Методическая статья

Применение измерений электрофизиологии для изучения деятельности перевозчиков электро нейтральный

DOI:

10.3791/56630

⸱

3 февраля 2018 г.

 ,  , 
1Physiology and Pharmacology Department, Des Moines University, 2School of Liberal Arts and Sciences, Mercy College of Health Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает приложений Протон селективного электрода и патч зажима методы для измерения активности Протон транспортных систем. Эти методы преодолеть некоторые ограничения методов, обычно используется для изучения Протон транспортной деятельности, например умеренной чувствительности, разрешение времени и недостаточно внутриклеточной среды управления.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транспорт ионов через клеточные мембраны обеспечивает точное управление содержанием ионов внутри и вне клетки, что является необходимым условием для выживания клетки. Эти механизмы транспорта опосредованной деятельностью специализированных транспортер белков. В частности, динамика рН тонко контролируется плазматической мембраны Протон (H+) экструзионных систем, например Na+/час+ теплообменником (NHE) белка семьи. Несмотря на активные усилия для изучения механизмов лежащие в основе регулирования NHE нашего нынешнего понимания биофизических и молекулярных свойств NHE семьи недостаточно из-за ограниченности методов эффективной оценки деятельности NHE . В этой рукописи, мы использовали H+-селективный электроды во время поклеточного патч зажимной запись для измерения потока H NHE-индуцированной+ . Мы предложили, что этот подход для преодоления некоторых ограничений обычно используются методы для измерения активности NHE, например поглощение радиоактивных и флуоресцентные мембраны permeants. Измерение активности NHE, с помощью метода описаны обеспечивает высокую чувствительность и разрешение по времени и более эффективного контроля над внутриклеточной концентрации H+ . H+-селективного электрода, основывается на том, что перевозчик деятельность создает ионный градиент в непосредственной близости к клеточной мембраны. H+-селективный электрод до перемещения и подальше от клеточной мембраны в повторяющихся, колебательные моды записывает разница напряжения, что зависит от потока H+ . Хотя H+-селективный электроды используются для обнаружения потока H+ , перемещение из клетки, метод зажима патч в целом ячейки конфигурации используется для управления состав внутриклеточных ионов. Кроме того применение техники зажим гигантских патч позволяет изменения внутриклеточной состава не только ионы, но и липиды. Транспортер активность NHE изоформы 3 (NHE3) был измерен используя этот технический подход для изучения молекулярных основе NHE3 регулирования фосфоинозитидов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транспорт ионов и растворенных веществ через мембраны плазмы имеет важное значение для выживания клеток и, следовательно, организмов1. Селективный транспорт ионов и растворенных веществ достигается массив специализированных каналов и транспортер белков. Мутации в эти белки часто приводят в различных клинических условий, предоставление канала и транспортер белки потенциальных целей для медикаментозное лечение1. К сожалению понимания механизмов, лежащих в основе функции канала и транспортер и регулирование часто ограничивается подходы, доступные для изучения их деятельности по2,3,4.

В частности, транспортеры примерно югу делятся на две большие группы, в зависимости от того, ли они изменяют трансмембранный потенциал клеток во время транспортировки растворенных веществ: изменения electrogenic ионных транспортеров [например, -фосфат натрия Совместное транспортер 2a (NaPi2a), обменный натрий кальций (NCX), и т.д.] или не изменяя Электронейтральная ионных транспортеров [например, обменный натрий Протон (NHE), хлоридно Сопредседатель транспортер, NaPi2c, и др.]. Деятельность обоих классов перевозчиков были изучены широко используя поглощение радиоактивных изотопов и Краски люминесцентные, флуоресцентные мембраны permeant2. Оба подхода оценить деятельность перевозчиков путем измерения изменения в массовой концентрации ионов конкретных цитоплазмы, и оба метода имеют ограничения, например умеренной чувствительности и времени резолюции и недостаточный контроль над внутриклеточной окружение. Действительно деятельность многих перевозчиков зависит цитоплазматическая концентрация ионов осуществляется (например, NHE3, NCX), и ожидается, что изменения в концентрации этих ионов играть значительную роль в регулировании деятельности перевозчик2 , 3 , 5. точное измерение этих регулирующих механизмов ограничена с использованием классических методов.

Чтобы преодолеть эти ограничения, патч зажим методы используются для изучения транспортер активность2,6. В частности самовызываемого ионоселективные электроды (МОСЭ)7,8 в сочетании с патч, зажимные системы недавно позволила измерения Электронейтральная транспортер деятельности3,4 , 5. ISEs, основывается на том, что перевозчик деятельность создает ионный градиент в непосредственной близости к клеточной мембраны. Ино, двигаясь вверх и от клеточной мембраны в повторяющихся, колебательные моды записывает разница напряжения (МКВ). Напряжения различия могут быть преобразованы в ионный поток значения с помощью метода калибровки, который применяет первый закон Фика диффузии2,9. Хотя ISEs используются для обнаружения потока ионов, движущихся из клеток, метод зажима патч в обоих поклеточного или наизнанку конфигурации используется для контроля потенциальных и внутриклеточных ионного состава мембраны. Кроме того применение метода зажим гигантских патч позволяет изменения внутриклеточной состава не только ионы, но и липидов и белков в3,5.

Таким образом универсальность метода зажим патч по сравнению с что других методов для изучения деятельности транспортер сделал патч зажима подходит для преодоления общих ограничений этих других методов. Комбинация ссылающиеся сами на себя ISEs и методы зажим патч предлагает уникальную возможность для измерения активности Электронейтральная транспортеров в жестко контролируемой среде экспериментальной и обнаружить роман биофизических и молекулярной свойства клеточной мембраны транспорт3,4,5. Этот подход успешно использовался для изучения деятельности NHE. У млекопитающих NHE белка семьи катализирует Электронейтральная чистого обмена внеклеточного натрия (Na+) для внутриклеточного Протон (H+)10,11 используя уклоном внутрь Na+ . В млекопитающих NHE белка семьи включает в себя 11 родственных белков (NHE1-9 и NHA1-2) и спермы конкретных NHE10,12,13.

NHEs (семейство SLC9a) встречаются повсеместно в большинстве живых организмов от простых прокариот для высших эукариот и участвуют в различных жизненно важных клеток функции10,11, включая управление защиты клетки солености в прокариот, поддержания кислотно щелочного гомеостаза и клетки объем и регулирование поглощения воды и соли в различных специализированных эпителия10,12,14,15. Биологическая роль NHEs и значение их функции были определены через несколько исследований; Однако несколько исследований изучили биофизических и молекулярные свойства млекопитающих NHEs из-за методологических недостатков4. Недавно применение ссылающиеся сами на ISEs во время пережатия поклеточного патч выявил новые молекулярные механизмы NHE изоформ регулируется изменения внутриклеточной концентрации ионов, белков и фосфолипидов в3, 4.

В частности, протокол в этой рукописи излагаются методы и подходы для изучения деятельности и регулирования NHE изоформы 3 (NHE3), одним из основных игроков в поглощении Na+, Cl–, HCO3– и жидкости в кисть границы мембрана почек и кишечного эпителия14,16. Новое понимание различия в чувствительности NHE3 активность внутриклеточных фосфоинозитидов (phosphatidylinositide 4,5-Бисфосфат [PI (4,5) P2] и phosphatidylinositide 3,4,5-трифосфата [PI(3,4,5]P3]) сообщается. Клетки транспортных белков, таких как каналы и перевозчиков, регулируются фосфоинозитидов17, и NHE3 прямо связывает PI (4,5) P2 и P3 PI (3,4,5)18. Основываясь на существующей литературы, либо phosphoinositide может быть соответствующие физиологические или патофизиологические регулирования NHE35,18,19. Наши выводы поддерживают отдельные роли для PI (4,5) P2 и P3 PI (3,4,5) в регулирование деятельности NHE3. Это различие стало возможным благодаря применение методов ISE в сочетании с поклеточного патч зажим записи. Этот метод также позволяет контроль клеточного содержания phosphoinositide через внутриклеточные перфузии различных фосфоинозитидов во время измерения NHE3 деятельности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Для записи активности Электронейтральная транспортеров, ссылающейся на себя ISE в сочетании с патч, зажим, зажим усилителя патч для поддержания клеток в целом ячейки конфигурации и высокой impendence усилителя (требуются два усилителя электрометр) для записи активности транспортер через ISE (см. таблицу материалы). Патч зажим усилителя непосредственно подключен к плате приобретение терминала. Электрометр подключен к дифференциальный усилитель, используемых для фильтрации и усилить сигнал. Дифференциальный усилитель подключен к плате приобретение терминала. Capmeter, патч зажим программное обеспечение, которое отслеживает соты, использовалась в предыдущих исследований20 (см. таблицу материалы). Запись камеры и перфузии решения поддерживаются на 37 ° C.

1. Подготовка пипетки ISEs

  1. Вытяните пипетки из боросиликатного стекла капилляров к наружным диаметром 1,2 мм (см. Таблицу материалы) с помощью пипетки съемник2 .
  2. Польский пипетки, используя microforge. Диаметр кончика пипетки должно быть 2-3 мкм.
  3. Место пипетки в банку держатель для пипеток с кончиком пипетки, вверх (см. Таблицу материалы).
    Предупреждение: Выполните действия 1.4-1.6 в хорошо проветриваемом химических зонта.
  4. Смесь siliconization смесь, которая состоит из 1 капля (~ 150 мкл) бис-(диметиламино) диметил силана и 10 капель тетрахлорметана (см. Таблицу материалы).
  5. Залить siliconization смесь в банки и плотно закрыть крышку.
  6. Инкубируйте банку с siliconization смесь для 24-48 ч в химической зонта при комнатной температуре до тех пор, пока смесь полностью испарилась.
  7. Засыпки пипетку с соответствующим ионоселективные смолы для создания столбца примерно 2-4 мм.
    Примечание: Водорода ionophore я коктейль B может быть мелкосемянная записи NHE деятельности (см. Таблицу материалы).
  8. Нажмите кончиком пипетки распространить ионоселективного смолы до кончика и место пипеткой по вертикали в держателе банку с кончиком пипетки вниз.
  9. Checkunder рассечения микроскопа, что смола коктейль достиг конца кончика. При необходимости, приложите положительным давлением, чтобы подтолкнуть смолы до конца.
  10. Засыпки половину дозатор с соответствующим решением (~ 100 мкл). Здесь, использовать 100 мм KCl и 10 мм HEPES при pH 7.0, если используется ionophore я б коктейль.
  11. Подключите к электрометр ISE и поместите кончик ISE в раствор для ванн используется для записи. Нулевой электрометр.
  12. Тест+H-Селективное реагирование ISE, изменив рН раствора ванна. Средняя H+-селективный ISE ответ ~ 58 МВ на единицу рН.
  13. Периодически оцените ISE ответ для калибровки.

2. Подготовка локальной фиксации пипетки для записи

Примечание: Рекомендуется метод, описанный Donald Hilgemann в своей статье одноканальной записи21 .

  1. Вытяните пипетки для гигантских патч из боросиликатного стекла капилляров (2.0 mmOD / 1,5 мм ID) пипетки съемник2,22,23.
  2. Использование microforge монтируется на сцене инвертированным микроскопом сделать широкий пипеткой подсказка (10-22 мкм)23. Расплава шарик (~ 0,5 мл) мягкой стекла на толстый провод платины microforge.
    Примечание: Требуется сравнительно толстый провод платины (~0.5 мм) для изготовления гигантских патч пипетки.
  3. Установите патч пипеткой недалеко от мягкой штапика и полное нагревать до тех пор, пока Совет начинает отступать. Провод платины будет слегка двигаться к centerduring Отопление.
  4. Выключите тепла и вставьте наконечник пипетки в размягченное стеклянная бусина. Охлаждения провод будет убираться и разорвать наконечник пипетки.
  5. Повторное применение тепла для гладких наконечник пипетки и создать наконечник пипетки нужного диаметра. Диаметр кончика зависит размер ячейки быть пропатчен (8-10 мкм в этом исследовании).

3. Подготовка клеток

  1. Разминка Натрий-фосфатный буфер (PBS) без Ca2 + и Mg2 +, раствор трипсина ЭДТА и среднего роста до 37 ° c.
  2. Вымойте клетки дважды с PBS. Использование 1 мл буфера для 35 мм диаметр клетки культуры плиты.
  3. Добавьте 0,5 мл трипсина в клетки для 35 мм диаметр клетки культуры пластины.
    Примечание: Когда клетки начинают облавы, встряхнуть пластину де прикрепить клетки.
  4. Остановите действие трипсина, добавив 5 мл (сумма для 35 мм диаметр клетки культуры плиты) полный рост средних дополнена плода бычьим сывороточным 10%.
    Примечание: Время реакции в трипсин является тип ячейки зависит от.
  5. Место клетки в шейкере с качалки для предотвращения образования сгустков.
  6. Использование ячейки для до 2 ч после trypsinization.
    Примечание: Время может варьироваться в зависимости от линии клеток.

4. Подготовка системы перфузии интра дозатор

  1. Вырезать соответствующий размер трубки кварцевые (150 мкм ОД / 75 мкм ID) подготовить линии перфузии интра пипетки.
  2. Вставьте одну сторону кварцевых труб в 200 мкл наконечник пипетки. Приклейте кварцевых труб на кончик и сократить конце кончика с острым лезвием.
  3. Подключите к небольшой кусочек кремния трубки, которая будет служить резервуар для решения перфузии интра дозатор перфузии линии (кварц трубы приклеены к кончику).
  4. Подключите силиконовой трубки к шприцу для создания положительного давления.
  5. Вставка, свободный конец трубки кварцевые через трубки полиэтиленовые пипеткой держателя перфузии порт (см. Таблицу материалы).
  6. Оцените линии перфузии с пипеткой раствор.

5. Приготовление растворов

  1. Приготовляют раствор сильно буферизации пипетку для записи NHE (115 мм калия аспартата (KAsp), 1 мм EGTA, 0,5 мм MgCl2, 10 мм Mg-АТФ, 12,5 мм HEPES, трубы 12,5 мм, 12,5 мм MOPS и 12,5 мм МЧС, pH 6.0 скорректирована с аспарагиновой кислоты).
    Примечание: Подготовка запасов пипеткой раствор и фильтр. Добавьте мг-АТФ перед записью.
  2. Приготовляют раствор свежих Ванна каждый раз, когда (140 мм NaCl, 2 мм CaCl2, 2 мм MgCl2и 0,1 мм трис-HCl рН 8,2).

6. запись деятельности транспортер

  1. Сохранить запись камеры и все решения при 37 ° C, потому что транспортер деятельность зависит от температуры.
  2. Место клетки в записи камеру. Подождите, пока они падение на дно камеры, но не позволяйте им придают в палату.
  3. Выберите соответствующую ячейку. Измерьте диаметр ячейки с окуляр микрометр. Выберите ячейки с аналогичными диаметров.
    Примечание: Как правило, большая ячейка будет иметь более ячеистая поверхность и возможно более транспортеры выразил на своей плазматической мембраны, таким образом, также имея больше активности транспортер. Однако это не обязательно верно, как транспортер деятельность зависит от конкретных транспортер и тип ячейки под исследование.
  4. Смонтировать ионоселективного микроэлектродные пипетку для микроманипулятор, засыпки патч зажима пипетку с внутриклеточной решение, убедитесь, что решение достигает кончиком пипетки2.
    Примечание: Это может потребоваться несколько нежный краны для устранения пузыри в наконечник пипетки.
  5. Установите патч зажима пипетки на главный этап электрофизиологии, созданы2,,2223.
    Примечание: Важно держать голову сцену на около 45-градусный угол горизонтальной оси, как это гарантирует запись угол для пипетки, которая подходит для формирования высокой устойчивостью печати.
  6. Применять небольшое положительное давление (~ 5 см H2O) для патч пипетку, чтобы уменьшить вероятность блокирования кончик и поместить его в раствор для ванн.
  7. Остановите Перемещение пипетки зажим патч после того, как кончик пера находится близко к клетке.
  8. Облегчить положительным давлением, в то время как Пипетка затрагивает ячейки и применить небольшое отрицательное давление (~ 5 см H2O) для получения > 1000 MΩ (гига ом) печать на клеточную мембрану с патч Пипетка23.
  9. Установите патч пипетку с ячейкой в одной фокальной плоскости как ISE, и переместить патч пипетку с ячейкой в близости к ISE (~ 5-10 мкм)2,5 , но избежать, позволяя ячейку, чтобы связаться с ISE (Рисунок 1A).
  10. Заверить, что проведение потенциальных 0 mV.
  11. Разрыву печать с серии коротких всасывающий для получения поклеточного конфигурации.
  12. Переместите Исэ (или патч зажим пипеткой) медленно влево вправо или вверх вниз для записи активности транспортера (рис. 1B).
  13. Записи по крайней мере 5-8 пиков (Рисунок 1 c, от A до B).
  14. Применить квадратные волны возмущения во время записи для контроля качества печати и мембраны клетки емкости (рис. 1).
  15. Оценить поток H+ (figure-protocol-1) из разница в свободной концентрации H+ поверхности клетки и массовых раствор (ΔH+)
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    Примечание: figure-protocol-4 и figure-protocol-5 , H+ и буфера коэффициенты диффузии, соответственно, BT является концентрация общего буфера, KD является Константа диссоциации буфера, r — это ячейка, радиус, и figure-protocol-6 определяет изменение устойчивого состояния концентрации связанных H+ для небольшое изменение в свободный час+. H+ указывает бесплатно протона в растворе. В соответствии с предыдущими исследованиями, H+ потоков преобразуются в электрофизиологических поток единиц путем расчета текущей эквиваленты потоков (figure-protocol-7/faraday) в ПА,35].
  16. Нормализовать потока протонов на поверхности клетки, которые можно рассчитать размер ячейки или емкость мембраны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самовызываемого ISE во время записи зажим поклеточного патч был применен для изучения регулирование деятельности NHE3 фосфоинозитидов. PS120 фибробластоподобных клеток24, в котором отсутствует выражение эндогенного плазматической мембраны NHEs, были использованы. NHE3 одичал тип (NHE3-wt) или NHE3 мутантов, не связывают фосфоинозитидов [тирозин 501, аргинин 503 и лизин 505 были заменены аланина, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] стабильно были выражены в PS120 фибробла...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на важнейших функций транспортеров методы, доступные для изучения их деятельности являются неэффективными и неадекватными. Единственным ограничением является, что доступные методы измерения ионного движения опосредовано транспортер деятельности без учета колебания внутриклеточных ионного состава во время эксперимента4. Представленный метод обеспечивает точный контроль над внеклеточные и внутриклеточный ион композиций и предлагает мощный инструмент для изменения внутриклеточный ион, белков...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Fishback (Университет Де-Мойн, Де-Мойн, Айова, США) за его помощь в съемки и редактирования видео. PS120 фибробластоподобных клеток, стабильно выражения NHE3-wt или NHE3-YRK были любезно предоставлены д-р Марк Донович (университете Джонса Хопкинса Школа медицины, Балтимор, MD, США).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Усилитель патч-клещейМолекулярные устройства
Двухканальный дифференциальный электрометр (HiZ-223)Warner Instruments64-1650
(DP-301)Warner Instruments64-0044
на основе MatLabMatLab с наборомРекомендуется
программное обеспечение капметраСистема термостатирования ThermoClamp-1  AutoMate Scientific03-11-LLВстроенный нагреватель
Одноканальный регулятор температуры (TC-324C)Warner Instruments64-2400
Одноствольный стандартный трубка из боросиликатного стеклаWorld Precision Instruments1B120F-3   Используется для ионоселективных электродов
Баночка для хранения микропипетокWorld Precision InstrumentsE212
Бис(диметиламино)диметилсиланSigma-Aldrich14755-100ML
Четыреххлористый углеродSigma-Aldrich319961-500ML
Ионофор водорода I - коктейль BSigma-Aldrich95293
Тонкостенная боросиликатная трубка  Sutter InstrumentB200-156-15Используется для патч-зажима пипетки 
Мягкое стекло (Corning 8161 Patch Glass)Warner Instruments64-0815
Капиллярная трубка из диоксида кремния (150 мкм OD/75 мкм ID)Molex (Polymicro Technologies)106815-0018Используется для внутрипипеточной перфузионной системы
Хлорид калияSigma-AldrichP9333
Аспартат калия Sigma-AldrichA6558
EGTASigma-AldrichE3889
Хлорид магнияSigma-AldrichM4880
Mg-ATPSigma-AldrichA9187
HEPESSigma-AldrichH3375
ТРУБЫSigma-AldrichP6757
MOPSSigma-AldrichM1254
MESSigma-AldrichM3671
Хлорид кальцияSigma-AldrichC5670
TrisSigma-AldrichT1503
Соляная кислотаSigma-AldrichH1758
АпиразаSigma-AldrichA6535
Фосфатидилинозитол(4,5) Бисфосфат diC8Эшелон BiosciencesP-4508
Фосфатидилинозитол 3,4,5-трисфосфат diC8Echelon BiosciencesP-3908
Дифференциальный усилитель Программное обеспечение для патч-клещей инструментов для сбора данных

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
  2. Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
  3. Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
  4. Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
  5. Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
  6. Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
  7. Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
  8. Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243(2009).
  9. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
  10. Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
  11. Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
  12. Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
  13. Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
  14. Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
  15. Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
  16. Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
  17. Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19(2001).
  18. Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
  19. Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
  20. Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
  21. Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
  22. Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
  23. Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
  24. Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
  25. Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

whole cell patch clampNHE3H

Похожие статьи