместе зажим на манипуляторе так, что насекомое подвешенный над кормления стадии (рис. 1).
  2. Применять капли 30 мкл раствора сахарозы 20% или 20% раствор сахарозы наночастиц с микропипеткой в центре вогнутой слайда. Место одного фильтра бумаги конкретных поры на вогнутой слайд, так что центр фильтровальная бумага выровнена капли раствора наночастиц. Контакт между капли и фильтровальную бумагу приводит решение распространяется вдоль фильтровальной бумаги, заполняя поры (рис. 1).
    Примечание: Фильтровальная бумага помещен na górze капли, а не другой путь вокруг, чтобы свести к минимуму возможное присутствие наночастиц на вершине фильтровальной бумаги, где кормить насекомых.
  3. Положение насекомое с манипулятором, так что только дистальной регионах ротовые можно связаться увлажненный фильтровальная бумага на стадии подачи (рис. 1). Использовать насекомых ПИН-код для расширения ротовые на фильтровальную бумагу и позволить насекомое кормить 45 s.
  4. Чтобы свести к минимуму вероятность насекомые, питающиеся жидких пленок, которые могут присутствовать на поверхности бумаги фильтра, положение ротовые так, что они находятся в контакте с частью фильтровальной бумаги, которая соприкасается равнинная часть слайда (т.е. не непосредственно над вогнутой части слайда). Если насекомое не выразить интерес в кормлении, ротовые могут проводиться на бумаге фильтр с насекомых pin для продолжительности время кормления.

3. вскрытия

  1. Поместите решение PBS в 50 мм стекла смотреть, так что есть достаточно решение для покрытия тела насекомых. Поместите часы стекло под Стереоскоп и позиции насекомых, рассекает оборудование (Весна микро рассекает ножницы, насекомое булавки, тонкой точке рассекает щипцы) рядом с стереоскоп.
  2. После кормления, удалите насекомых из папиросной бумаги и держать его с крыльями, закрыт. Удалить голову, ноги и Крылья насекомых с весны микро рассечения ножницы и насекомых в PBS раствор в часы стекло (рис. 2).
  3. При необходимости, анестезировать насекомых до вскрытия. Используйте корнцанг держать насекомых кутикулы вблизи дистальной области живота. С доминирующей рукой используйте микро весной, рассекает ножницы для резки кутикулы в передней направлении вдоль боковой стороны живота, начиная с заднего конца, пока не будет достигнуто грудной клетки. Особая осторожность чтобы вырезать только кутикулы и что желудочно-кишечного тракта внутри насекомое не поврежден (рис. 2).
  4. Сделайте дополнительные разрезы кутикулы с рассечения ножницы, чтобы открыть живота выявить желудочно-кишечного тракта внутри (рис. 2). Удаление брюшной кутикулы, жир тела и другие структуры с помощью насекомых булавки и передислоцировать их вне часы стекло для последующей утилизации, оставляя только грудной клетки и желудочно-кишечного тракта в часы стекло.
    Примечание: Вскрытие покажет урожая, который является sac как структура (расширение желудочно-кишечного тракта), расположенный вблизи стыке грудной клетки и живота.
  5. Если урожай не подвергается, сделайте дополнительные разрезы в грудной клетки с ножницами до тех пор, пока урожай раскрывается. После того, как урожай является видимым, Отрежьте оставшиеся части насекомых, оставив только желудочно-кишечного тракта с урожая в часы стекло (рис. 2).
    Примечание: Спаривающиеся культур является почти прозрачной и целлофан как в характера, которые могут быть трудно распознать, если это не заполнены с жидкостями и расширена или если это обрезается в ходе вскрытия.
  6. Используйте тонкой точке рассекает щипцы культур на coverslip (24 x 24 мм) для последующей обработки изображений (рис. 2).

4. Определение попадает наночастиц

  1. Позиция, урожай на coverslip с использованием рассечения щипцы тонкой точке уход для предотвращения разрыва урожая. Используйте на Перевернутый Конфокальный микроскоп для изображений при 20-кратном CY3 канал (или фазового контраста). Изображение урожая сразу после вскрытия, чтобы предотвратить его от высыхания.
  2. Держите сенсацию магнитный бар (41,3 мм в длину и 8 мм в диаметре) в руке, которая находится вне контроля операционных Этап микроскопа.
Волны магнитные перемешать бар взад и вперед вблизи сельскохозяйственных культур (приблизительно 10 мм расстояние от урожая), так что каждый взад и вперед движения занимает примерно одну секунду (рис. 2).
  • В то время как бар магнитные перемешать махнул, осмотрите урожая на наночастиц. Медленно перемещайте стадии эксплуатации взад и вперед, глядя через окуляр объектив микроскопа для наночастиц движения внутри почти прозрачной урожая. Если наночастиц присутствуют в урожае, указывающее позитивные кормление, они будут отвечать и волны в унисон с магнитным перемешать бар (рис. 2).

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Изучение шаблонов в жидкость поглощение способности среди жидкости кормления насекомых требует определения когда кормления происходит. Для проверки ограничения гипотезы размер порового среди бабочек и двукрылых13используется протокол, изложенные здесь. Ограничивающие поры размер гипотеза утверждает, что жидкость кормления насекомых не могут прокормить из заполненных жидкостью поры, если диаметр размер поры меньше, чем диаметр питающего трубопроводов

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Насекомое mouthpart функциональность исторически выводится из исследований валового морфологии (например., спаривающиеся Хоботок функции, относящиеся к выпивая сторновки25,26); Однако недавние исследования, которые включают экспериментальные свидетельства привели к парадигмы в нашем понимании сложности насекомых ротовые органы и структуры функция отношения2,12,13

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Благодарности

    Эта работа была поддержана Национальный фонд науки (NSF) Грант нет. IOS 1354956. Мы благодарим д-р Эндрю D. Уоррен (McGuire центр Lepidoptera и биоразнообразия, Флорида музей естественной истории, Университет штата Флорида) для получения разрешения на использование изображений бабочка.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    20% раствор сахарозыDomino SugarСахар необходим для получения раствора сахарозы с dH2O
    Фосфат буферизованный физиологическим раствором (PBS)Sigma-AldrichP549310X концентрация, разбавленная до 1X в dH2O для вскрытия насекомых
    Предметное стекло с одиночным углублением вогнутое стеклоAmScopeBS-C6необходимо для установки
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeNY6004700 (60&микро; m)Фильтры из нейлоновой сетки и изопорные фильтры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeNY4104700 (41 µ m)Фильтры из нейлоновой сетки и изопорные фильтры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeNY3004700 (30 &; m)Фильтры из нейлоновой сетки и изопорные фильтры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeNY2004700 (20 & микро; m)Фильтры из нейлоновой сетки и фильтры изопоры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeNY1104700 (11 &; m)Фильтры из нейлоновой сетки и изопорные фильтры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeTCTP04700 (10 & микро; m)Фильтры из нейлоновой сетки и изопорные фильтры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeTETP04700 (8 & микро; m)Фильтры из нейлоновой сетки и изопорные фильтры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeTMTP04700 (5 & микро; m)Фильтры из нейлоновой сетки и фильтры изопоры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Фильтровальная бумагаEMD MilliporeRTTP04700 (1 & микро; m)Фильтры из нейлоновой сетки и изопорные фильтры, необходимые для создания пористой поверхности для кормления насекомых
    Ножницы для микродиссекции ирисовCarolina Biological Supply Company623555Ножницы, используемые для вскрытия
    Булавки для насекомыхBioquip Products1208B1Булавки, используемые во время вскрытия и испытаний кормления
    Сверхтонкие тонконаправленные препарирующие щипцыCarolina Biological Supply Company624684Препарирующее оборудование
    Leica M205 C СтереоскопLeica MicrosystemsM205 CСтереоскоп для вскрытия
    Инвертированный конфокальный микроскопOlympusIX81Флуоресцентный микроскоп для обнаружения магнитных наночастиц
    Fisherbrand PTFE Одноразовый мешалкаFisherscientificS68067Магнит для обнаружения наночастиц
    Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34155Салфетки, используемые для защиты насекомых во время испытаний
    Куколки домашней мухи (Musca domestica)Mantisplace.comнасекомых для экспериментов
    Куколки голубой бутылочной мухи (Calliphora vomitoria)Mantisplace.comнасекомых для экспериментов
    Личинки капустной бабочки (Pieris rapae)Carolina Biological Supply Company144102насекомые для экспериментов
    Finnpipette F1 ThermoFisher Scientific4641080Nмикропипетка для дозирования жидкостей
    Наконечники для пипеток Finntip 250ThermoFisher Scientific9400250наконечники для микропипеток
    Предметные стекла для микроскопа Стеклянные накладки (=покровные стекла) (24 x 24 мм)AmScopeCS-S24-100покровные стекла для просмотра урожая насекомых на конфокальном микроскопе
    ступени подачи кормления наконечники для микропипеток

    Ссылки

    1. Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
    2. Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
    3. Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
    4. Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
    5. Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
    6. Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
    7. Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
    8. Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
    9. Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
    10. Barth, F. G. Insects and flowers: the biology of a partnership. , Princeton University Press. Princeton. (1991).
    11. Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
    12. Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
    13. Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
    14. Grimaldi, D., Engel, M. S. Evolution of the insects. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).
    15. Adler, P. H., Foottit, R. G. Insect biodiversity: science and society. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).
    16. Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
    17. Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
    18. Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).
    19. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6(2007).
    20. Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
    21. Lee, W. -K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2(2009).
    22. Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
    23. Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
    24. Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032(2014).
    25. Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
    26. Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
    27. Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
    28. Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Похожие статьи